雨生紅球藻生長階段分類研究

楊夢玉，崔世鋼，王永亮

（1.天津職業(yè)技術(shù)師范大學(xué)自動化與電氣工程學(xué)院，天津300222；2.天津職業(yè)技術(shù)師范大學(xué)天津市信息傳感與智能控制重點(diǎn)實驗室，天津300222）

蝦青素作為天然的抗氧化劑，具有極強(qiáng)的穿透力、跨膜穩(wěn)定性、超強(qiáng)吸收性、防紫外線輻射、抑制腫瘤等作用，廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、化妝品等領(lǐng)域[1-4]。雨生紅球藻是一種淡水單細(xì)胞綠藻，也是蝦青素最天然、最高效的生產(chǎn)商，與在水產(chǎn)加工工業(yè)的廢棄物和紅發(fā)夫酵母這2種途徑中獲取蝦青素相比，雨生紅球藻對蝦青素的積累速率較快且蝦青素含量較高，因此被譽(yù)為“天然蝦青素的濃縮品”[5-8]。采用“兩步法”培養(yǎng)雨生紅球藻時，其生長過程主要包括細(xì)胞增殖階段和蝦青素積累階段，處于細(xì)胞增殖階段中的細(xì)胞是游動的，大多數(shù)細(xì)胞呈現(xiàn)綠色，偶爾會有少數(shù)細(xì)胞因周圍惡劣環(huán)境的脅迫而呈血紅色[9-10]，細(xì)胞通過吸收周圍環(huán)境中的營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行二分裂及四分裂、增殖，提高細(xì)胞數(shù)量。在蝦青素積累階段，通過對光照、溫度等生長條件的改變，細(xì)胞壁增厚，細(xì)胞內(nèi)部因逐步進(jìn)行蝦青素的合成，大部分細(xì)胞呈紅色。將經(jīng)過2個階段培養(yǎng)后的藻液通過離心、提取等技術(shù)，可以獲取雨生紅球藻細(xì)胞中積累的蝦青素。劉偉等[11]通過建立雨生紅球藻的兩步培養(yǎng)法，即在2個生長階段中，改變溫度、光照、培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)等，提高了細(xì)胞增殖速率、蝦青素積累速率及蝦青素含量。陳家宇等[12]通過設(shè)置對比實驗，驗證了光照強(qiáng)度、NaNO3和NaCl濃度等因素對雨生紅球藻積累蝦青素的影響并提出最適宜藻細(xì)胞生長的環(huán)境參數(shù)值。上述文獻(xiàn)皆是通過對雨生紅球藻生長的環(huán)境條件進(jìn)行探究，以及對物理條件的改變來提高藻細(xì)胞的生物量與蝦青素積累量，并沒有采用算法對實驗后的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析及對2個階段的細(xì)胞進(jìn)行類別劃分。本文采用C4.5決策樹算法，在雨生紅球藻處于最佳生長環(huán)境的基礎(chǔ)上，對2個生長階段的細(xì)胞進(jìn)行觀察并對其劃分屬性進(jìn)行選擇，實現(xiàn)對2個生長階段的細(xì)胞進(jìn)行分類，為雨生紅球藻的培養(yǎng)和對蝦青素的研究提供有力的保障。

1 決策樹算法

1.1 決策樹

決策樹是一種常見的分類預(yù)測算法，基于樹的結(jié)構(gòu)來進(jìn)行決策、判定。決策樹可以通過給定的訓(xùn)練集學(xué)得一個模型，可以對未見示例進(jìn)行分類。一棵決策樹由1個根結(jié)點(diǎn)、若干個內(nèi)部結(jié)點(diǎn)和若干個葉結(jié)點(diǎn)組成[13-14]，根結(jié)點(diǎn)是包含數(shù)據(jù)集中的所有數(shù)據(jù)的集合；內(nèi)部結(jié)點(diǎn)是判斷條件；葉結(jié)點(diǎn)是最終的類別。決策樹結(jié)構(gòu)如圖1所示。

圖1 決策樹結(jié)構(gòu)

決策樹以訓(xùn)練集D與屬性集A作為輸入量，通過函數(shù)TreeGenerate（D，A）依次生成決策樹結(jié)點(diǎn)node、選擇最優(yōu)劃分屬性、構(gòu)建分支，最后輸出一棵泛化能力強(qiáng)的可以對未見示例進(jìn)行準(zhǔn)確分類的決策樹。決策樹生成框圖如圖2所示。

圖2 決策樹生成框圖

其中，輸入變量訓(xùn)練集D和屬性集A的計算式為

1.2 C4.5算法

C4.5算法常用來解決分類問題，模型通過對輸入變量訓(xùn)練集D和屬性集A的學(xué)習(xí)，找到一個從屬性值到所屬類型的映射關(guān)系，并且該映射關(guān)系可以用于對新的類型未知的實體進(jìn)行分類[15]。

對雨生紅球藻細(xì)胞進(jìn)行生長階段的分類是二分類問題，需要分別對離散屬性值和連續(xù)屬性值進(jìn)行處理，通過計算信息熵和信息增益率選擇最優(yōu)屬性，將細(xì)胞劃分為2個生長階段，用到的屬性集A為

式中：“細(xì)胞半徑”和“顏色”為離散值；“細(xì)胞個數(shù)”和“吸光度值”為連續(xù)值。

C4.5算法既可以處理離散的屬性值，也可以處理連續(xù)的屬性值。信息熵、信息增益、增益率的計算式為

式中，屬性a的固有值計算式為

信息熵是用來衡量樣本純度的指標(biāo)，式（4）表示當(dāng)前訓(xùn)練集D中第k類樣本所占比例為pk（k=1，2，…，|y|）的信息熵，信息熵的值越小，說明當(dāng)前訓(xùn)練集D的純度越高；信息增益是利用屬性a對樣本進(jìn)行劃分所獲得的，用信息增益來進(jìn)行決策樹劃分屬性的選擇，若屬性a有V個可能的取值{a1，a2，…，aV}，用a對樣本進(jìn)行劃分會產(chǎn)生V個分支結(jié)點(diǎn)，其中Dγ是指第γ個分支結(jié)點(diǎn)包含了D中所有在屬性a上取值為aγ的樣本，信息增益越大，表示用屬性a來劃分獲得的分類效果越好；C4.5決策樹算法用增益率來選擇最優(yōu)劃分屬性，IV（a）為屬性a的固有值，屬性a的可能取值數(shù)越多，V越大，固有值越大。C4.5決策樹算法從劃分屬性中找到Gain（D，a）高于均勻水平的屬性，然后從中挑選增益率最大的屬性，作為分類中的最優(yōu)分類屬性。

2 實驗與數(shù)據(jù)采集

實驗采用上海光語生物科技有限公司生產(chǎn)的雨生紅球藻藻液及BG-11培養(yǎng)基，經(jīng)多次細(xì)胞增殖培養(yǎng)后獲得較多藻液，分別用于細(xì)胞增殖階段培養(yǎng)和蝦青素積累階段培養(yǎng)，利用倒置顯微鏡、光柵分光光度計等儀器設(shè)備多次采集2個階段的細(xì)胞半徑、細(xì)胞個數(shù)、吸光度值、顏色數(shù)據(jù)，作為C4.5決策樹算法的數(shù)據(jù)集及劃分屬性來對模型進(jìn)行訓(xùn)練。

楊慧敏等[16-17]通過設(shè)置對照實驗，驗證了雨生紅球藻在BG-11培養(yǎng)基、24～26℃、NaHCO3添加濃度為1.0時，細(xì)胞生長速率較快，然后通過在培養(yǎng)基中添加植物生長調(diào)節(jié)劑來提高蝦青素的含量。相關(guān)文獻(xiàn)表明，通過對LED光源的設(shè)計，發(fā)現(xiàn)雨生紅球藻在增殖培養(yǎng)階段，光照強(qiáng)度與藻細(xì)胞半徑之間存在線性關(guān)系[18]；在細(xì)胞增殖階段培養(yǎng)過程中，通過更新培養(yǎng)基來保證雨生紅球藻生長環(huán)境中有充分的營養(yǎng)物質(zhì)，在保證了細(xì)胞活性的同時，也提高了藻細(xì)胞生物量[19]。在蝦青素積累階段，影響蝦青素產(chǎn)量的因素分別為NaCl濃度、光照強(qiáng)度、NaNO3濃度，且NaCl濃度對蝦青素產(chǎn)量的影響最大[20]。

2.1 實驗準(zhǔn)備

將購買的200 mL雨生紅球藻藻液進(jìn)行細(xì)胞增殖實驗與蝦青素積累實驗。通過前期設(shè)置對比實驗，分別探究適合雨生紅球藻進(jìn)行細(xì)胞增殖與蝦青素積累的最佳環(huán)境條件，以下實驗均在最佳環(huán)境條件及無菌環(huán)境下進(jìn)行，實驗步驟如下。

（1）準(zhǔn)備實驗器具。在開始實驗前準(zhǔn)備8個錐形瓶、1個廣口瓶、若干個膠頭滴管、移液槍、一次性手套、貼簽紙、酸堿指示劑、培養(yǎng)基、NaOH溶液、NaCl、檸檬酸溶液、純凈水、封口用的牛皮紙、皮筋、數(shù)碼秤。

（2）滅菌消毒。將所需的實驗器皿放入高溫高壓滅菌鍋（溫度為125℃）中進(jìn)行高溫高壓殺菌消毒，將消毒后的帶有水的實驗器皿放入電熱鼓風(fēng)干燥箱中干燥，干燥后取出實驗器皿并將其放入超凈工作臺，保證在無菌、試劑不受污染的環(huán)境下進(jìn)行實驗。

（3）配置培養(yǎng)基。經(jīng)計算共需要配置1 000 mL培養(yǎng)基，其中200 mL培養(yǎng)基中不添加NaNO3溶液，按照2 g/L的比例向培養(yǎng)基中添加NaCl，為方便實驗，先配置1 000 mL不添加NaNO3溶液的培養(yǎng)基。先向廣口瓶中加入1 000 mL的純凈水，按照純凈水∶溶液=1000 mL∶1 mL的比例向純凈水依次加入K2HPO4·3H2O、MgSO4·7H2O、CaCl2·2H2O、檸檬酸鐵銨、檸檬酸、EDTA、Na2CO3、A5+CO溶液，取出200 mL培養(yǎng)基待用，即完成用于蝦青素積累階段的培養(yǎng)基配置[21-22]；向剩余的800 mL培養(yǎng)基中加入NaNO3溶液，即完成用于細(xì)胞增殖階段的培養(yǎng)基配置，留于廣口瓶中待用。

（4）配置藻溶液。在超凈工作臺上將200 mL藻液平均分于2個錐形瓶中，每個錐形瓶各100 mL藻液，并按照藻液與BG-11培養(yǎng)基1∶1的比例分別向2個錐形瓶添加100 mL培養(yǎng)基，配置成200 mL藻溶液，將藻液放置于光照強(qiáng)度為20μmol·m-2·s-1、溫度為25℃的光生物反應(yīng)架上，進(jìn)行培養(yǎng)周期為8～9 d的細(xì)胞增殖實驗，將最開始的200 mL藻液擴(kuò)培到400 mL，同樣方法再將400 mL藻液擴(kuò)培到800 mL。

（5）生物反應(yīng)架。利用照度儀測量光生物反應(yīng)架中的LED光源的光照強(qiáng)度，分別根據(jù)藻液的擺放位置調(diào)整2個階段的光照強(qiáng)度，控制單一變量，保證實驗數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確度。光生物反應(yīng)架如圖3所示。

圖3 光生物反應(yīng)架

光生物反應(yīng)架主要由搖床、氣體混合分路器、氣缸、玻璃轉(zhuǎn)子流量計、LED光源等幾部分組成。光生物反應(yīng)架為雨生紅球藻提供正常發(fā)育所需的場所，將反應(yīng)架分為上、中、下三層，上面兩層用來進(jìn)行細(xì)胞增殖實驗，最下面一層是蝦青素積累階段的實驗場所，在培養(yǎng)過程中將光生物反應(yīng)架的外部用不透光的布遮住，避免外界環(huán)境中的自然光對實驗的影響。

2.2 數(shù)據(jù)采集

2個階段培養(yǎng)結(jié)束后，分別取少量藻液于培養(yǎng)皿或蓋玻片，用顯微鏡觀察細(xì)胞顏色，并檢測細(xì)胞半徑，用血球計數(shù)板記錄2個生長階段的細(xì)胞個數(shù)，再用光柵分光光度計檢測細(xì)胞的吸光度值，細(xì)胞生長階段圖如圖4所示。

圖4 細(xì)胞生長階段圖

多次檢測后分別記錄2個階段的細(xì)胞半徑、細(xì)胞個數(shù)、吸光度值、細(xì)胞顏色，采集的部分?jǐn)?shù)據(jù)如表1所示。

表1 采集的部分?jǐn)?shù)據(jù)

表1中，“細(xì)胞半徑”“細(xì)胞顏色”為離散屬性，“細(xì)胞個數(shù)”“吸光度值”為連續(xù)屬性，將細(xì)胞半徑記錄為3個等級，用離散值表示，“small”代表細(xì)胞半徑為1.0～5.0μm，“mid”代表細(xì)胞半徑為5.0～10.0μm，“big”代表細(xì)胞半徑為10.0～20.0μm；細(xì)胞個數(shù)和細(xì)胞的吸光度值用連續(xù)值表示；細(xì)胞顏色分為綠色和紅色，用離散值表示，當(dāng)細(xì)胞為綠色時用“true”表示，細(xì)胞為紅色時用“fslae”表示；細(xì)胞所處階段用“One”和“Two”表示，“One”表示處于細(xì)胞增殖階段，“Two”表示處于蝦青素積累階段。

3 模型分析

該數(shù)據(jù)集包含14個訓(xùn)練量本數(shù)據(jù)，假設(shè)細(xì)胞處于增殖階段（One）為正例，細(xì)胞處于蝦青素積累階段（Two）為反例，則14個樣本數(shù)據(jù)中正例占p1=10/14，反例占p2=4/14，因雨生紅球藻細(xì)胞處于細(xì)胞增殖階段（One）或蝦青素積累階段（Two），故|y|=2，根據(jù)式（4）可以計算出該決策樹根節(jié)點(diǎn)的信息熵

計算當(dāng)前屬性集合{細(xì)胞半徑，細(xì)胞個數(shù)，吸光度值，細(xì)胞顏色，細(xì)胞所處階段}，每個屬性的信息增益以屬性“細(xì)胞半徑”為例，該屬性有3個可能的取值，分別是{big，mid，small}，若使用“細(xì)胞半徑”這一屬性對訓(xùn)練集D進(jìn)行劃分，可以得到3個子集，分別記為D1（細(xì)胞大小=big），D2（細(xì)胞大小=mid），D3（細(xì)胞大小=small）。子集D1中包含編號為{1，2，3，4，5}的5個樣本，正例占2/5，反例占3/5；子集中包含編號為{6，7，8，9}的4個樣本，正例占p1=1，反例占p2=0；子集D3中包含編號為{10，11，12，13，14}的5個樣本，正例占p1=4/5，反例占p2=1/5。則可根據(jù)式（4）計算出用“細(xì)胞大小”作為劃分屬性，劃分之后得到3個分支節(jié)點(diǎn)的信息熵

以此類推，根據(jù)上述公式計算出“細(xì)胞顏色”屬性的信息增益值為0.006。但是，由于“細(xì)胞個數(shù)”“吸光度值”連續(xù)屬性的可取值不再是離散的，因此在C4.5決策樹算法中采用二分法對連續(xù)屬性值進(jìn)行處理。假設(shè)樣本D中的“吸光度值”為連續(xù)屬性a，將a中的屬性值按照由小到大的順序陳列，記為{a1，a2，…，an}，采用t作為劃分點(diǎn)，將D劃分為子集Dt-和子集Dt+，子集Dt-是由在屬性a上取值小于等于t的樣本組成的，而子集Dt+是由在屬性a上取值大于t的樣本組成的。對于2個相鄰的屬性值ai和ai+1來說，劃分點(diǎn)t在區(qū)間[ai，ai+1）上，取任意值所產(chǎn)生的劃分結(jié)果是相同的，將區(qū)間[ai，ai+1）的中位點(diǎn)（ai+ai+1）/2作為候選劃分點(diǎn)，隨后即可像離散值一樣來處理這些劃分點(diǎn)，通過選取最優(yōu)的劃分點(diǎn)來劃分樣本集合，因此對于連續(xù)屬性，需要計算包含n-1個元素的候選劃分點(diǎn)集合Ta

雨生紅球藻的生長過程分為細(xì)胞增殖階段和蝦青素積累階段，通過對2個階段細(xì)胞的觀察和數(shù)據(jù)采集，將表1中的14組實驗數(shù)據(jù)作為C4.5決策樹算法的訓(xùn)練集D，將“細(xì)胞半徑”“細(xì)胞個數(shù)”“吸光度值”“細(xì)胞顏色”作為屬性集A，將訓(xùn)練集D和屬性集A作為決策樹模型的輸入變量，通過PyCharm軟件建立決策樹模型，最后輸出的決策樹的決策結(jié)果如圖5所示。

圖5 雨生紅球藻生長階段分類結(jié)果

決策樹模型最后生成一棵深度為4、分支數(shù)為6的決策樹，其中屬性集A中的“細(xì)胞半徑”“細(xì)胞個數(shù)”“吸光度值”“細(xì)胞顏色”分別用符號“R”“N”“OD”“Color”表示，從圖5可知，細(xì)胞的“吸光度值”為決策樹的根節(jié)點(diǎn)，“細(xì)胞半徑”“細(xì)胞個數(shù)”“細(xì)胞顏色”作為決策樹的內(nèi)部結(jié)點(diǎn)，決策結(jié)果是對細(xì)胞所處生長階段進(jìn)行分類判斷，所以將細(xì)胞增殖階段和蝦青素積累階段作為葉節(jié)點(diǎn)。由于細(xì)胞“吸光度值”的信息增益在所有屬性值中最高，所以將其作為決策樹的根節(jié)點(diǎn)，即最優(yōu)劃分屬性，對應(yīng)的劃分點(diǎn)為2.55，當(dāng)細(xì)胞吸光度值＜2.55時進(jìn)入下一個內(nèi)部結(jié)點(diǎn)，即細(xì)胞半徑的判斷，當(dāng)細(xì)胞半徑屬于“mid”等級時，決策結(jié)果是細(xì)胞屬于增殖階段，當(dāng)細(xì)胞半徑屬于“big”等級時，需要對細(xì)胞顏色進(jìn)行判斷，當(dāng)細(xì)胞顏色為綠色，細(xì)胞屬于蝦青素積累階段；當(dāng)細(xì)胞顏色為紅色，細(xì)胞屬于細(xì)胞增殖階段；當(dāng)細(xì)胞半徑屬于“small”等級時，需要對細(xì)胞個數(shù)進(jìn)行判斷，當(dāng)細(xì)胞個數(shù)少于310.5×104個/mL時，細(xì)胞屬于增殖階段，否則屬于蝦青素積累階段；當(dāng)細(xì)胞吸光度值≥2.55時，細(xì)胞處于增殖階段。

該模型將雨生紅球藻細(xì)胞的實際數(shù)據(jù)作為輸入量，將14組數(shù)據(jù)作為訓(xùn)練集，對決策樹模型進(jìn)行訓(xùn)練，分別計算各個屬性的信息熵與信息增益來選擇最優(yōu)的劃分屬性，建立決策樹模型，最后通過C4.5決策樹模型對細(xì)胞相應(yīng)屬性值的判斷來確定細(xì)胞所處的生長階段。將實際數(shù)據(jù)與分類結(jié)果相對比，經(jīng)檢驗得到的分類結(jié)果準(zhǔn)確性較高，驗證結(jié)果的部分?jǐn)?shù)據(jù)如表2所示。

表2 部分驗證結(jié)果

4 結(jié)語

本文采用“兩步法”培養(yǎng)雨生紅球藻，通過對購買來的雨生紅球藻藻液進(jìn)行增殖培養(yǎng)實驗，提高細(xì)胞生物量，通過設(shè)置光照強(qiáng)度、溫度、培養(yǎng)基pH值對比實驗，探究最適宜雨生紅球藻生長的環(huán)境條件，得出以下結(jié)論：

（1）細(xì)胞增殖階段的最佳環(huán)境條件是采用BG-11培養(yǎng)基，在光照強(qiáng)度為20μmol·m-2·s-1、溫度為25℃、pH值為8.0的光生物反應(yīng)架上進(jìn)行周期為8～9 d的細(xì)胞增殖培養(yǎng)實驗，該條件下細(xì)胞生物量最大且細(xì)胞生長速率較快。

（2）蝦青素積累階段的最佳環(huán)境條件是在光照強(qiáng)度為240μmol·m-2·s-1、溫度為28℃、pH值為7.0、培養(yǎng)基為BG-11培養(yǎng)基（不添加NaNO3溶液），缺少N元素并按照2 g/L的比例向培養(yǎng)基中添加NaCl，并將藻液放置在光生物反應(yīng)架上進(jìn)行培養(yǎng)周期為8～9 d的蝦青素積累實驗，該條件下蝦青素含量最大且積累速率最快。

（3）在進(jìn)行屬性的選取和細(xì)胞數(shù)據(jù)的采集時，每天利用顯微鏡、光柵分光光度計等儀器設(shè)備測量并記錄雨生紅球藻細(xì)胞的數(shù)據(jù)值，包括細(xì)胞半徑、細(xì)胞個數(shù)、吸光度值、細(xì)胞顏色。建立C4.5決策樹模型，選取14組測量數(shù)據(jù)作為訓(xùn)練集，對決策樹模型進(jìn)行訓(xùn)練，最后可以生成一棵泛化能力較強(qiáng)的決策樹，用來對雨生紅球藻所處的2個生長階段進(jìn)行分類。

雨生紅球藻的生長周期較長，且不同生長階段所需的生長環(huán)境不同，藻細(xì)胞在每個階段中的細(xì)胞半徑、細(xì)胞個數(shù)、吸光度值、細(xì)胞顏色等呈現(xiàn)不同的特征，因此通過對細(xì)胞屬性的選擇和細(xì)胞數(shù)據(jù)值的采集，對細(xì)胞所處生長階段進(jìn)行分類，不僅可以區(qū)分藻液的2個生長階段，還為藻細(xì)胞后續(xù)研究提供強(qiáng)有力的保障。