痰標本結核分枝桿菌DNA檢測在結核病中的診斷價值

張文艷，陳珊

(1.鶴壁市傳染病醫(yī)院 檢驗科，河南 鶴壁 458000；2.鶴壁市人民醫(yī)院 檢驗科，河南 鶴壁 458000)

結核病是由結核分枝桿菌通過呼吸道、消化道或皮膚損傷侵入易感機體，導致組織器官出現(xiàn)滲出性、增殖性或干酪樣壞死性病變，臨床以肺組織、支氣管、氣管及胸膜受侵的肺結核最常見。我國是結核大國，每年死于肺結核的患者近百萬，居各種疾病死亡原因之首。早期診斷對結核病的治療與預防傳播具有重要意義。目前臨床上常用痰培養(yǎng)、痰涂片檢查，痰結核菌檢查雖仍是肺結核的診斷金標準，但需要耗時6～8周，臨床應用受到限制，因此，需要一種簡便快捷且陽性率高的檢查方法助力臨床上結核的早期診斷。本研究通過對2020年1月1日至2020年9月11日于鶴壁市傳染病醫(yī)院診治的95例肺結核患者的病歷資料進行回顧性分析，探討痰標本結核分枝桿菌DNA檢測在結核病中的診斷價值。

1 資料與方法

1.1 基本資料選取2020年1月1日至2020年 9月11日于鶴壁市傳染病醫(yī)院診治的95例肺結核患者的病歷資料進行回顧性分析，其中男53例，女42例，年齡14～69歲，平均(38.83±7.12)歲。根據(jù)患者的痰涂片檢查結果陽性、陰性將其分為初治涂陽組(46例)和初治涂陰組(49例)。另外選取47例經(jīng)檢驗確認無結核病的健康者作為對照組，其中男26例，女21例，年齡15～67歲，平均(38.61±7.52)歲。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審核批準。肺結核患者、對照組患者年齡、性別等一般情況比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

1.2 納入和排除標準(1)納入標準：①初治涂陽組與初治涂陰組通過改良羅氏培養(yǎng)法及痰液涂片的檢查并符合《WS 288-2017肺結核診斷中》[1]中關于肺結核的診斷標準；②對照組確診無結核?。虎刍颊呒凹覍賹ρ芯恐椴⒑炇鹬橥鈺?。(2)排除標準：①病歷資料缺失；②有惡性腫瘤、其他肺部疾病或其他傳染性疾??；③精神疾病或認知障礙；④處于妊娠期或哺乳期；⑤中途退出研究。

1.3 研究方法

1.3.1分組前診斷性檢驗 (1)痰結核菌培養(yǎng)。將痰液用同體積40 g·L-1氫氧化鈉處理0.5 h，取0.1 mL痰液接種至酸性羅氏培養(yǎng)基中，菌落生長后進行抗原檢測、涂片抗酸染色及生長試驗鑒定菌種，嚴格按照試劑盒說明書進行規(guī)范操作，培養(yǎng)8周后判讀結果，對照培養(yǎng)基生長良好，含藥培養(yǎng)基的菌落生長數(shù)多于20個即判定為耐藥。(2)痰涂片。將痰液標本直接涂布于載玻片上，固定之后進行染色，用顯微鏡觀察痰液中是否含有結核分枝桿菌。

1.3.2T細胞斑點試驗(T-SPOT.TB) 陰性為斑點數(shù)量0～5個；陽性為抗原A與抗原B檢測孔數(shù)量減去陰性孔數(shù)量≥6。

1.3.3結核分支桿菌DNA檢測 (1)痰液標本的采集。使用雙盲實驗法采集所有患者的痰液標本，采集痰樣本前用清水漱口，收集當天早中晚3次深處咳出痰液，裝于無菌痰杯中加蓋封閉送檢[2]。注意注明標簽，不要弄混。(2)聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)法[3]。選擇中山大學達安基因股份有限公司生產(chǎn)的結核分支桿菌DNA檢測試劑盒，嚴格按照說明書進行檢測操作。把同等劑量的40 g·L-1NaOH消化液和痰液標本放入無菌瓶內(nèi)搖勻后靜置30 min備用，取1 mL置于離心管中離心3 min(12 000 r·min-1)，棄去上清液，加入核酸提取液靜置10 min后置于DNA提取管內(nèi)，在DNA提取儀中離心3 min，取上清液2 μL置入PCR反應管，上機檢測。采用熒光檢測擴增，擴增操作按說明書規(guī)范進行，檢測及結果判斷嚴格按說明書進行，記錄擴增期間熒光強度，分析增長曲線，結合循環(huán)閾值計算結核桿菌DNA含量，若循環(huán)閾值<30且擴增曲線呈S形，說明結核分枝桿菌陽性[4-5]。

1.4 統(tǒng)計學方法采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計處理，陽性檢出率、敏感性等定性資料以頻數(shù)和百分比(%)表示，采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 結核分枝桿菌DNA檢測結果與T-SPOT.TB檢測結果初治涂陽組、初治涂陰組的熒光定量PCR法陽性檢出率均高于T-SPOT.TB法，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 3組患者熒光定量PCR法與T-SPOT.TB檢查結果比較(n，%)

2.2 初治涂陽組、初治涂陰組患者檢測結果的特異性、敏感性、陽性預測值、陰性預測值分析兩組熒光定量PCR檢測的特異性、敏感性、陽性預測值、陰性預測值均高于T-SPOT.TB法。見表2。

表2 兩組患者檢測結果特異性、敏感性、陽性預測值、陰性預測值分析(%)

3 討論

我國作為結核大國，對結核病及其病原體的研究不斷開展，臨床經(jīng)驗豐富，尤其是全國普及接種卡介苗后，結核病的發(fā)病率和病死率得到了控制，但仍遠遠高于其他傳染性疾病，尤其是因為缺少新型抗結核藥物、某些地區(qū)藥物的不規(guī)范使用導致肺結核病的耐藥性越發(fā)嚴重，在部分低收入地區(qū)及發(fā)展中國家結核病發(fā)病率仍呈增長趨勢[6-7]。如果得不到及時有效的治療會造成呼吸系統(tǒng)損傷，還會并發(fā)肺心病、肺癌等嚴重疾病，患者可能出現(xiàn)肺功能下降、免疫力低下、心肺功能不全等嚴重并發(fā)癥，不僅嚴重影響患者生活質(zhì)量及生命安全，因其傳染性較強，還會帶來公共衛(wèi)生安全隱患。目前臨床常用的痰結核菌培養(yǎng)法準確率較低、痰涂片抗酸染色法耗時過長，都存在一定的缺陷[8]。因此，需要探尋高準確度、高效率且能在臨床中廣泛普及的檢驗方法推動結核病的早期診斷，對結核病患者的規(guī)范治療和地區(qū)傳染病的預防控制具有重要意義。

本研究結果顯示，初治涂陽組、初治涂陰組的熒光定量PCR法陽性檢出率均高于T-SPOT.TB法，兩組應用熒光定量PCR的特異性、敏感性、陽性預測值、陰性預測值均高于使用T-SPOT.TB法。PCR熒光定量法是通過熒光染料進行特異性標記的探針，對PCR產(chǎn)物進行標記跟蹤的較新型的定量試驗技術，可以實時監(jiān)測目標反應過程，使用相應的軟件對產(chǎn)物進行分析，被廣泛應用于肝炎、結核病、艾滋病、禽流感等多種傳染性疾病的臨床診斷。熒光定量PCR法極大地簡化了目標定量檢測的過程，而且實現(xiàn)了絕對定量和自動化操作，可較準確地分析結核分枝桿菌DNA含量，精準度高、操作簡單、工作效率高且結果清晰，因此，應用于肺結核患者痰標本結核分枝桿菌DNA檢測中結果靈敏度和陽性檢出率均較高[9]。

綜上所述，使用熒光定量PCR法檢驗痰標本中的結核分枝桿菌DNA的陽性檢出率、陽性預測值、檢測敏感性及特異性都較高，可對疑似肺結核患者進行快速無創(chuàng)的早期診斷，提高了肺結核的臨床診斷效能和準確度，降低了肺結核誤診患者進一步傳播病原體的可能性，值得在臨床中廣泛應用。