磁共振R2＊mapping示蹤功能型納米藥物載體在NSCLC裸鼠模型的顯像研究＊

2.暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)影像中心(廣東 廣州 510630)

3.廣州市人民醫(yī)院放射科(廣東 廣州 510630)

高 鵬1 劉于寶1 劉灶松3 史長征2 羅良平2,*

目前，R2＊mapping技術(shù)已經(jīng)成為一種可靠又無創(chuàng)性評價(jià)活體組織內(nèi)鐵含量的有效工具，它可以敏感地檢測到體內(nèi)鐵含量變化所致的局部磁環(huán)境的改變。組織內(nèi)的鐵沉積產(chǎn)生的順磁效應(yīng)通過縮短T2＊，從而影響組織的R2＊，該技術(shù)在國外應(yīng)用已接近成熟。Kuhlpeter等[1]研究發(fā)現(xiàn)R2＊mapping技術(shù)具有更強(qiáng)的R2效應(yīng)，尤其是用于測量細(xì)胞內(nèi)少量鐵沉積時(shí)更加突出，這些發(fā)現(xiàn)得到了Bowen等[2]研究結(jié)果的支持。Wang等[3]應(yīng)用磁共振跟蹤和量化超順磁性氧化鐵(superparamgnetic iron oxide，SPIO)標(biāo)記的內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells，EPCs)在體外和體內(nèi)的歸巢的研究中發(fā)現(xiàn)，R2＊值與組織內(nèi)載鐵細(xì)胞數(shù)量呈線性相關(guān)。R2＊mapping具有較好的組織橫向弛豫率，雖然在探測不同形式的鐵方面特異性不強(qiáng)，但在探測生物組織內(nèi)鐵含量具有極高的敏感性[4]。此外，R2＊mapping技術(shù)不易受到MR設(shè)備和操作因素差異的影響[5]。

本研究選用F/A-PLGA@DOX/SPIO納米載藥體系為暨南大學(xué)生命技術(shù)科學(xué)院自主研發(fā)，已申請研究專利，首次應(yīng)用于腫瘤以及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究，該納米體是以高分子聚合物材料聚乳酸-羥基乙酸共聚物(poly lactic-co-glycolic acid,PLGA)為載體，裝載阿霉素(doxorubicin,DOX)以及SPIO，通過在PLGA表面修飾利用葉酸(folic acid，F(xiàn)A)和可活化細(xì)胞穿膜肽(activatable cell penetrating peptide，ACPP)作為雙重探針，制備出腫瘤微環(huán)境響應(yīng)和FR-受體介導(dǎo)的雙靶向納米體系。有關(guān)該納米體系的制備、細(xì)胞水平上生物活性研究及抗腫瘤活性等研究成果前期已進(jìn)行報(bào)道[6]。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物模型的制作雄性裸鼠24只，由暨南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[動(dòng)物許可證號：SYXK(粵)2017-0174]。A549細(xì)胞在恒定的條件下(37℃,5%CO2)培養(yǎng)，隔天更換培養(yǎng)基，待細(xì)胞貼壁生長穩(wěn)定后，PBS清洗后加入胰酶消化，重懸細(xì)胞懸液傳代培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至對數(shù)生長期，消化收集腫瘤細(xì)胞，用預(yù)冷PBS稀釋調(diào)整細(xì)胞密度為3×107個(gè)/mL，抽取0.2mL/只的量接種于4～5周齡的BALB/C裸鼠右后肢根部，常規(guī)無菌飼養(yǎng)，一周后即可成瘤，腫瘤橫徑約5～8mm。每天觀察裸鼠成瘤情況并記錄裸鼠體重及瘤體大小，至腫瘤塊長成試驗(yàn)所要求大小。

1.2 試驗(yàn)分組在非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)皮下移植瘤直徑約8～10mm，腫瘤均以實(shí)質(zhì)成分為主，未見明顯的囊變壞死區(qū)域。NSCLC裸鼠移植瘤模型24只，隨機(jī)分為G1、G2兩組，每組12只。每組進(jìn)行MR基態(tài)掃描，掃描結(jié)束后給藥。G1組給予單純SPIO(5mg/kg)；G2組給予F/A-PLGA@DOX/SPIO(5mg/kg)，所有藥造影均采用尾靜脈給藥。

1.3 MRI 檢查采用GE 1.5T超導(dǎo)臨床核磁成像系統(tǒng)(SignaHDxt，Milwaukee，WI)和動(dòng)物專用小鼠線圈。麻醉后將裸鼠固定在專用動(dòng)物線圈上，將移植瘤的中心定位于線圈及磁體的中央。對全部裸鼠皮下移植瘤模型進(jìn)行常規(guī)MRI檢查及R2＊掃描檢查，檢查時(shí)間點(diǎn)取給藥前基態(tài)(base)和給藥后3、12、24、48、60h。各掃描序列及參數(shù)：(1)快速自旋回波T1WI:FSE序列，TR 660.0ms，TE 14.7ms，矩陣256×192，層厚2.0mm，層間距0.2mm，掃描視野(FOV)5.0cm×5.0cm，激勵(lì)次數(shù)(NEX)2，回波鏈長(ETL)2個(gè)，帶寬(bandwidth)10.00kHz，進(jìn)行軸位掃描。(2)快速自旋回波T2WI:FSE序列，TR2620.0ms，TE 80.0ms，矩陣256×192，層厚2.0mm，層間距0.2mm，掃描視野(FOV)5.0cm×5.0cm，激勵(lì)次數(shù)(NEX) 2，帶寬(bandwidth)10.00kHz，回波鏈長(ETL)為14個(gè)，進(jìn)行軸位掃描。(3)多次快速梯度回波R2＊序列：TR235ms，TE為44.2～107.7ms(16個(gè)TE)，矩陣192×128，層厚2.0mm，層間距0.2mm，掃描視野(FOV)6.0cm×4.8cm，激勵(lì)次數(shù)(NEX)為1，帶寬(bandwidth)31.25kHz，翻轉(zhuǎn)角(flip angle)20°。采用CE ADW4.5圖像后處理工作站進(jìn)行，采用Functool軟件包測量R2＊值，擬合常規(guī)圖像與偽彩圖，感興趣區(qū)域(ROI)的選取以T2WI和b=0時(shí)的圖像為參照，盡量避開明顯壞死液化區(qū)，同時(shí)應(yīng)避免測及瘤體邊緣和偽影干擾區(qū)域，ROI包括瘤體面積的80%以上，各時(shí)間點(diǎn)所選ROI的層面和位置盡量保持一致，測量腫瘤相鄰的3個(gè)層面并取均值。

1.4 病理學(xué)檢查MR掃描結(jié)束后處死全部裸鼠，取出全部腫瘤組織及肝臟、脾臟，在10%甲醛溶液中固定，常規(guī)石蠟包埋、切片，普魯士藍(lán)染色，染色后的切片通過光學(xué)顯微鏡觀察組織病理學(xué)變化。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，G1組與G2組之間采用重復(fù)測量資料的方差分析比較不同時(shí)間點(diǎn)、對比劑以及兩者之間的交互效應(yīng)對各組R2＊值的顯著性。組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)的數(shù)據(jù)采用單因素方差分析進(jìn)行兩兩比較，采用()來表示，經(jīng)過F檢驗(yàn)，若方差齊采用LSD檢測，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 常規(guī)MR表現(xiàn)與基態(tài)相比，G2組在給藥后的60h內(nèi)，不同時(shí)間點(diǎn)腫瘤大小、體積均未見明顯改變。兩組裸鼠皮下NSCLC移植瘤信號較均勻，腫瘤均以實(shí)質(zhì)成分為主，未見明顯囊變壞死區(qū)域，在常規(guī)T1WI呈等信號，T2WI呈等低信號，中央見少許高信號混雜信號區(qū)。

2.2 磁共振R2＊成像結(jié)果采用平行G1組的重復(fù)測量試驗(yàn)的方差分析進(jìn)行組間因素(不同時(shí)間點(diǎn))、組內(nèi)×組間因素、組間因素差異的統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示(表1)：各組不同時(shí)間點(diǎn)之間R2＊值總體變化具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=24.411，P=0.000)；時(shí)間與藥物之間不存交互效應(yīng)(F=1.423，P=0.255)；不同時(shí)間點(diǎn)組間比較存在顯著性差異(F=5.720，P=0.007)。兩組不同時(shí)間點(diǎn)R2＊值結(jié)果，base點(diǎn)兩組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，其余兩組間各時(shí)間點(diǎn)R2＊值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。裸鼠NSCLC移植瘤T2WI及R2＊值偽彩圖見圖1。

2.3 病理學(xué)檢查由圖2可知，裸鼠腫瘤、肝臟、脾臟組織內(nèi)可見較多的藍(lán)染顆粒；裸鼠腫瘤普魯士藍(lán)染色顯示腫瘤組織中央?yún)^(qū)域聚集較多藍(lán)色鐵沉積，且越靠外的區(qū)域鐵沉積越少。F/A-PLGA@DOX/SPIO組腫瘤組織的藍(lán)色鐵沉積高于SPIO組，而肝臟、脾臟組織的藍(lán)色鐵沉積低于SPIO組。

3 討 論

早期磁共振對于組織及器官內(nèi)鐵沉積的研究，主要集中運(yùn)用自旋回波序列(spin echo,SE)T2＊成像技術(shù)，T2＊值可以很好地反映組織內(nèi)磁敏感對組織信號的影響，且采集時(shí)間短、呼吸運(yùn)動(dòng)偽影較少[7]。為了方便反映鐵含量的大小，引入了R2＊值，計(jì)算公式為R2＊=1000/T2＊。當(dāng)組織含鐵量增加時(shí)，順磁性的鐵化合物會(huì)破壞局部磁場的均勻性，導(dǎo)致其周圍氫質(zhì)子的馳豫時(shí)間縮短，引起組織的弛豫率R2(1/T2)與R2＊(1/T2＊)增加。R2＊mapping成像速度快，信噪比高，避免使用對比劑，因此極大地縮短掃描時(shí)間的同時(shí)，可以獲得較高的圖像質(zhì)量。基于磁共振R2＊mapping技術(shù)可以計(jì)算出R2＊值，已有研究證實(shí)組織內(nèi)的鐵含量與R2＊值存在高度的相關(guān)性[8-10]。本研究主要探討R2＊mapping示蹤F/A-PLGA@DOX/SPIO納米載藥體系在NSCLC腫瘤成像中的應(yīng)用價(jià)值及影像學(xué)基礎(chǔ)。

表1 各組不同時(shí)間點(diǎn)R2＊值比較(×10-3mm2/s)

圖1 裸鼠NSCLC移植瘤T2WI及R2*值偽彩圖。1A：圓圈示測量時(shí)ROI的放置位置；1B：裸鼠移植瘤常規(guī)T2WI圖像；1C：基態(tài)時(shí)，裸鼠移植瘤R2*值偽彩圖；1D：給藥后3h，裸鼠移植瘤R2*值偽彩圖；1E：給藥后24h，裸鼠移植瘤R2*值偽彩圖；1F：給藥后60h，裸鼠移植瘤R2*值偽彩圖。圖2 裸鼠病理學(xué)圖片。2A、2B分別為G1、G2組腫瘤普魯士藍(lán)染色(×20)；2C、2D分別為G1、G2組肝臟普魯士藍(lán)染色(×20)；2E、2F分別為G1、G2組脾臟普魯士藍(lán)染色(×20)。

本研究結(jié)果顯示，相對于G1組，G2組在給藥后3 h時(shí)腫瘤R2＊值上升趨勢明顯，且G2組給藥后60h時(shí)腫瘤R2＊值下降幅度明顯低于G1組，組間比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。G1組各時(shí)間點(diǎn)R2＊值總體升高幅度較G2組低。單純SPIO容易被網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞系統(tǒng)吞噬，大部分囤積在肝臟、脾臟等臟器，部分存留在腫瘤組織，病理普魯士藍(lán)染色檢查結(jié)果與之一致。本研究中，G2組具有FA和ACPP雙靶性的優(yōu)勢，能夠有效逃離網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞系統(tǒng)的吞噬，納米粒子在腫瘤內(nèi)留置的時(shí)間相對更久。DOX經(jīng)過靶向納米化修飾后不僅明顯提高了腫瘤細(xì)胞對藥物的吸收效率，還使靶向納米化藥物F/A-PLGA@DOX/SPIO在正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞之間具有選擇性，其主要原因是在A549細(xì)胞與正常細(xì)胞膜表面FA受體[11]以及基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2/MMP-9的表達(dá)水平不同所致。Ross等[12]測得卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、翠丸絨毛膜癌、結(jié)腸癌、腎癌、乳腺癌、肺癌等來源于上皮組織的癌組織中葉酸受體亞型(FR-)高度表達(dá)，較正常組織高出100～300倍。FA可以特異性識別惡性腫瘤細(xì)胞表面過度表達(dá)的FR-[11,13]。ACPP可以特異性識別在多種惡性腫瘤細(xì)胞中顯著表達(dá)的MMP-2/MMP-9[14]，從而發(fā)揮其細(xì)胞穿膜功能。在本研究中，成功制備了FA和ACPP雙靶向納米體系用于特異性識別A549細(xì)胞膜表面過表達(dá)的FR-受體及MMP-2/MMP-9，從而顯著增加納米體系的主動(dòng)靶向性，明顯提高了藥物的吸收效率。Kuhlpeter等[1]對人肺癌細(xì)胞應(yīng)用單純SPIO與受體靶向修飾SPIO兩種對比劑對比研究發(fā)現(xiàn)，由于后者具有一定的靶向性特點(diǎn)，具有更高的R2＊值，與本研究結(jié)果一致。

本研究結(jié)果表明，G2組腫瘤在給藥24h時(shí)R2＊值達(dá)到或接近峰值，明顯高于SPIO組。Suzuki等[15]將針對腫瘤細(xì)胞表面抗原的單克隆抗體作為主動(dòng)靶向工具，通過靜脈注射進(jìn)入荷瘤裸鼠體內(nèi)后，磁性納米粒子在腫瘤部位蓄積量在24～48h時(shí)達(dá)到最高，與本研究結(jié)果一致。單純SPIO組僅依靠腫瘤的高通透性和滯留(EPR)效應(yīng)，被動(dòng)聚集于腫瘤部位，因此R2＊值相對較低。王慶國等[16]發(fā)現(xiàn)R2＊值與SPIO標(biāo)記的內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)濃度呈線性相關(guān)，磁共振R2＊成像能夠定量示蹤SPIO標(biāo)記的EPCs。在體外試驗(yàn)中，Kircher等[17]發(fā)現(xiàn)R2＊值與SPIO標(biāo)記的細(xì)胞數(shù)呈明顯正相關(guān)。以上研究印證了本試驗(yàn)中G2組腫瘤細(xì)胞SPIO蓄積相對較多，導(dǎo)致R2＊值增高的結(jié)論。

利用磁共振技術(shù)監(jiān)測組織內(nèi)磁性納米粒子沉積的動(dòng)物試驗(yàn)早有報(bào)道，但多集中在測量T2信號值。研究表明，在注射靶向性磁性納米藥物1h后就會(huì)產(chǎn)生T2信號值的降低[18-20]，本試驗(yàn)中G2組腫瘤R2＊值在早期就有所改變，呈現(xiàn)上升趨勢，與前期的研究結(jié)果相一致。有研究證明，R2＊值可以作為生物標(biāo)志物對腫瘤血管靶向藥物及血管抑制劑(vascular disrupting agents，VDA)療效進(jìn)行監(jiān)測[21-22]，在注射藥物7min后就顯示R2＊值有所減低，在給藥后24h時(shí)顯示明顯減低，表明腫瘤內(nèi)血紅蛋白水平的改變與R2＊值之間敏感性較高，這也間接印證了本研究結(jié)果，R2＊值與腫瘤組織內(nèi)鐵含量的改變極其敏感，并在早期有所改變。

本研究中，普魯士藍(lán)染色結(jié)果顯示，G2組腫瘤組織的陽性染色率明顯高于G1組，而肝臟、脾臟組織的陽性染色率明顯低于G1組。SPIO是容易被巨噬細(xì)胞吞噬或者集中在網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞系統(tǒng)而被清除，而本研究合成的納米體系有效降低網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞系統(tǒng)的清除，提高納米體系在腫瘤組織的蓄積。這主要是因?yàn)楸狙芯考{米體系利用PLGA對SPIO進(jìn)行表面功能化，可以增加對網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞系統(tǒng)及巨噬細(xì)胞的逃逸能力，提高其在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間，此外，F(xiàn)A和ACPP的靶向修飾進(jìn)一步提高納米載體的主動(dòng)識別功能，更加有利于藥物在腫瘤內(nèi)的吸收。本試驗(yàn)應(yīng)用病理普魯士藍(lán)染色對納米體系在裸鼠腫瘤以及各組織器官分布情況進(jìn)行鐵的定性分析，染色結(jié)果與R2＊成像結(jié)果相互驗(yàn)證。

但本研究也存在一定的局限性：(1)樣本量不足，未做到各個(gè)影像檢查時(shí)間點(diǎn)與病理結(jié)果平行對照，提高兩者之間的相關(guān)性；(2)磁共振數(shù)據(jù)后處理中，ROIs的選取會(huì)對測量結(jié)果產(chǎn)生一定影響，需要仔細(xì)對比解剖圖像，多次測量取平均值才能保證數(shù)據(jù)的相對穩(wěn)定可靠。如果后處理可以采用自動(dòng)選擇三維全瘤容積數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，避免人為操作產(chǎn)生的誤差，能夠明顯提高定量參數(shù)測量的穩(wěn)定性以及試驗(yàn)的精確性。

綜上可知，R2＊值與腫瘤組織內(nèi)的SPIO含量存在較高敏感性，R2＊mapping技術(shù)提供了一種SPIO的腫瘤示蹤成像方法。