液體活檢在癌癥中的臨床研究新進展

李夢雨　金紅　徐明鑫

[關(guān)鍵詞] 液體活檢;循環(huán)腫瘤細胞;細胞外囊泡;循環(huán)腫瘤DNA;精準醫(yī)療

[中圖分類號] R743.3? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2021）27-0189-04

Progress in clinical research of liquid biopsy in cancer

LI Mengyu1? ?JIN Hong2? ?XU Mingxin2

1.The First Clinical Medical School， Mudanjiang Medical College， Mudanjiang? ?157011， China; 2.Department of Laboratory Medicine， Hongqi Hospital Affiliated to Mudanjiang Medical University， Mudanjiang? ?157011， China

[Abstract] Cancer is a serious threat to human health， and the global cancer burden is increasing. With the advancement of science and technology， people have begun to analyze cancer from the genome level. Under the background of precision medicine， liquid biopsy， the blue ocean of genetic testing， has also risen rapidly. Compared with traditional biopsy， this technology has the advantages of low cost， convenience and speed， and solves the problem of clinical sampling. In the future， it is expected to be applied to the fields of early screening， dynamic monitoring， and personalized medicine for cancer patients， and has a broad medical prospect. This article first introduces the types of liquid biopsy based on different body fluids， and then integrates and analyzes the latest technology and methods of liquid biopsy based on recent research and practice at home and abroad， and discusses the new clinical research progress of liquid biopsy in cancer.

[Key words] Liquid biopsy; Circulating tumor cells; Extracellular vesicles; Circulating tumor DNA; Precision medicine

由于人口增長老齡化等因素，全球近一半的癌癥病例和超過一半的癌癥死亡病例將發(fā)生在亞洲，中國作為人口大國更是深受癌癥的荼毒[1]。隨著人們在基因組層面對疾病認識的刷新，精準醫(yī)療孕育而生，其基礎(chǔ)就是對腫瘤進行精確的病理診斷。組織活檢雖是診斷腫瘤的金標準，但其有著很大的局限性：①創(chuàng)傷性大，不宜重復獲取;②腫瘤具有異質(zhì)性，使組織活檢所得基因信息片面。相比之下，液體活檢無創(chuàng)且易管理，依賴于腫瘤細胞等可能釋放到體液中的物質(zhì)來獲取腫瘤的全面信息，完美克服了腫瘤異質(zhì)性的問題，不僅有利于癌癥的早期診斷，還有助于醫(yī)生制訂更精準有效的療方[2]。本文就液體活檢在癌癥中的研究新進展進行綜述。

1血液類型的液體活檢

液體活檢常依附于血液檢查。腫瘤或轉(zhuǎn)移灶融入血液中的循環(huán)腫瘤細胞（Circulating tumor cells， CTCs）、細胞外囊泡（Extracellular vesicles，EVs）、循環(huán)腫瘤DNA（Circulating tumor DNA，ctDNA）和循環(huán)RNA[主要是微小RNA（miRNA）]是目前已知的檢測腫瘤和癌癥輔療的關(guān)鍵標志物。

1.1 CTCs

CTCs 指從原發(fā)性腫瘤或轉(zhuǎn)移灶脫落并釋放入血的腫瘤細胞，少數(shù)CTCs 可逃逸機體的免疫作用在血液循環(huán)中存活并播種新的轉(zhuǎn)移灶[3]。中性粒細胞和CTCs相互聯(lián)合可促進血液細胞周期的發(fā)展，擴大CTCs的轉(zhuǎn)移潛能，但CTCs的生物學特征和脆性及如何定義白細胞與CTCs之間相互作用的分子特征尚未可知，故研究人員可從此角度出發(fā)探討其機制，可能對癌癥的治療有重要意義。此外，CTCs可作為癌癥的預后標志物，如乳腺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌等，CTCs水平越高，預后越差[4]。監(jiān)測CTCs類型和數(shù)量變化將有助于患者的早期檢測、預后判斷、療效評估、耐藥篩查及轉(zhuǎn)移預警，實現(xiàn)個體化精準治療。目前暫無有效公式去計算癌癥患者CTCs的真實數(shù)量[5]，若能破解相關(guān)公式密碼，將是醫(yī)療界的一項重大突破。

1.2 EVs

EVs種類繁多，是指由細胞主動釋放的納米級膜囊。起初，EVs被低估為“細胞塵埃”和一種處理細胞代謝廢物的方式，通過后續(xù)研究，現(xiàn)已成為豐富和穩(wěn)定的循環(huán)標志物來源。EVs主要由微囊泡和外泌體構(gòu)成，在促進腫瘤微環(huán)境中細胞間通訊中起重要作用[6]，如多形性膠質(zhì)母細胞瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肺癌、膀胱癌、乳腺癌等。EVs可攜帶蛋白質(zhì)、信使RNA、miRNA和DNA等物質(zhì)，通過分析其攜帶的被動和主動物質(zhì)的多樣性，可調(diào)節(jié)癌癥的發(fā)生、發(fā)展和治療。Cheung 等[7]發(fā)現(xiàn)，乳腺病變患者血清衍生的EVs中存在人乳頭瘤病毒DNA（HPV DNA），對標本進行EVs檢測能起到擴大診斷陽性病變領(lǐng)域的作用;Julich-Haertel等[8]發(fā)現(xiàn)將膜聯(lián)蛋白V、上皮細胞黏附分子、去唾液酸糖蛋白受體1與EVs中的腫瘤相關(guān)微粒聯(lián)合可將肝癌和膽管癌與其他慢性疾病區(qū)分開來，ROC值、敏感度/特異度評分和陽性/陰性預測值>78%。EVs不僅存在于血液中，還廣泛存在于各種體液中，可作為癌癥的微創(chuàng)檢測工具。研究發(fā)現(xiàn)，檢測血清和腦脊液中的EVs 可提高最惡性腦癌成膠質(zhì)細胞瘤患者的生存率[9]。盡管EVs具有巨大的臨床應用潛能，目前仍缺乏敏感的EVs準備和分析技術(shù)來配合臨床檢測工作，因此，新的分析平臺需要被開發(fā)以應對這些挑戰(zhàn)。

1.3 ctDNA

ctDNA屬于循環(huán)游離DNA（Circulating free DNA， cfDNA）的一員，是來自腫瘤基因組的DNA片段，現(xiàn)已成為液體活檢和個體化用藥的潛力先驅(qū)。研究提示，檢測ctDNA的最佳標本類型是血漿（6 h內(nèi)收集的EDTA管）[10]。ctDNA檢測可用來識別腫瘤特異性基因突變，如乳腺癌中的人表皮生長因子受體2（HER2）突變、肺癌和黑色素瘤中的基因突變[11-13]。相對于標準放射學，ctDNA檢測能盡早地發(fā)現(xiàn)耐藥突變，可用于對患者腫瘤動態(tài)及治療效果的評估。大量數(shù)據(jù)表明，ctDNA檢測對部分晚期癌癥具有臨床有效性和實用性，如肺癌、結(jié)腸直腸癌、前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌及胰腺癌等。因相關(guān)研究大多為回顧性研究，ctDNA檢測在早期癌癥、治療監(jiān)測或殘留疾病檢測中的證據(jù)不足，故需要進行大規(guī)模的前瞻性研究來確定臨床有效性。一項重要的前瞻性研究顯示，檢測無細胞EB病毒（EBV）DNA中的ctDNA可預測鼻咽癌的發(fā)生，陽性預測值為11%[14]。這表明ctDNA有篩查癌癥的潛力。作為新興的腫瘤生物標志物，ctDNA有望在未來的癌癥治療中發(fā)揮更大的作用。

1.4 循環(huán)RNA

1996年，研究人員在黑色素瘤患者的血液中首次檢測出循環(huán)腫瘤相關(guān)RNA，隨后在實體瘤患者中檢測出其他形式的RNA，一些miRNA可作為預后預測的標志物或新型癌癥治療的潛在靶點[15]。目前，對miRNA機制的研究還很模糊，研究人員正在積極探索miRNA與癌癥之間的關(guān)系。Zhang等[16]發(fā)現(xiàn)miR-126可控制慢性白血病干細胞的自我更新;Bhandari等[17]研究證實miR-133a-3p可調(diào)節(jié)腫瘤缺氧進而驅(qū)動腫瘤的侵襲性分子特征。由此可見，未來解除對miRNA功能的管制對癌癥的治療有重要意義。

2 其他類型的液體活檢

2.1尿液活檢

尿液活檢是泌尿系統(tǒng)疾病無創(chuàng)性診斷和預后判斷的最佳方法。將尿液離心后，其沉渣可進行尿脫落細胞學檢查，上清液可進行游離物質(zhì)檢測，如ctDNA或RNA。Yu等[18]發(fā)現(xiàn)在大腸癌患者中檢測尿液的ctDNA基因突變情況可作為大腸癌早期臨床干預指標，Christensen等[19]對尿液進行ctDNA檢測發(fā)現(xiàn)成纖維細胞生長因子受體3（FGFR 3）可作為預測膀胱切除術(shù)后疾病復發(fā)的指標，而檢測RNA中的miR-193a 和 miR-448可用于評估尿液樣本的診斷和預后。尿液雖取樣便捷，但其所受干擾因素較多，需要進行大量的臨床研究才能將其運用到臨床工作中。

2.2唾液活檢

唾液樣本可用于頭頸部癌癥的檢測。近期研究發(fā)現(xiàn)，唾液生物標志物可用于口腔癌的診斷和早期檢測，如Zhao等[20]對口腔鱗癌患者唾液中的環(huán)狀RNA進行檢測，發(fā)現(xiàn)術(shù)后其表達水平與術(shù)前相比明顯降低（P<0.001）。

2.3腦脊液活檢

由于血腦屏障的存在，大腦和中樞神經(jīng)系統(tǒng)成為腫瘤細胞的避難所，因此腦脊液腔室中含有一張獨特的、高度信息化的“分子藍圖”。研究提示，腦脊液在中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤患者中存在臨床相關(guān)的基因組改變，可用液體活檢監(jiān)測腫瘤的進展[21]。

2.4 糞便活檢

利用糞便樣本對腫瘤進行分子檢測是早期診斷癌癥的有效手段，特別是大腸癌。研究提示，利用糞便中的生物標志物可以更早地檢測結(jié)直腸癌和晚期腺瘤，其較血液標志物相比在大腸癌不同的臨床病理分期方面有更好的診斷性能[22-23]。

2.5其他

除以上類型外，淋巴液、精液、乳汁、胸膜液和腹水也是腫瘤衍生物質(zhì)的潛在來源，甚至還能利用呼吸活檢測量相關(guān)有機化合物。

3 液體活檢的技術(shù)和方法

3.1 CTCs 的檢測技術(shù)

CTCs 發(fā)現(xiàn)時間較早，臨床產(chǎn)品相對成熟，體外檢測系統(tǒng)Cellsearch是CTCs檢測的金標準。除基于電化學技術(shù)的CTCs檢測外，即時CTCs檢測技術(shù)測試儀器體積小，無需專門實驗室和檢驗人員，更為臨床提供了一種快速、廉價、易于操作的可能性[24]。此外，捕獲CTCs時可利用CTCs與材料（如磁珠、微流控芯片）之間特異性的相互作用將CTCs與正常血細胞區(qū)分開來[25]，富集CTCs后可用熒光法（如熒光顯微鏡、熒光分光光度計、流式細胞儀）、表面增強拉曼光譜（SERS）或電阻抗檢測，也可不經(jīng)富集利用SERS或線共聚焦顯微鏡直接檢測。2017年，Myung等[26]將生物模擬技術(shù)和納米技術(shù)相結(jié)合，基于CTCs黏附蛋白的表面表達，最大限度提高了CTCs的檢測水平，捕獲率高達82%，純度高達90%。CTCs相關(guān)芯片的研發(fā)，有望為癌癥的早期診斷和預后便捷評估提供新的選擇。

3.2 EVs的檢測技術(shù)

EVs的檢測技術(shù)與CTCs相似。隨著科技的進步，一些納米材料也將用于EVs的檢測。在最近的一篇論文中，描述了一種新型微芯片平臺，該平臺利用抗體條形碼可對不同細胞類型和來源的EVs進行檢測，可同時獲取兩種不同細胞間通訊物質(zhì)（蛋白分泌物和EVs）的信息，能更全面地監(jiān)控細胞通信[27]。EVs的臨床潛力毋庸置疑，但敏感度和特異度差強人意，各種傳感機制也存在差異，需要協(xié)同多平臺表征，因此，研究人員需積極開發(fā)新的分析平臺以應對這些挑戰(zhàn)。

3.3 ctDNA 的檢測技術(shù)

與CTCs相比，ctDNA更穩(wěn)定，更易分離，但ctDNA只占cfDNA的一小部分，片段在170～200堿基對之間，如何高效地將ctDNA 提取純化是研究的關(guān)鍵。市面上有很多提取純化ctDNA的試劑盒，手工法可利用微柱吸附法和磁珠吸附法將其分離，隨著技術(shù)的更新，也可用機器對其進行提取實現(xiàn)自動化。熒光法可以檢測ctDNA的濃度[28]，其中的癌癥基因組信息可通過多種技術(shù)被檢測出來?；谝旱蔚臄?shù)字PCR（ddPCR）或二代測序（NGS）等新技術(shù)的發(fā)展，極大地提高了檢測稀有序列的敏感度、特異度和精密度，這些技術(shù)敏感度在0.001%～0.010%之間[29]。ctDNA分析方法的最新進展推動了液體活檢工具的開發(fā)，將用于癌癥的診斷、預后、治療反應監(jiān)測和跟蹤癌癥患者中新的突變亞克隆的增加。

4 結(jié)語

液體活檢彌補了傳統(tǒng)基因檢測不足，利用液體活檢技術(shù)可實現(xiàn)腫瘤早期篩查、動態(tài)監(jiān)測腫瘤治療、耐藥突變檢測及個性化用藥、評估腫瘤異質(zhì)性和復發(fā)轉(zhuǎn)移風險。在樣本類型選擇上，國內(nèi)外研究以血液為主，其次為尿液，其他樣本類型涉及較少。在活檢物質(zhì)選擇上，因CTCs和ctDNA在腫瘤中含量較多，故熱點主要集中于兩者身上，不同的是，CTCs捕獲腫瘤細胞，ctDNA則捕獲腫瘤DNA片段。從臨床角度，同時檢測兩者所得的診斷信息可互補。從技術(shù)角度，CTCs和 ctDNA 可在同一樣本中同時獲得，兩種技術(shù)并不沖突，共存可能是其未來的發(fā)展方向。液體活檢熱潮，如火如荼，生物技術(shù)公司紛紛切入液體活檢領(lǐng)域，部分優(yōu)秀研發(fā)產(chǎn)品已獲得美國食品藥品管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）認證批準，顯示出實驗室監(jiān)管機構(gòu)對液體活檢技術(shù)臨床應用價值的認可，再加上醫(yī)保的全面覆蓋，液體活檢有望在5～10年內(nèi)大規(guī)模推廣。

液體活檢前景廣闊，但其仍面臨諸多問題和挑戰(zhàn)。現(xiàn)有的液體活檢技術(shù)大多檢測復雜，成本昂貴，敏感度和特異度也不盡人意，國內(nèi)技術(shù)與國外相比還屬于較為空白區(qū)域，缺乏有效的試劑盒和儀器來應對挑戰(zhàn)，高效的新興技術(shù)有待研發(fā)。再者，關(guān)于液體活檢的研究大多是回顧性研究，缺乏大規(guī)模的前瞻性研究，這是液體活檢實際運用到臨床工作中的最大障礙。液體活檢技術(shù)的成熟需要各方面的努力，研究人員應不斷擴充相關(guān)數(shù)據(jù)庫，國民也應提高自身健康意識，定期去做體檢，使液體活檢這種癌癥早期診斷檢測技術(shù)實現(xiàn)應有的價值，同時相關(guān)部門應給予支持和推廣，如此一來既提升了國家整體的醫(yī)療水平，又能給相關(guān)研究人員提供數(shù)據(jù)參考，形成一個良性循環(huán)。在這樣一個精準醫(yī)療時代，液體活檢技術(shù)的發(fā)展“道阻且長”，前途也不可限量。

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（收稿日期：2020-11-11）