靶向沉默CCDC132表達對卵巢癌細(xì)胞SKOV3生長、遷移及侵襲能力的影響及其機制研究

張慧雅　徐玉紅　盧琪蕓　單江靜　陳君霞

[關(guān)鍵詞] 卵巢癌;CCDC132基因;細(xì)胞生長;Wnt/β-catenin信號通路

[中圖分類號] R737.2? ? ? ? ? [文獻標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2021）27-0009-04

Effect of targeted silencing of CCDC132 expression on the growth， migration， and invasion of ovarian cancer cell line SKOV3 and its mechanism

ZHANG Huiya? ?XU Yuhong? ?LU Qiyun? ?SHAN Jiangjing? ?CHEN Junxia

Department of Gynecology， Shaoxing People′s Hospital in Zhejiang Province， Shaoxing? ?312000， China

[Abstract] Objective To study the effect of targeted silencing of the CCDC132 gene by shRNA on the proliferation，migration， and invasion of ovarian cancer SKOV3 cells and its mechanism. Methods Ovarian cancer SKOV3 cell line was cultured in vitro. CCDC132-siRNA and empty vector sequence were designed and transfected into ovarian cancer SKOV3 cells， which were the sh-CCDC132 group and the control group. The relative expression of CCDC132 in each group was detected by qRT-PCR. Cell proliferation was detected by CCK8 assay. Cell migration was detected by scratch assay. Cell invasion was detected by transwell assay， and Wnt/β-catenin pathway-related protein expression was detected by Western Blot. Results After transfection， the expression level of CCDC132 in the sh-CCDC132 group was significantly lower than that in the control group（P<0.01）. The proliferation rate of the sh-CCDC132 group was significantly lower than that in the control group（P<0.01）， the migration rate was decreased（P<0.01）， and the number of invasive cells was significantly decreased（P<0.01）. The expression of caspase 3 and Bax protein was significantly up-regulated （P<0.01）， while the expression levels of β-catenin （P<0.01）， Cyclin D1（P<0.01） and c-myc（P<0.05） protein were significantly decreased. Conclusion Silencing CCDC132 can inhibit the proliferation， migration， and invasion of SKOV3 cells，and the specific mechanism may be related to the Wnt/β-catenin signaling pathway.

[Key words] Ovarian cancer; CCDC132 gene; Cell growth; Wnt/β-catenin signaling pathway

卵巢癌是婦科三大惡性腫瘤之一，其死亡率位于首位[1]。因早期卵巢癌患者無明顯臨床癥狀及體征，缺乏特異性診斷方法，大多數(shù)患者初次確診已為晚期，且初始治療后復(fù)發(fā)率高，5年總生存率低，因而尋找有效治療卵巢癌的方式具有重要意義。卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域蛋白（Coiled-coil domain-containing，CCDC）其蛋白序列中存在一個或多個卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，如CCDC80、CCDC67、CCDC66等[2-4]。CCDC132是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)回收蛋白（Endosome-associated recycling protein，EARP）的重要組成部分，通過調(diào)控內(nèi)吞小體回收至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)參與細(xì)胞自噬[5]，從而發(fā)揮其生物學(xué)功能，如胰腺癌、胃癌[6-7]。Wnt/β-catenin信號通路在參與調(diào)控細(xì)胞增殖分化、腫瘤增殖和凋亡等多種生理病理過程[8]。目前研究顯示，多種基因、藥物均可通過Wnt/β-catenin信號通路作用于卵巢癌細(xì)胞，并引起其凋亡[9-13]。目前關(guān)于CCDC132在卵巢癌細(xì)胞中的是否有異常表達及是否通過調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路影響卵巢癌細(xì)胞生物學(xué)行為的研究尚未見報道。本實驗以卵巢癌SKOV3細(xì)胞為研究對象，探討CCDC132影響卵巢癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的可能機制，為進一步闡明卵巢癌發(fā)生發(fā)展的分子機制及治療提供新線索，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 主要材料

人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3購自中國科學(xué)院上海生物細(xì)胞研究所;胎牛血清和McCoy′s 5A培養(yǎng)基購自美國Gibco公司;CCDC132-shRNA（5′-CCGGCCTCA-AGAAAGCCTCAGTGATCTCGAGATCACTGAGGCTT-TCTTGAGGTTTTT-3′）及陰性對照Ctrl-shRNA（5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′）慢病毒載體由上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司提供;CCDC132、caspase-3、Bax、β-catenin、Cyclin D1、c-myc、GAPDH 鼠抗人單克隆抗體及二抗均購于美國Santa Cruz公司;Trizol購自上海普飛公司，CCK-8試劑盒購于美國MedChenExpress公司。Matrigel基質(zhì)膠購自美國Corning公司，Transwell小室（8.0 μm孔徑）購自美國Corning公司，cDNA合成試劑盒購自美國Promega公司，SDS-PAGE凝膠配制試劑盒購于上海碧云天生物公司，PVDF膜購于美國Millipore公司，酶標(biāo)儀、凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad），實時熒光定量PCR儀（瑞士Roche），DNA/RNA Calculator（上海Pharmacia Biotech），低溫高速離心機（美國Sigma），倒置顯微鏡（日本Olympus），紫外分光光度計（美國PE），CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國Thermo）。

1.2 SKOV3細(xì)胞培養(yǎng)與慢病毒感染

SKOV3細(xì)胞以含10%胎牛血清的McCoy′s 5A培養(yǎng)基在5% CO2、37℃和濕度飽和的細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。將對數(shù)生長期的SKOV3細(xì)胞以每孔105個接種至6孔細(xì)胞板上后，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。實驗分為對照組（以Ctrl-shRNA慢病毒感染）和sh-CCDC132組（以CCDC132-shRNA慢病毒感染）。培養(yǎng)24 h后，根據(jù)實驗分組分別向SKOV3細(xì)胞中加入Ctrl-shRNA和CCDC132-shRNA 慢病毒溶液2.50 μL（病毒滴度為8×108 TU/mL）和6.67 μL（病毒滴度為3×108 TU/mL）進行感染;感染24 h后，更換新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng);培養(yǎng)72 h后，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞GFP的表達情況以評價感染效果。待細(xì)胞感染效率超過70%且細(xì)胞生長狀態(tài)良好時，即可進行后續(xù)實驗。

1.3 實時熒光定量PCR檢測SKOV3細(xì)胞中CCDC 132 mRNA表達水平

采用Trizol法提取SKOV3細(xì)胞中的總RNA后，使用DNA/RNA Calculator檢測RNA的濃度與純度。將高質(zhì)量的RNA按照cDNA合成試劑盒說明書合成cDNA;再以cDNA為模板，根據(jù)上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司合成的PCR引物按照PCR反應(yīng)條件（95℃預(yù)變性 5 min;95℃變性30 s、60℃退火30 s、72℃延伸30 s，循環(huán)40次）上PCR儀進行擴增，以GAPDH為模板，采用2-ΔΔCt法計算SKOV3細(xì)胞中CCDC132 mRNA的表達水平。實驗重復(fù)3次。其中，PCR引物序列如下：CCDC132上游：5′-CATCTGGGGATACGCTGTATG-3′，下游：5′-GTAGTTCACTGGCGGTTGAG-3′;GAPDH上游5′-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3′，下游：5′-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3′。

1.4 Western Blot檢測SKOV3細(xì)胞中目的蛋白的表達水平

向SKOV3細(xì)胞中加入RIPA裂解液抽提細(xì)胞總蛋白后，采用核酸蛋白分析儀檢測總蛋白的濃度與純度。將熱變性后的蛋白樣品行SDS-PAGE凝膠電泳分離后，電轉(zhuǎn)至PVDF膜上。經(jīng)5%脫脂奶粉封膜2 h后，加入按照1：1000比例稀釋的目的蛋白一抗抗體和GAPDH抗體;置于4℃條件下孵育24 h后，加入按照1∶1000～1∶2000比例稀釋的相應(yīng)二抗搖床孵育2 h。以ECL化學(xué)發(fā)光劑顯影后，以GAPDH為內(nèi)參，采用凝膠成像分析系統(tǒng)掃描分析SKOV3細(xì)胞中目的蛋白的表達水平。實驗重復(fù)3次。

1.5 CCK8法檢測SKOV3細(xì)胞生長情況

將感染后的sh-CCDC132組和對照組細(xì)胞以每孔1000個接種至96孔細(xì)胞板上，其中每組設(shè)置3個復(fù)孔;置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，每隔24 h向每孔加入10 μL CCK-8溶液，將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h。酶標(biāo)儀測定吸光度。實驗設(shè)計5個復(fù)孔取平均值，并重復(fù)3次。

1.6 劃痕實驗

用marker筆在6孔板底部背面均勻劃3條記號線，取對數(shù)生長期細(xì)胞，接種于6孔板中常規(guī)培養(yǎng)。待細(xì)胞融合至70%～80%，用200 μL無菌中號槍頭比著直尺用力劃線，使劃痕與記號線垂直。用無菌PBS輕輕洗滌細(xì)胞3次，洗去劃下的細(xì)胞。向6孔板中加入無血清培養(yǎng)基，于5% CO2，37°C恒溫箱中常規(guī)培養(yǎng)。每隔12 h對同一位置細(xì)胞拍照。應(yīng)用Image J軟件測量不同時間點劃痕內(nèi)空白距離的大小，并用計算遷移距離，比較兩組細(xì)胞遷移率的大小。重復(fù)實驗3次。

1.7 Transwell實驗

用50 mg/L Matrigel膠稀釋液包被 Transwell 小室基底膜。取對數(shù)生長期細(xì)胞，常規(guī)消化饑餓12～24 h，取含1×106個/mL的細(xì)胞懸液（無血清）100 μL，吹打均勻，加入Transwell小室，向下室加含血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)550 μL。分別于16 h和24 h，擦去小室基底膜上層細(xì)胞，甲醛固定 20 min，4 g/L 結(jié)晶紫染色30 min，均選10個視野，于倒置相差顯微鏡下觀察、計數(shù)并照相。實驗重復(fù)3次，每次設(shè)置3個復(fù)孔取平均值。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

采用GraphPad Prism8軟件進行數(shù)據(jù)分析與圖表繪制。計量資料以（x±s）表示，采用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 慢病毒感染卵巢癌SKOV3細(xì)胞結(jié)果

CDC132-shRNA和Ctrl-shRNA慢病毒感染卵巢癌SKOV3細(xì)胞72 h后，采用熒光顯微鏡觀察感染效率。結(jié)果顯示，sh-CCDC132組和對照組細(xì)胞中均有GFP表達，細(xì)胞感染效率在80%以上，且細(xì)胞狀態(tài)良好。見封三圖1。

2.2 慢病毒感染SKOV3細(xì)胞后CCDC132 mRNA和蛋白表達結(jié)果

與對照組（0.055±0.016）比較，sh-CCDC132組細(xì)胞中CCDC132基因在mRNA表達水平（0.932±0.243）受到顯著抑制（P<0.01）;同時，CCDC132-shRNA慢病毒感染后SKOV3細(xì)胞中CCDC132基因在蛋白水平的表達水平明顯減弱。見封三圖2。

2.3 敲低CCDC132表達卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖能力的影響

CCK8法檢測結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染24 h起，sh-CCDC 132組OD450值低于對照組（P<0.01），提示細(xì)胞增殖活性受到顯著抑制。見表1。

2.4 敲低CCDC132表達抑制卵巢癌SKOV3細(xì)胞遷移

劃痕實驗結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后24 h，sh-CCDC132組與對照組的遷移率分別為（0.445±0.056）%、（0.871±0.005）%，提示sh-CCDC132組細(xì)胞比對照組劃痕愈合程度減緩（P<0.01）。見封三圖3。

2.5 敲低CCDC132表達抑制卵巢癌SKOV3細(xì)胞侵襲

實驗結(jié)果顯示，與對照組（181.33±29.02）相比，sh-CCDC132組（73.33±18.14）細(xì)胞每高倍鏡視野下觀察到的侵襲細(xì)胞數(shù)顯著減少（P<0.01）。見封三圖4。

2.6 敲低CCDC132后SKOV3細(xì)胞中caspase-3、Bax、β-catenin、Cyclin D1和c-myc蛋白的表達

Western Blot實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，sh-CCDC132組細(xì)胞caspase-3、Bax蛋白表達明顯上調(diào)，而β-catenin、Cyclin D1和c-myc蛋白表達水平顯著降低。見表2、封三圖5。

3 討論

CCDC132又名囊泡分揀蛋白50（Vacuolar protein sorting 50，VPS50），位于7號染色體q21.2～q21.3，全長1216 bp，編碼964個氨基酸，全蛋白分子質(zhì)量為111.2 kDa[5]。cBioPortal數(shù)據(jù)庫（http：//www.cbioportal.org/）顯示CCDC132在膀胱尿路上皮癌、乳腺浸潤癌、腎上腺皮質(zhì)癌、宮頸癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、肺腺癌、卵巢漿液性囊腺癌和胃癌中存在異常表達。目前對CCDC132的功能的研究仍較少。現(xiàn)有的研究證實，CCDC132的異常表達與IgA腎病相關(guān)[14];CCDC132在特應(yīng)性皮炎T細(xì)胞中呈高表達，可能參與特應(yīng)性皮炎的過程[15];CCDC132也在神經(jīng)元中表達，并控制囊泡酸化和突觸功能，其功能突變可導(dǎo)致神經(jīng)發(fā)育障礙[16];此外胰腺惡性腫瘤的導(dǎo)管液中CCDC132的表達增加，提示其可能在胰腺癌發(fā)生發(fā)展中起重要作用[6]。Xu等[7]研究報道，CCDC132在胃癌組織中呈高表達，而敲低其表達可通過增加CHK2磷酸化和p53蛋白表達等抑制腫瘤細(xì)胞增殖并促進其凋亡。

Wnt/β-catenin信號通路在腫瘤發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。Wnt信號激活后可抑制β-catenin磷酸化，激活Bax、Survivin、Cyclin D1等下游基因的表達[8，17-18]。Wnt/β-catenin信號通路廣泛作用于多種惡性腫瘤，并參與細(xì)胞凋亡的調(diào)控，如胃癌、胰腺癌、乳腺癌、宮頸癌、卵巢癌等[11，19-22]。大量研究證實，多種基因可調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路，如過表達miRNA-15a、miRNA-27a可抑制Wnt/β-catenin信號通路中Wnt3a、β-catenin等表達，抑制卵巢癌細(xì)胞增殖和侵襲[9-10];靶向沉默LOXL2基因可抑制β-catenin、Cyclin D1表達，誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡[11];CXCR4基因沉默后可抑制CTNNB1、c-myc等基因表達，調(diào)控卵巢癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[12];TRIM21過表達可抑制PARP抑制劑尼拉帕尼的抗癌活性，該作用可通過下調(diào)β-catenin或使用Wnt/β-catenin抑制劑XAV-939逆轉(zhuǎn)[13]，提示該信號通路可能與卵巢癌靶向藥物耐藥相關(guān)。

本研究以CCDC132-shRNA慢病毒成功感染卵巢癌SKOV3細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，CCDC132基因表達水平明顯降低，SKOV3細(xì)胞生長及遷移能力明顯受到抑制。本研究還發(fā)現(xiàn)敲低CCDC132表達后，SKOV3細(xì)胞caspase-3、Bax蛋白表達增加，而β-catenin、Cyclin D1和c-myc蛋白表達下調(diào)，提示CCDC132基因可能通過Wnt/β-catenin信號通路有關(guān)，CCDC132基因聯(lián)合Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白檢測可為卵巢癌診斷、靶向藥物選擇及預(yù)后評估的標(biāo)記物，有望成為卵巢癌治療的潛在靶點。

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（收稿日期：2021-04-15）