安徽齊云山石斛傅里葉紅外光譜分析

田勝尼， 李亞楠， 胡藝璇， 李 純

(安徽農(nóng)業(yè)大學 生命科學學院，合肥 230036)

石斛(Dendrobiumnobile)是蘭科(Orchidaceae)石斛屬(Dendrobium)多年生常綠草本植物[1]。它是我國傳統(tǒng)滋補中藥，藥用部分是新鮮或干燥的莖，生物活性成分主要為多糖、石斛堿和酚類物質等，具有益胃生津、降血糖及增強免疫力等功效[2-8]。我國石斛品類繁多、分布范圍廣，但不同產(chǎn)地、不同品種的石斛價格和藥用價值差異較大[9-11]。目前石斛銷售市場品種混雜，以假亂真的現(xiàn)象時有發(fā)生，嚴重影響了石斛產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展[12]。而傅里葉變換紅外光譜(fourier transform infrared spectroscopy, FTIR)是一種對物質內(nèi)部分子結構定性或定量的技術，已被廣泛運用在中草藥、食品等諸多研究領域，廣泛用于中藥材真?zhèn)蝺?yōu)劣鑒別、中藥活性成分定量分析，包括石斛的鑒定分析[13-18]。鄧月娥等[19]對不同產(chǎn)地金釵石斛的紅外光譜分析發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)自云南和浙江的金釵石斛(D.nobile)存在差異；沈宗根等[20]對3種石斛屬植物與細葉石仙桃(Pholidotacantonensis)的紅外光譜分析比較得出銅皮石斛(D.moniliforme)可作為鐵皮石斛(D.officinale)的藥用替代品，而細葉石仙桃不能作為替代品，大大緩解了鐵皮石斛稀缺的壓力。劉文杰等[21]采用傅里葉紅外光譜法測定了4個不同產(chǎn)地的環(huán)草石斛光譜圖，通過比較譜峰強度的差異，可對其進行鑒別。此外，在中藥臨床應用中，同一種藥材的不同部位的功效存在一定的差異，需要利用科學的方法對其進行區(qū)分，以確保入藥合理。李建蕊等[22]用紅外光譜法對三七的主根、剪口、筋條、絨根等不同部位的光譜特征進行研究，找出各部位化學成分之間的差異及相關性。傅里葉變換紅外光譜中每個分子都有自己的光譜特征，對波段位置、寬度和強度的分析提供了有關細胞組成和生理狀態(tài)的信息[23]。隨著科學技術的發(fā)展，光譜測定技術將會更好地與計算機、化學計量學等學科結合，在中藥領域應用等發(fā)揮重要作用。

在安徽省黃山市休寧縣齊云山野外科考發(fā)現(xiàn)，其山上有自然定居的石斛(D.nobile)。該石斛經(jīng)組培快繁，現(xiàn)可大面積栽培。有關來自齊云山石斛化學成分與市場上廣泛栽培的六安和溫州鐵皮石斛之間是否存在差異，目前尚未見有研究。本文以六安、溫州兩地產(chǎn)的鐵皮石斛為對照，利用傅里葉紅外光譜技術研究齊云山石斛根、莖、葉的紅外光譜特征，分析探討同一產(chǎn)地石斛不同器官及不同產(chǎn)地石斛相同器官之間所含化學成分種類差異，為齊云山地區(qū)野生石斛資源的保護、人工種植與栽培及可持續(xù)利用等提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗所用的材料為齊云山石斛(D.nobile)、六安鐵皮石斛(D.officinale)和溫州鐵皮石斛(D.officinale)。齊云山石斛是指原產(chǎn)自安徽省黃山市休寧縣齊云山野生的石斛。齊云山石斛材料采自黃山市皖鄉(xiāng)農(nóng)業(yè)科技有限公司齊云山石斛種植基地。該公司將休寧縣齊云山石壁野生的石斛采集進行快繁栽培所得。六安鐵皮石斛和溫州鐵皮石斛指安徽省六安市和浙江省溫州市兩產(chǎn)地的鐵皮石斛。

1.2 方法

1.2.1 藥材粉末的制備

采集新鮮樣品，洗凈、烘干后并分離出根、莖、葉，分別剪成小段，置于60 ℃干燥箱內(nèi)烘至恒重，用中藥粉碎機粉碎。過200目篩得到樣品粉末后分裝于不同的試管中并標記。齊云山石斛的根、莖、葉分別標記為a、b、c；六安鐵皮石斛的根、莖、葉分別標記為d、e、f；溫州鐵皮石斛的根、莖、葉分別標記為g、h、i。

1.2.2 紅外光譜的預處理

首先將溴化鉀粉末置于瑪瑙研缽中充分研磨并壓片，作為空白對照。然后取不同產(chǎn)地石斛的不同器官粉末樣品與溴化鉀粉末以2∶100的比例放入瑪瑙研缽中攪磨均勻，并壓片。最后將所有壓片置于傅里葉紅外光譜儀上掃描，進行壓片測試，光譜掃描范圍400～4 000 cm-1，儀器分辨率4 cm-1，掃描次數(shù)16次，得到紅外光譜圖。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 8.0軟件，對所得的數(shù)據(jù)進行處理，繪制紅外光譜圖進行分析。

2 結果與分析

2.1 齊云山石斛根、莖、葉的紅外光譜圖比較

石斛的藥用部位主要是莖，但是由于市場石斛資源稀缺，有學者提出將石斛整株作為藥用的觀點，以減緩市場供不應求的壓力[6,24]。圖1為齊云山石斛根、莖、葉3個部位的紅外光譜圖。

a：齊云山石斛根；b：齊云山石斛莖；c：齊云山石斛葉。圖1 齊云山石斛根、莖、葉的紅外光譜圖Figure 1 Infrared spectra of roots, stems and leaves ofDendrobium nobile from Qiyun Mountain

從圖1可以看出，齊云山石斛根、莖、葉的紅外光譜圖均出現(xiàn)多個吸收峰，整體上基本相似。根、莖、葉3個營養(yǎng)器官主要吸收峰分別為3 424、2 921、1 629和1 079 cm-1；3 416、2 920、1 735、1 630和1 028 cm-1；3 426、2 920、2 853和1 736 cm-1等。通過各器官紅外光譜圖分析，其主要特征如下所述。

多糖物質的振動帶為1 200～700 cm-1、指紋振動區(qū)為950～600 cm-1。在1 200～900 cm-1光譜范圍內(nèi)，齊云山石斛的根、莖出現(xiàn)階梯連續(xù)遞增的峰：其中根的紅外光譜圖中出現(xiàn)2個峰，只有1個強峰；莖的紅外光譜圖由3個小型吸收峰組成，最強峰與附近的峰形成強雙峰，左側有1個肩峰；葉的紅外光譜圖中也出現(xiàn)了3個峰，但不呈連續(xù)遞增趨勢，而是最強峰與附近的峰形成強雙峰。在950～600 cm-1光譜范圍內(nèi)，齊云山石斛根、莖、葉3個部位器官均有屬于C-O-C和CH2振動的吸收峰出現(xiàn)。1 150 cm-1附近的吸收峰歸屬為纖維素葡萄糖物質的C-O振動[24]；830 cm-1附近的多個特征峰均為弱吸收峰，歸屬為C-O-C不對稱面外伸縮振動和CH2非平面搖擺振動的特征峰[25]；760 cm-1附近的吸收峰主要為糖環(huán)骨架伸縮振動的指紋峰。

羰基、酰胺和芳環(huán)的振動帶范圍為1 750～1 400 cm-1。1 750～1 700 cm-1是羰基振動頻區(qū)；1 655～1 590 cm-1是N-H彎曲振動頻區(qū)；1 420～1 400 cm-1是酰胺I帶振動頻區(qū)；1 730 cm-1附近的吸收峰主要為酯羰基振動；1 510 cm-1附近的吸收峰主要為芳環(huán)吸收峰。在3 050～2 850 cm-1和1 465～1 340 cm-1光譜范圍內(nèi)，齊云山石斛根、莖、葉3個器官均出現(xiàn)吸收峰，說明其均含有烷烴基，又因在1 735 cm-1附近的吸收峰屬于酯羰基振動吸收，所以三者都含有烷烴醛。在1 655～1 590 cm-1頻區(qū)內(nèi)，齊云山石斛的根、莖、葉均出現(xiàn)吸收峰，但在1 510 cm-1附近，只有其根、葉出現(xiàn)吸收峰，其中根的吸收峰不明顯、葉的吸收峰較為明顯，而莖沒有出現(xiàn)吸收峰，有肩峰，說明齊云山石斛的根和葉中含有芳香類物質，莖中沒有。在1 420～1 400 cm-1頻區(qū)內(nèi)，出現(xiàn)的吸收峰為酰胺I帶振動吸收；但1 540 cm-1附近沒有吸收峰，因此齊云山石斛根、莖、葉中的酰胺大部分為叔酰胺[26]。蛋白質、酯類和多糖類的混合振動帶范圍為1 500～1 200 cm-1。1 500～1 350 cm-1是C-H彎曲振動頻區(qū)；1 465～1 340 cm-1是烷烴的特征峰。1 420 cm-1、1 350 cm-1附近的吸收峰分別為CH2剪切振動、CH3對稱式剪切振動。1 320 cm-1附近的吸收峰為O-H面內(nèi)彎曲振動，是紫丁香基的特征峰；1 240 cm-1附近吸收峰為木質素中的苯羥基C-O伸縮振動。3個器官在1 320 cm-1、1 250 cm-1和1 150 cm-1附近均出現(xiàn)了吸收峰，說明齊云山石斛的根、莖、葉中均含有紫丁香基、木質素和纖維素。

光譜特征表明：齊云山石斛根、莖、葉3個器官在4 000～900 cm-1頻區(qū)內(nèi)紅外光譜大體相似，三者所含的化學成分中均有酯類、黃酮類、叔酰胺、蛋白質、木質素以及包含纖維素在內(nèi)的多糖類物質等。在900～500 cm-1指紋區(qū)內(nèi)，莖、葉的紅外光譜相似度較高，根的紅外光譜與二者區(qū)別較大，說明齊云山石斛莖、葉中所含的化學組成成分的含量相似度較根高，因此，齊云山石斛的葉可作為其莖的替代品入藥。同時，比較三者成分含量的異同，紅外光譜技術可以快速鑒定石斛莖的真?zhèn)危乐故袌龀霈F(xiàn)以根、葉混淆莖的情況。

2.2 安徽齊云山石斛與六安鐵皮石斛、溫州鐵皮石斛的紅外光譜圖的差異分析

2.2.1 根的紅外光譜圖比較分析

圖2表明，齊云山石斛、六安鐵皮石斛和溫州鐵皮石斛根的紅外光譜在4 000～1 500 cm-1光譜范圍內(nèi)相似度較高，但在1 500～500 cm-1光譜范圍內(nèi)相差較大。1 150 cm-1附近的吸收峰歸屬為纖維素葡萄糖單元的振動；1 150～950 cm-1頻區(qū)內(nèi)的吸收峰歸屬為C-O伸縮振動[27-28]。

a：齊云山石斛的根；d：六安鐵皮石斛的根；g：溫州鐵皮石斛的根。圖2 齊云山石斛、六安鐵皮石斛、溫州鐵皮石斛的根的紅外光譜圖Figure 2 Infrared spectra of roots of Dendrobium nobile from QiyunMountain, Dendrobium officinale from Lu’an and Wenzhou

在3 420 cm-1附近，3個產(chǎn)地石斛根的紅外圖譜均出現(xiàn)了屬于酚類分子羥基伸縮振動的吸收峰，強度較大且峰形較寬，但六安鐵皮石斛根的吸收峰沒有另外兩者寬。在3 050～2 850 cm-1頻區(qū)內(nèi)，三者均出現(xiàn)了屬于CH2不對稱伸縮振動的吸收峰(2 920 cm-1附近均有1個吸收峰)；并且在1 465～1 340 cm-1頻區(qū)內(nèi)，也出現(xiàn)了屬于C-H彎曲振動的吸收峰，說明三者都含有烷烴官能團；又根據(jù)1 735 cm-1附近出現(xiàn)的酯羰基振動吸收峰，表明3個產(chǎn)地石斛的根均含有烷烴醛。在1 655～1 400 cm-1頻區(qū)內(nèi)，出現(xiàn)的多個吸收峰為酰胺I帶振動吸收峰，但由于1 540 cm-1附近沒有吸收峰存在，結果表明酰胺大多為叔酰胺。在1 500～1 200 cm-1頻區(qū)內(nèi)出現(xiàn)4個吸收峰，前兩者是C-H彎曲振動吸收峰，后兩者分別是紫丁香基的特征峰、木質素中苯羥基C-O伸縮振動吸收峰；并根據(jù)1 510 cm-1附近的吸收峰，可知三者均含有芳香類物質(六安鐵皮石斛根的吸收峰最明顯，齊云山石斛根的吸收峰不明顯)[29-30]。在1 300～500 cm-1頻區(qū)內(nèi)，三者紅外光譜區(qū)別顯著，其中六安鐵皮石斛與溫州鐵皮石斛根的紅外光譜圖相似度相對較高。

光譜特征表明，齊云山石斛、六安鐵皮石斛和溫州鐵皮石斛根的紅外光譜在官能團區(qū)大體相同，均含有酯類、蛋白質、黃酮類、叔酰胺、木質素以及包含纖維素在內(nèi)的多糖類物質等，但各化學成分的含量不完全相同。而在指紋區(qū)差別較大，齊云山石斛根的吸收峰更明顯，六安鐵皮石斛與溫州鐵皮石斛根的紅外光譜區(qū)別較小，兩者相似度最高。所以3個產(chǎn)地石斛根所含化學成分相似，但仍有些內(nèi)含物質組成成分存在差異。

2.2.2 莖的紅外光譜圖比較分析

圖3為3處不同產(chǎn)地石斛莖的紅外光譜圖。從圖3可以看出，3個產(chǎn)地石斛莖的紅外光譜在3 420 cm-1處均有一個較寬的O-H伸縮振動吸收峰，強度較大，但寬度不同，六安鐵皮石斛莖的吸收峰較另外兩者寬。在3 050～ 2 850 cm-1頻區(qū)內(nèi)，三者均有吸收峰，且在2 920 cm-1附近均有1個吸收峰。

b：齊云山石斛的莖；e：六安鐵皮石斛的莖；h：溫州鐵皮石斛的莖。圖3 齊云山石斛、六安鐵皮石斛和溫州鐵皮石斛的莖的紅外光譜圖Figure 3 Infrared spectra of stems of Dendrobium nobile from QiyunMountain, Dendrobium officinale fromLu’an and Wenzhou

在1 465～1 340 cm-1頻區(qū)內(nèi)，出現(xiàn)了C-H彎曲振動吸收峰，說明含有烷烴官能團；又因在1 735 cm-1附近有酯羰基振動吸收峰，因此3個產(chǎn)地石斛莖中均含有烷烴醛。1 655～1 400 cm-1頻區(qū)內(nèi)為酰胺I帶振動吸收峰，且1540 cm-1附近沒有吸收峰存在，表明酰胺大多為叔酰胺。1 510 cm-1附近，僅溫州鐵皮石斛的莖出現(xiàn)吸收峰，說明只有溫州鐵皮石斛莖中含有芳香類物質。在1 500～1 200 cm-1頻區(qū)內(nèi)出現(xiàn)的4個吸收峰，歸屬為C-H彎曲振動、紫丁香基振動以及木質素中苯羥基中C-O伸縮振動。在1 200～900 cm-1頻區(qū)內(nèi)，3個產(chǎn)地石斛莖的紅外圖譜左側均有1個肩峰，其中六安鐵皮石斛、溫州鐵皮石斛莖的紅外光譜出現(xiàn)了3個吸收峰，其中2個形成強雙峰；且溫州鐵皮石斛莖的紅外光譜呈階梯連續(xù)遞增；而齊云山石斛莖的紅外光譜出現(xiàn)了2個吸收峰。在1 300～500 cm-1頻區(qū)內(nèi)，齊云山石斛莖的紅外光譜與六安鐵皮石斛莖、溫州鐵皮石斛莖的紅外光譜有明顯區(qū)別。

光譜特征表明：齊云山石斛、六安鐵皮石斛和溫州鐵皮石斛莖的紅外光譜在官能團區(qū)大體相同，均含有酯類、蛋白質、黃酮類、叔酰胺、木質素以及包含纖維素在內(nèi)的多糖類物質等，但各成分的含量高低存在差異。在指紋區(qū)三者具有明顯區(qū)別，溫州鐵皮石斛莖的吸收峰較齊云山石斛、六安鐵皮石斛莖的吸收峰多，說明其成分更復雜，如溫州鐵皮石斛的莖中含有芳香類物質，其他2個產(chǎn)地石斛的莖中不含有芳香類物質。

2.2.3 葉的紅外光譜圖比較分析

3處不同產(chǎn)地石斛葉的紅外光譜如圖4所示。從圖4可以看出，三者在3 420 cm-1附近均有1個峰強較強且吸收峰較寬的峰，歸屬為O-H伸縮振動，但三者吸收峰的寬度不同，六安鐵皮石斛葉的吸收峰較另外兩者寬。在3 050～2 850 cm-1頻區(qū)內(nèi)，三者有吸收峰，且在2 920 cm-1附近均有1個吸收峰；1 465～1 340 cm-1頻區(qū)內(nèi)，出現(xiàn)了屬于C-H彎曲振動的吸收峰，說明三者含有烷烴官能團。在1 740 cm-1附近有屬于酯羰基振動的吸收峰，表明三者葉中均含有烷烴醛。

c：齊云山石斛的葉；f：六安鐵皮石斛的葉；i：溫州鐵皮石斛的葉。圖4 齊云山石斛、六安鐵皮石斛和溫州鐵皮石斛的葉的紅外光譜圖Figure 4 Infrared spectra of leaves of Dendrobium nobile from Qiyun Mountain, Dendrobium officinale from Lu’an and Wenzhou

在1 655～1 400 cm-1頻區(qū)內(nèi)，出現(xiàn)了多個歸屬為酰胺I帶振動的吸收峰，但在1 540 cm-1附近沒有吸收峰，表明三者含有的酰胺大多為叔酰胺。在1 510 cm-1附近，僅齊云山石斛葉具有吸收峰，而溫州鐵皮石斛和六安鐵皮石斛的葉沒有吸收峰，只有肩峰，說明齊云山石斛的葉中含有芳香類物質，其他2個產(chǎn)地石斛的葉不含有。在1 500～1 200 cm-1頻區(qū)內(nèi)，三者紅外光譜區(qū)別較大。齊云山石斛葉有4個吸收峰，六安鐵皮石斛葉和溫州鐵皮石斛葉只有3個吸收峰，但吸收峰的類型相同，歸屬為C-H彎曲振動、紫丁香基振動以及木質素中苯羥基中C-O伸縮振動。在1 200～900 cm-1頻區(qū)內(nèi)，3個產(chǎn)地石斛葉的紅外光譜差異明顯，齊云山石斛葉有3個吸收峰，最強峰位于中間，與右側峰形成強雙峰；六安鐵皮石斛葉有4個吸收峰，最強吸收峰為第3個吸收峰；溫州鐵皮石斛葉有3個吸收峰，最強峰位于中間，其右側有一處肩峰。1 150 cm-1附近，三者均出現(xiàn)歸屬為纖維素葡萄糖單元振動的吸收峰；1 150～950 cm-1頻區(qū)內(nèi)的吸收峰歸屬為C-O伸縮振動；在900～500 cm-1頻區(qū)，三者紅外光譜也存在差異。

光譜特征表明，齊云山石斛、六安鐵皮石斛、溫州鐵皮石斛的葉紅外光譜在官能團區(qū)大體相同，均含有酯類、蛋白質、黃酮類、叔酰胺、木質素以及包含纖維素在內(nèi)的多糖類物質等，但其物質的含量不完全相同。指紋區(qū)內(nèi)3個產(chǎn)地石斛葉的紅外光譜圖區(qū)別較大，說明3個產(chǎn)地的石斛葉在組成物質方面不盡相同，其中齊云山石斛葉中含有芳香類物質，而六安鐵皮石斛和溫州鐵皮石斛的葉不含有芳香類物質。

3 結論

利用傅里葉紅外光譜法對齊云山石斛、六安鐵皮石斛和溫州鐵皮石斛根、莖、葉的紅外圖譜進行分析。結果表明，齊云山石斛的不同器官根、莖、葉的紅外光譜在官能團區(qū)極為相似。3個器官所含的主要化學成分比較相近，為酯類、蛋白質、黃酮類、叔酰胺、木質素以及包含纖維素在內(nèi)的多糖類物質等，但各物質含量存在一定差異。此外，齊云山石斛根和葉中均含有芳香類物質，而莖中沒有。齊云山石斛葉與莖的紅外光譜相似度較高，其葉可成為莖的藥用替代品。從3個不同產(chǎn)地、不同品種的根、莖、葉的紅外光譜實驗發(fā)現(xiàn)：3個產(chǎn)地石斛具有明顯的紅外“指紋”特征吸收峰。3個產(chǎn)地石斛所含的化學成分基本相同，主要為酯類、蛋白質、黃酮類、叔酰胺、木質素以及包含纖維素在內(nèi)的多糖類物質等，但齊云山石斛莖和溫州鐵皮石斛葉中不含芳香類物質，六安鐵皮石斛莖、葉中均不含芳香類物質。因此，通過傅里葉紅外光譜法可有效鑒定石斛不同種質資源間的化學成分差異。

致謝：本文得到美國南達科他州立大學自然資源管理系徐嵐教授的指導和幫助。