果桑菌核病防治用藥對(duì)家蠶生長(zhǎng)發(fā)育的影響

吳 凡， 李德臣， 賀 真， 陳登松

(1. 湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 經(jīng)濟(jì)作物研究所，武漢 430070；2. 湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 果樹茶葉研究所，武漢 430070)

桑樹(MorusalbaL.)是重要經(jīng)濟(jì)樹種之一。桑葉是唯一能使家蠶形成經(jīng)濟(jì)效益的天然飼料，而桑果(即桑椹)不僅可作水果鮮吃，還可加工成飲料、果酒與調(diào)味品等，含豐富的維生素和藥用成分，對(duì)人體健康大有裨益[1-4]。果桑菌核病是一種由核盤菌(ScleritiniasclerotioumLib.)等真菌引起的疾病[5]，能夠危害包括果桑在內(nèi)的75科278屬408種或亞種植物[6]，如油菜、煙草、番茄、大豆、花生、向日葵等，也是果桑生產(chǎn)上亟待解決的主要病害。果桑菌核病一旦發(fā)生，輕則減產(chǎn)30%～50%，重則可達(dá)80%，甚至絕收，嚴(yán)重影響果桑栽植的經(jīng)濟(jì)效益[7]?；瘜W(xué)防治是目前果桑生產(chǎn)中防治桑椹菌核病最常用的方法之一[8-10]，而化學(xué)防治常用農(nóng)藥主要有多菌靈、甲基硫菌靈和腐霉利。

在蠶桑生產(chǎn)上，要實(shí)現(xiàn)桑園比較效益的大幅度提高，需要大力發(fā)展果葉兼用桑園，春季進(jìn)行桑果采摘和養(yǎng)蠶，秋季進(jìn)行養(yǎng)蠶，實(shí)現(xiàn)蠶繭和桑果的雙豐收，提高畝桑生產(chǎn)效益，培育蠶桑產(chǎn)業(yè)新業(yè)態(tài)。因此，本文探討了果桑菌核病防治常用藥多菌靈、甲基硫菌靈和腐霉利對(duì)家蠶生長(zhǎng)發(fā)育的影響，為果葉兼用桑園中果桑菌核病的防治和養(yǎng)蠶用桑安全提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試家蠶品種和藥劑

供試家蠶品種為楚風(fēng)×漢韻，由湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所提供。蠶卵采用二段催青法進(jìn)行催青，幼蟲在26 ℃～29 ℃，濕度75%的條件下用桑葉飼育。供試藥劑為多菌靈可濕性粉劑(天津市漢邦植物保護(hù)劑有限責(zé)任公司，有效成分含量80%，簡(jiǎn)稱：多菌靈)、腐霉利可濕性粉劑(日本住友化學(xué)株式會(huì)社，有效成分含量70%，簡(jiǎn)稱：腐霉利)、甲基硫菌靈可濕性粉劑(江蘇龍燈化學(xué)有限公司，簡(jiǎn)稱：甲基硫菌靈)。添食濃度即為大田用藥濃度，即分別配制成5.35 mg/mL的多菌靈藥液、10.65 mg/mL的腐霉利藥液和10.65 mg/mL的甲基硫菌靈藥液作為添食藥液，添食清水作為對(duì)照，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 添食試驗(yàn)

采摘桑樹盛產(chǎn)期的第3～4位葉，除去表面粉塵等雜物，挑選大小均勻的桑葉，用打孔器將桑葉打成直徑為3 cm的圓片，然后將圓形桑葉浸于不同的供試藥液中10 s，取出自然晾干。挑選健康且發(fā)育較為一致的二齡起蠶進(jìn)行試驗(yàn)，每種藥液處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每重復(fù)30頭家蠶，添食清水作為對(duì)照，從二齡起蠶開始添食，第1次添食給予桑葉10片，每日給桑3次，隨著齡期的增長(zhǎng)，給予適量、適齡、適熟的桑葉，以每次給桑前剩余少量桑為標(biāo)準(zhǔn)，每餐添食，至家蠶上蔟，處理組和對(duì)照組在相同的環(huán)境條件下飼育。觀察不同藥液添食處理后，家蠶的生長(zhǎng)發(fā)育情況，記錄每齡齡期經(jīng)過、眠起情況、五齡盛食期家蠶體重，并在上蔟7 d后調(diào)查全繭量、繭層量、繭層率和死籠率。

1.3 家蠶腸內(nèi)抗氧化酶活性的測(cè)定

將二齡起蠶按1.2方法添食不同藥液，至五齡第 4天，各處理隨機(jī)取幼蟲各6頭，在冰水浴條件下解剖獲取中腸，用生理鹽水洗凈，濾紙吸干后稱取100 mg。按1∶ 9(kg/L)的比例在中腸中加入預(yù)冷的生理鹽水(0.86%)，冰水浴條件下機(jī)械勻漿，4 ℃ 3 000 r/min離心10 min后，取上清液，制備成10%的組織勻漿液。勻漿液中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)比色法；家蠶中腸組織中過氧化氫酶(CAT)的活性測(cè)定采用可見光法；過氧化物酶(POD)活性的測(cè)定采用比色法。蛋白含量測(cè)定試劑盒以及CAT和POD活性測(cè)定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，具體操作按照說明書進(jìn)行。每組樣品不少于3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。其中，每毫克組織蛋白每秒鐘分解1 μmol的H2O2的量為1個(gè)CAT酶活力單位，在37 ℃條件下，每毫克組織蛋白每分鐘催化1 μg底物的酶量定位為1個(gè)POD酶活力單位。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有數(shù)據(jù)均采用GraphPad Prism 8軟件進(jìn)行處理，各處理組與對(duì)照組(清水)之間的差異采用student’st-test進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，表和圖的數(shù)值均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 藥物添食對(duì)家蠶生長(zhǎng)發(fā)育的影響

添食甲基硫菌靈可濕性粉劑的家蠶，幼蟲食欲明顯減弱，從添食起，一直維持二齡起蠶狀態(tài)，發(fā)育停滯不前，并在添食10 d左右陸續(xù)死亡，死亡時(shí)維持二齡起蠶體態(tài)，不吐水，軟化而死。添食多菌靈可濕性粉劑和腐霉利可濕性粉劑的家蠶可正常發(fā)育至上蔟結(jié)繭，但是與對(duì)照之間的發(fā)育有開差，但是開差不大。

在五齡第4天，從每處理的3個(gè)生物學(xué)重復(fù)中隨機(jī)稱取10頭蠶，求平均每頭蠶的體重。結(jié)果見表1。除添食甲基硫菌靈不能正常發(fā)育外，添食多菌靈和腐霉利可濕性粉劑的家蠶體重均變小，其中，添食多菌靈家蠶的體重平均為2.588 g，達(dá)到對(duì)照的90.02%，添食腐霉利家蠶的體重為2.543 g，只達(dá)到對(duì)照的88.45%，兩種處理家蠶的體重與對(duì)照均達(dá)到顯著性差異。

表1 藥物添食對(duì)五齡第4天家蠶體重的影響Table 1 The effect of drug supplementation on the weight of silkworm on the fourth day of fifth instar

2.2 藥物添食對(duì)家蠶齡期經(jīng)過的影響

從二齡起蠶開始，持續(xù)添食對(duì)各齡幼蟲齡期經(jīng)過的影響見表2。添食甲基硫菌靈可濕性粉劑對(duì)家蠶的齡期經(jīng)過的影響較大，使家蠶的生長(zhǎng)發(fā)育停滯，添食多菌靈可濕性粉劑的家蠶齡期經(jīng)過縮短，添食腐霉利可濕性粉劑的家蠶，齡期經(jīng)過增加。二齡經(jīng)過，家蠶添食多菌靈后比對(duì)照短3 h，添食腐霉利比對(duì)照延長(zhǎng)5 h，與對(duì)照相比均達(dá)到顯著性差異；三齡經(jīng)過，添食腐霉利的與對(duì)照相差不大，但是添食多菌靈的比對(duì)照顯著縮短；四齡和五齡經(jīng)過，添食腐霉利的比對(duì)照顯著增加，添食多菌靈的比對(duì)照顯著縮短，均達(dá)到顯著性差異。

表2 自二齡起蠶開始添食藥物對(duì)二至五齡幼蟲齡期經(jīng)過的影響Table 2 The effect of silkworms starting to add drugs since the second instar on the passage of 2-5 instar larvae

2.3 藥物添食對(duì)家蠶繭質(zhì)成績(jī)的影響

在上蔟后7 d采繭，對(duì)繭質(zhì)成績(jī)進(jìn)行調(diào)查，結(jié)果見表3。添食多菌靈和腐霉利對(duì)家蠶的繭質(zhì)成績(jī)?cè)斐梢欢ǖ挠绊?，添食多菌靈后，家蠶的全繭量、繭層量分別為1.39 g、0.316 g，繭層率22.73%，與對(duì)照相比均降低，死籠率為6.02%，比對(duì)照增加了4.27%，其中全繭量、繭層量、死籠率與對(duì)照相比達(dá)到顯著性差異。添食腐霉利后全繭量為1.77 g，比對(duì)照增加了2.31個(gè)百分點(diǎn)，繭層量和繭層率分別為0.392 g和22.15%，與對(duì)照相比均降低，死籠率為13.16%，相比對(duì)照增加了11.41%，其中繭層量、繭層率、死籠率與對(duì)照相比達(dá)到了顯著性差異。

表3 藥物添食對(duì)家蠶繭質(zhì)成績(jī)的影響Table 3 The effect of drug supplementation on the quality of silkworm cocoon

2.4 藥物添食對(duì)家蠶腸抗氧化酶活性的影響

自二齡起蠶持續(xù)添食多菌靈和腐霉利，測(cè)定五齡第4天幼蟲腸內(nèi)POD 酶、CAT 酶活性變化，結(jié)果如圖1所示。由圖1(a)可知，持續(xù)添食多菌靈和腐霉利，五齡第4天幼蟲腸內(nèi)CAT酶活力均比對(duì)照升高，但是差異不顯著(P>0.05)；由圖1(b)可知，五齡第4天幼蟲腸內(nèi)POD酶活力均比對(duì)照升高，達(dá)到顯著性差異(多菌靈P=0.001 9，腐霉利P<0.001)。

**表示與對(duì)照組相比差異顯著。圖1 自二齡起蠶持續(xù)添食多菌靈和腐霉利后五齡第4天幼蟲中腸內(nèi)CAT(a)和POD(b)的酶活力變化Figure 1 Variations of CAT(a)and POD(b)activity in midgut of Bombyx mori larvae on day 4 of the 5th instar after treating the 2rd instar newly exuviated silkworm larvae continuously with carbendazim and procymidone

3 討論與結(jié)論

家蠶是重要的經(jīng)濟(jì)型昆蟲，是進(jìn)行鱗翅目昆蟲研究的模式生物，對(duì)環(huán)境比較敏感，尤其對(duì)農(nóng)藥等的適應(yīng)性很弱[11]，每年因?yàn)檗r(nóng)藥中毒造成蠶繭產(chǎn)量的大量減產(chǎn)，蠶繭損失在30%以上[12]，蠶農(nóng)經(jīng)濟(jì)損失巨大，已經(jīng)成為制約蠶業(yè)發(fā)展的重要因素之一。果桑菌核病的防治主要在春季發(fā)芽開花期，采用單一噴施多菌靈、甲基硫菌靈和腐霉利或者是幾種藥物混合噴施的方法進(jìn)行防治，如果用藥不當(dāng)，很容易引起春蠶中毒，造成蠶農(nóng)經(jīng)濟(jì)損失。因此，如何在保證桑果豐收的前提下，維護(hù)家蠶飼養(yǎng)的安全成為業(yè)內(nèi)專家亟需解決的問題。研究了3種常用的果桑菌核病防治用藥對(duì)家蠶生長(zhǎng)發(fā)育的影響，發(fā)現(xiàn)甲基硫菌靈對(duì)家蠶的生長(zhǎng)發(fā)育影響最大，使家蠶不能完成世代發(fā)育，多菌靈和腐霉利對(duì)家蠶的生長(zhǎng)發(fā)育、五齡盛食期的幼蟲體重和繭質(zhì)成績(jī)都有所影響，但是能完成世代發(fā)育，表明3種菌核病防治用藥中，甲基硫菌靈對(duì)家蠶的毒性最大，多菌靈和腐霉利雖然對(duì)家蠶有一定的毒性，但是家蠶可上蔟結(jié)繭，因此在果葉兼用桑園菌核病的防治用藥中，應(yīng)禁止使用甲基硫菌靈，可用多菌靈和腐霉利進(jìn)行防治，可在保證桑果豐收的同時(shí)，盡量減少化學(xué)防治用藥對(duì)家蠶的危害。謝道燕等[13]對(duì)家蠶添食低濃度的草甘膦和草銨膦這2 種桑園常用除草劑，發(fā)現(xiàn)添食后，雖未直接造成家蠶的死亡，但是對(duì)家蠶的生長(zhǎng)發(fā)育和產(chǎn)繭量產(chǎn)生了一定的影響，認(rèn)為農(nóng)藥對(duì)家蠶的殘毒性應(yīng)該以家蠶是否異常為標(biāo)準(zhǔn)。以這個(gè)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判斷，多菌靈和腐霉利對(duì)家蠶還是有一定的殘毒性，對(duì)果葉兼用桑園菌核病的防治最好采用生物防治的方法。袁紅霞等[14-15]分別研究了辛基酚和壬基酚對(duì)家蠶生長(zhǎng)發(fā)育的影響，發(fā)現(xiàn)辛基酚和壬基酚都對(duì)家蠶生長(zhǎng)發(fā)育毒性影響有顯著的濃度效應(yīng)和時(shí)間效應(yīng)。韋潤宇[16]對(duì)二齡起蠶添食噻蟲啉、噻蟲胺，發(fā)現(xiàn)在較高濃度時(shí)家蠶的全繭量、繭層量和繭層率下降，死籠率上升，較低濃度時(shí)對(duì)家蠶的生長(zhǎng)發(fā)育和繭質(zhì)成績(jī)有一定的促進(jìn)作用。王安皆等[17研究了桑葉噴施多菌靈對(duì)家蠶生長(zhǎng)發(fā)育的影響，發(fā)現(xiàn)家蠶食桑量減少，體重下降，全繭量、繭層率和產(chǎn)卵量也隨著濃度增大而降低。

昆蟲體內(nèi)有很多抗氧化酶，如 POD、CAT 與谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)等，這些抗氧化酶可以增強(qiáng)昆蟲對(duì)不良環(huán)境脅迫的抵抗能力[18]。POD是昆蟲抗氧化酶系統(tǒng)的重要組成部分，該酶是以鐵卟啉為輔基，以H2O2作為受體，可催化多種氧化產(chǎn)物，可清除體內(nèi)多余活性氧和氧化產(chǎn)物的毒性[19]。CAT 與GSH-Px主要催化過氧化氫分解為水和分子氧，以避免過氧化氫在昆蟲體內(nèi)大量積累造成細(xì)胞氧化損傷，進(jìn)而保護(hù)昆蟲的正常代謝活動(dòng)[20]。研究表明從二齡起蠶開始，對(duì)家蠶添食多菌靈和腐霉利可濕性粉劑，五齡4 d的家蠶體內(nèi)CAT酶和POD酶活力均升高，表明家蠶為防止農(nóng)藥中毒，通過POD和CAT等抗氧化解毒酶的聯(lián)合作用，提高了蠶體清除自由基的能力，盡可能的減輕農(nóng)藥中毒對(duì)機(jī)體的損傷。袁紅霞[21]和張蒙蒙[22]等的研究結(jié)果也說明了這一點(diǎn)，這可能是家蠶對(duì)不良環(huán)境條件的一種適應(yīng)性反應(yīng)。但是多菌靈、甲基硫菌靈和腐霉利對(duì)家蠶生長(zhǎng)發(fā)育影響的具體分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究，而且甲基硫菌靈對(duì)家蠶的致死機(jī)制也有待進(jìn)一步探討。