NADPH依賴型谷氨酸脫氫酶的輔酶特異性改造

陸利兵， 周海勝， 吳堅平， 楊立榮

(浙江大學 化學工程與生物工程學院 生物工程研究所，杭州 310027)

非蛋白質氨基酸作為手性結構單元，可用于制備多種藥物分子，在醫(yī)藥、農藥、食品等行業(yè)中發(fā)揮著重要作用[1-6]。相比化學合成和手性拆分，酶催化不對稱合成制備手性非蛋白質氨基酸，具有立體選擇性嚴格、反應條件溫和以及過程綠色等優(yōu)點，是一種潛在的優(yōu)勢方法[7-12]。利用谷氨酸脫氫酶(glutamate dehydrogenase，GDH，EC 1.4.1.2-1.4.1.4)催化酮酸生成相應的非蛋白質氨基酸具有過程簡單、原料轉化率高、底物譜廣等優(yōu)勢[13-16]。但目前開發(fā)應用的谷氨酸脫氫酶基本都是NADPH輔酶依賴型，相對于輔酶NADH，NADPH存在價格高昂、穩(wěn)定性差等劣勢，限制了谷氨酸脫氫酶的應用。

將谷氨酸脫氫酶從NADPH依賴性改造為NADH依賴性，能顯著降低過程成本，提其高工業(yè)化應用前景。雖然NADPH依賴型谷氨酸脫氫酶輔酶特異性的分子改造未見報道，但其他煙酰胺輔酶依賴型酶蛋白的輔酶特異性改造已有很多成功的實例[17-19]。1990年，Scrutton等[20]首次報道了運用于輔酶特異性改造的蛋白質工程。諾貝爾獎得主Arnold等[21]設計了一個輔酶特異性改造的在線設計工具——cofactor specificity reversal-structural analysis and library design (CSR-SALAD)，實現(xiàn)了多種氧化還原酶的輔酶特異性改變。華東理工大學的許建和團隊在此基礎上建立了Cofactor specificity reversal: small-and-smart library design (CSR-SaSLiD)策略，成功實現(xiàn)了7β-羥基類固醇脫氫酶從NADPH特異性到NADH特異性的改變，并應用于熊去氧膽酸的生產[22]。

本實驗室先前對來源于Pseudomonasputida的NADPH特異性的谷氨酸脫氫酶(PpGDH)進行了分子改造，拓寬了其底物譜[13-14,23]。本研究擬對PpGDH進行輔酶特異性改造，以獲得NADH依賴型突變體；并嘗試通過分子結構解析和動力學參數(shù)測定，闡明輔酶特異性改變的機理。

1 材料與方法

1.1 菌株與培養(yǎng)基

菌株：來源于Pseudomonasputida的谷氨酸脫氫酶基因(NCBI登錄號為NP_742836.1)構建于表達載體pET-28a(+)，其表達宿主菌株為E.coliBL21(DE3)，由本實驗室保藏。LB液體培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉5，胰蛋白胨10，NaCl 10，調pH值至7.0，固體培養(yǎng)基添加2%的瓊脂粉，各培養(yǎng)基分別添加終濃度為50 mg/L的卡那霉素。

1.2 試劑

2-羰基-4-(羥基甲基膦?；?丁酸(PPO)由本實驗室合成；L-草銨膦購自阿拉丁試劑(上海)有限公司；煙酰胺類輔酶(NAD+，NADP+，NADH，NADPH)購自深圳邦泰生物工程有限公司；卡那霉素、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、瓊脂粉購自北京鼎國生物技術有限責任公司；PrimeSTAR?MAX DNA Polymerase購自大連Takara公司；質粒DNA提取試劑盒購自杭州Axygen公司；5×Cell Buffer、Exnase II、Fast Digest DPNI購自美國Thermo Fisher Scientific公司；α-酮戊二酸、苯乙醛酸、丙酮酸、3-甲基-2-氧丁酸、4-甲基-2-氧戊酸、三甲基丙酮酸購自阿拉丁試劑(上海)有限公司；2-氧代戊酸、3-甲基-2-氧戊酸、2-氧基-4-苯基丁酸購自梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司；其余試劑為國產分析純。

1.3 同源重組及高通量篩選

通過質粒DNA提取試劑盒提取含有PpGDH基因的質粒pET-28a(+)。以提取的質粒為模板，以5′-gcg-gctcggactttgacccgRWKggcaagagcgacgccgaagt-3′(K137X-F)、5′-gcgtcccactgggcgtcggtcagcc cggcttctgcatacaaggtaccttcGYY-MTCagacagcgagatcaccttgc-3′(D264X/S265X/R293X-R)為引物擴增線性化短片段；以5′-cgggtcaaagtccgagccgcccttgccgccgcccatggg-3′(K137X-R)、5′-accgacgcccagtgggacgccttgatggagctgaaaaacgtcaagcgcgga-VRKatcagcgagctggccgggcaa-3′ (D264X/S265X/R293X-F)為引物擴增線性化長片段，長片段經消化后與短片段進行同源重組(表1)，重組后的產物轉入表達宿主E.coliBL21(DE3)中，獲得相應的突變庫文庫。以PPO為底物，通過以NADH減少量為基準的高通量方法進行初篩，通過HPLC測定產品L-草銨膦的生成量進行復篩。引物合成及DNA測序由杭州擎科梓熙生物技術有限公司完成。

表1 同源重組反應體系

1.4 重組GDH的表達、純化

表達重組GDH的大腸桿菌在LB固體培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)過夜；挑取單菌落至LB液體培養(yǎng)基中(試管)，37 ℃培養(yǎng)7～8 h后再轉接至LB液體培養(yǎng)基中(搖瓶)，37 ℃培養(yǎng)至OD600為0.6～0.8，將溫度降至18 ℃，并加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG誘導16 h。離心收集細胞后進行蛋白純化，蛋白純化按周海勝等[24]的操作進行。

1.5 酶活測定

1.6 酶學性質研究

最適pH值及穩(wěn)定性：測定最適pH值確定范圍為3.0～10.0時，所用反應緩沖液如下：檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液(pH 3.0～6.0)，磷酸鹽緩沖液(pH 6.0～8.0)，Tris-HCl緩沖液(pH 8.0～9.0)，甘氨酸-NaOH緩沖液(pH 9.0～10.0)，其余條件與酶活檢測體系(以PPO為底物)一致，以酶活最高為100%，計算相對活力。pH穩(wěn)定性通過測定酶蛋白在不同pH緩沖液中保存24 h后剩余的酶活進行表示。

1.7 動力學參數(shù)測定

1.8 分子同源建模和分子對接

原始PpGDH的三維同源模型是谷氨酸棒狀桿菌的谷氨酸脫氫酶晶體結構(PDB ID: 5IJZ,一致率為71.4%)為模板在SWISS-MODEL服務器https:∥swissmodel.expasy.org/生成的。PpGDH突變體的結構是在同源模型的基礎上使用Accelrys Discovery Studio 2.5中的Build mutants package構建的。

分子對接是通過Discovery Studio中的CDOCKER模塊進行。受體蛋白通過去除所有束縛水分子，加入氫原子，施加CHARMm力場進行優(yōu)化；PPO分子通過施加CHARMm力場進行優(yōu)化。分子對接姿勢根據(jù)分數(shù)函數(shù)進行排序，分數(shù)函數(shù)用于預測分子在酶活性位點的結合親和性。使用Pymolwin處理復合物數(shù)據(jù)。

2 結果與分析

2.1 PpGDH的輔酶特異性改造

將PpGDH的蛋白PDB文件輸入http:∥www.che.caltech.edu/groups/fha/CSRSALAD/index.html，獲得可能改變輔酶特異性的4個位點K137、D264、S265及R293，網站建議篩選庫大小為768個單菌落[21]。為提高篩選效率，可以通過簡并密碼子策略來提高突變文庫的質量[25]。按1.3的方法以K137X-F、D264X/S265X/R293X-R為引物擴增短片段，以K137X-R、D264X/S265X/R293X-F為引物擴增長片段，將長、短片段進行同源重組，建立輔酶特異性改造突變庫。

通過對900個單菌落進行高通量初篩后獲得14個對PPO催化活力增強的轉化子，經過HPLC復篩，獲得了6個酶活提升不太明顯(<300%)的陽性突變體[圖1(a)]，以及5個酶活明顯增強的陽性突變體見圖1(b)。原始PpGDH在輔酶NADH存在的條件下對PPO幾乎沒有活力，Asp264、Arg293這兩點對PpGDH的輔酶特異性有較大影響，其中單點突變體D264V獲得的NADH酶活最大，達到140 U/L，兩點突變株D264Y/R293I酶活達到32.5 U/L。

(a)篩選獲得的6個酶活提升不明顯的突變株；(b)篩選獲得的5個酶活提升明顯的突變株。圖1 氨酸脫氫酶及突變體對PPO催化活力Figure 1 Catalytic activity of glutamate dehydrogenase and the mutant toward PPO

2.2 PpGDH-D264V動力學參數(shù)測定

為了解釋輔酶特異性改變的原因，分別測定原始PpGDH及突變體D264V對NADH及NADPH的動力學參數(shù)。如表2所示，相對于原始PpGDH，突變體D264V對NADH、NADPH的Km與kcat值發(fā)生了較為明顯的變化。D264V對NADH的催化效率(kcat/Km)較原始PpGDH提升了近9倍，對NADPH的催化效率較原始PpGDH降低了近180倍。D264V相對于原始PpGDH，對NADH的偏好性(Ratio ofkcat/Km)增強了1 607倍，表明D264V具有較為明顯的輔酶特異性改造效果。

表2 原始PpGDH及突變體對NADH和NADPH的動力學參數(shù)

2.3 PpGDH-D264V的輔酶特異性轉變的機理解析

為了解析D264V單點突變改變輔酶特異性的原因，基于DS分子對接和PYMOL作圖，分析原始PpGDH及突變體與輔酶因子(NADPH/NADH)的結合模式。由圖2(a)可知，NADPH的2′-磷酸基與鄰近殘基形成氫鍵而穩(wěn)定存在，而在圖2(c)中，NADPH的2′-磷酸基由于空間位阻和靜電排斥而降低了與突變體D264V的相互作用。Asp264突變?yōu)閂al264后，與NADH的腺苷核糖的2′-和3′-羥基形成穩(wěn)定的氫鍵,見圖2(b)和(d)。

圖2 原始PpGDH(a,b)、突變體D264V(c,d)與NADPH(左)和NADH(右)結合模式分析Figure 2 Binding mode of NADPH(left)and NADH(right)in original type(a, b), the mutant D264V(c, d)

2.4 PpGDH-D264V酶學性質研究

2.4.1 最適溫度與溫度穩(wěn)定性

2.4.2 最適pH值及穩(wěn)定性

酶改造會影響構象變化，從而對酶本身的最適pH值及穩(wěn)定性產生影響。如圖4(a)所示，PpGDH-D264V催化PPO還原胺化的最適pH值為8.0，其在pH 6～8具有良好的穩(wěn)定性，35 ℃保存24 h后仍保留80%以上的酶活，故后續(xù)催化反應在最適pH值附近(pH 7.5～8.0)進行。與PpGDH[圖4(b)]相比，最適pH值仍為8.0，在堿性環(huán)境下pH穩(wěn)定性有所增強。

2.4.3 PpGDH-D264V底物特異性研究

以不同的α-酮酸為底物、NADH為輔酶，分別測定原始PpGDH和突變體D264V的酶活。從表3可以看出，突變體D264V較原始酶相比，在以NADH為輔酶催化各種底物酮酸的活力均有不同程度的增加，表明突變體D264V實現(xiàn)了對原始酶蛋白的輔酶特異性轉變，尤其是可以以NADH為輔酶制備多種非蛋白質氨基酸，如L-草銨膦、L-正纈氨酸、L-叔亮氨酸、L-高苯丙氨酸以及L-苯甘氨酸；同時也表明在線工具計算突變位點、獲得相應的輔酶特異性改造突變體的方法是可行的。

圖3 PpGDH-D264V(a)和PpGDH(b)最適溫度及穩(wěn)定性Figure 3 Temperature optimum and of original type(b)and the mutant(a)

圖4 PpGDH-D264V(a)和PpGDH(b)最適pH值及穩(wěn)定性Figure 4 pH optimum and pH stability of original type(b)and the mutant(a)

表3 底物特異性研究

3 結論

選擇NADPH依賴性的谷氨酸脫氫酶PpGDH作為藍本，通過半理性設計改造其輔酶特異性，實現(xiàn)了谷氨酸脫氫酶從NADPH依賴型到NADH依賴型的轉變，降低了其應用過程中的輔酶成本。研究發(fā)現(xiàn)Asp264、Arg293對PpGDH的輔酶特異性有較大影響，獲得了最優(yōu)突變體D264V，其NADH酶活(以PPO為底物)達到0.65 U/mg。通過酶催化動力學參數(shù)測定發(fā)現(xiàn)，與原始PpGDH相比，突變體D264V對NADH的偏好性(Ratio ofkcat/Km)增強了1 607倍。基于分子對接可知，突變體NADH偏好增強的原因為Val264與NADH的腺苷核糖的2′-和3′-羥基形成穩(wěn)定的氫鍵。對D264V突變體進行酶學性質表征：其最適溫度為45 ℃、最適pH值為8.0，并具有較為廣泛的底物譜，可用于制備多種非蛋白質氨基酸產品，如L-草銨膦、L-正纈氨酸、L-叔亮氨酸、L-高苯丙氨酸以及L-苯甘氨酸，為谷氨酸脫氫酶的工業(yè)應用奠定了基礎。