乳腺癌細胞與巨噬細胞融合對PI3K/AKT和MAPK/ERK信號通路的影響

張麗娜， 張迪迪， 趙 雷， 顧宇軒， 孫霄麟

(北京工業(yè)大學(xué) 環(huán)境與生命學(xué)部 生命科學(xué)與化學(xué)學(xué)院，北京 100124)

乳腺癌是一種對全球婦女健康威脅最大的腫瘤，尤其在我國女性乳腺癌的發(fā)病率和死亡率呈顯著增長趨勢。目前認為乳腺癌的浸潤和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致乳腺癌患者死亡的主要原因，但關(guān)于乳腺癌轉(zhuǎn)移的分子機制仍然不太清楚。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)被認為是腫瘤轉(zhuǎn)移的首要步驟[1]。近年來，細胞融合理論逐漸成為腫瘤轉(zhuǎn)移的研究熱點之一[2]。間充質(zhì)干細胞和巨噬細胞是目前細胞融合研究經(jīng)常選用的兩種細胞類型，也被作為探索腫瘤生物治療的靶向載體。多數(shù)研究已證實間充質(zhì)干細胞可與腫瘤細胞融合，參與腫瘤的發(fā)生轉(zhuǎn)移[3-7]。一些研究也表明巨噬細胞能同腫瘤細胞發(fā)生融合，促進腫瘤的發(fā)生轉(zhuǎn)移[8-10]。因此，細胞融合被認為是腫瘤轉(zhuǎn)移的一種新機制[11-12]。但目前關(guān)于細胞融合與腫瘤轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系及對其關(guān)鍵的分子調(diào)控機制仍不太清楚，這也阻礙了細胞融合在腫瘤臨床治療中的應(yīng)用。

研究表明多條信號通路參與調(diào)控EMT過程[13]，其中與腫瘤細胞增殖轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的PI3K/AKT和MAPK/ERK信號通路也參與EMT調(diào)控，這兩條信號通路的異?；罨c多種癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[14]。我們前期已經(jīng)成功建立了小鼠乳腺癌細胞與巨噬細胞融合模型，結(jié)果表明融合細胞的惡性增殖和遷移侵襲能力明顯增強，融合細胞獲得了腫瘤細胞無限增殖和巨噬細胞易于遷移的特性，而且可能是通過激活Wnt/β-catenin信號通路誘導(dǎo)EMT促進乳腺癌增殖轉(zhuǎn)移[9]。先前研究發(fā)現(xiàn)來源于乳腺上皮細胞和乳腺癌細胞融合形成的雜交細胞表現(xiàn)出不同的RAF-AKT信號通路之間的交叉對話[15]，巨噬細胞與乳腺癌細胞融合是否也會影響PI3K/AKT和MAPK/ERK信號通路介導(dǎo)EMT促進乳腺癌增殖轉(zhuǎn)移并不清楚。

為解決上述問題，本研究結(jié)合前期建立的融合細胞模型和所取得的實驗結(jié)果，重點探索乳腺癌細胞與巨噬細胞融合對腫瘤增殖轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的PI3K/AKT和MAPK/ERK信號通路的影響，揭示乳腺癌細胞與巨噬細胞融合是否可以通過這兩條信號通路介導(dǎo)EMT從而促進乳腺癌增殖轉(zhuǎn)移，以期為闡明細胞融合在腫瘤轉(zhuǎn)移中的分子機制提供新的視角和思路，也為干預(yù)細胞融合在腫瘤轉(zhuǎn)移治療中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

采用自建的小鼠乳腺癌細胞-巨噬細胞融合模型(N2O2-RAW264.7)，融合細胞的具體構(gòu)建方法詳見本課題組前期發(fā)表論文[9]。其中小鼠乳腺癌細胞N2O2來自Dr. Joseph Lustgarten (Sidney Kimmel Cancer Center, San Diego, CA)實驗室饋贈。

DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、PBS、100×青霉素-鏈霉素雙抗和0.25% Trypsin-EDTA均為美國Hyclone公司產(chǎn)品；RIPA細胞裂解液、CCK-8細胞增殖檢測試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒、4×SDS蛋白上樣緩沖液、PMSF、脫脂奶粉、4%多聚甲醛和SDS-PAGE凝膠配制試劑均購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；PVDF膜、ECL化學(xué)發(fā)光底物、Transwell穿透小室(24孔)為美國Millipore公司產(chǎn)品；Matrigel膠購自美國BD公司；結(jié)晶紫和DMSO購自美國Amresco公司；LY294002和PD98059抑制劑、β-actin、PI3K、p-PI3K(Tyr458)、AKT、p-AKT(Ser473)、ERK1/2和p-ERK1/2(Thr202/Tyr204)一抗均購自美國CST公司；HRP標記的山羊抗兔和抗鼠IgG二抗是美國ABGENT公司產(chǎn)品。其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)試劑。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

乳腺癌細胞和融合細胞置于含10%FBS和1×青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，待細胞生長至90%密度，用0.25% Trypsin-EDTA消化傳代，放置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。取狀態(tài)良好的對數(shù)生長期細胞實驗。LY294002和PD98059信號通路阻斷劑用DMSO溶解，分別采用10 μmol/L終濃度處理細胞。

1.2.2 Western Blot實驗

用0.25%胰酶消化細胞，加入RIPA裂解液，冰上裂解30 min，12 000 r/min于4 ℃離心30 min，取上清液轉(zhuǎn)至1.5 mL EP管，用BCA蛋白定量試劑盒測定總蛋白濃度。然后加入4×SDS上樣緩沖液，沸水浴煮10 min變性蛋白。配制10%聚丙烯酰胺凝膠，每孔上樣40 μg總蛋白，100 V恒壓電泳2 h，90 V恒壓轉(zhuǎn)膜1 h，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h。然后分別加入PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、ERK1/2、p-ERK1/2(1∶1 000稀釋)和β-actin(1∶5 000稀釋)，4℃孵育過夜。第2天回收一抗，TBST洗膜3次，然后加入HRP標記二抗(1∶6 000稀釋)，室溫孵育1 h，TBST洗膜3次。最后加入ECL化學(xué)發(fā)光底物，利用Tanon 4200化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)掃描圖像。β-actin作為內(nèi)參，每個Western Blot結(jié)果至少重復(fù)3次，選擇代表性結(jié)果展示。

1.2.3 CCK-8細胞增殖實驗

0.25%胰酶消化細胞并計數(shù)，96孔板每孔接種1×103個細胞，每組設(shè)4個復(fù)孔。分別培養(yǎng)24、48、72、96和120 h后，每孔更換100 μL新鮮培養(yǎng)基(同時設(shè)置只加培養(yǎng)基的空白對照)，然后每孔加10 μL CCK-8溶液，37 ℃培養(yǎng)箱避光孵育1 h，用Bio-Tek酶標儀測定450 nm處吸光度。以培養(yǎng)時間為橫坐標，450 nm處吸光度(OD450實驗組-OD450空白對照)為縱坐標，繪制連續(xù)5 d的生長曲線。

1.2.4 細胞劃痕實驗

0.25%胰酶消化細胞接種至12孔板，待細胞貼壁匯合至80%密度時，用200 μL黃槍頭在孔中央劃一道橫線，PBS清洗去掉脫落的細胞，更換為含5% FBS的DMEM培養(yǎng)基。分別在0、12和24 h通過倒置顯微鏡拍照記錄細胞劃痕變化，并計算細胞相對遷移率。

1.2.5 Transwell細胞遷移和侵襲實驗

0.25%胰酶消化細胞并計數(shù)，遷移實驗時，將細胞重懸于無血清DMEM培養(yǎng)基，以每孔5×104個細胞密度接種于24孔Transwell穿透小室。侵襲實驗是預(yù)先在24孔Transwell小室鋪Matrigel膠，每孔接種5×105個細胞。然后在24孔板加入含20%FBS的DMEM培養(yǎng)基，37 ℃孵育24 h后，用棉簽刮掉小室內(nèi)細胞，4%多聚甲醛固定，0.5%結(jié)晶紫染色，最后通過Olympus IX71倒置顯微鏡觀察拍照。隨機選取5個視野統(tǒng)計穿透膜的細胞數(shù)量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 乳腺癌細胞與巨噬細胞融合對PI3K/AKT和MAPK/ERK信號通路的影響

為了確定乳腺癌細胞與巨噬細胞融合對PI3K/AKT和MAPK/ERK信號通路的影響，首先通過Western Blot實驗檢測這兩條信號通路中關(guān)鍵標志蛋白的表達變化。結(jié)果表明，與對照組乳腺癌細胞相比，融合細胞中磷酸化的p-PI3K、p-AKT和p-ERK1/2表達水平顯著升高，而非磷酸化的總PI3K、AKT和ERK1/2蛋白的表達則沒有明顯變化(圖1)。該結(jié)果說明乳腺癌細胞與巨噬細胞融合可能會激活PI3K/AKT和MAPK/ERK信號通路，從而促進乳腺癌增殖轉(zhuǎn)移。

圖1 乳腺癌細胞與巨噬細胞融合對增殖轉(zhuǎn)移相關(guān)的PI3K/AKT和MAPK/ERK信號通路關(guān)鍵蛋白的影響Figure 1 Effects of fusion between breast cancer cells and macrophages on the key proteins of PI3K/AKT and MAPK/ERK signaling pathways related to proliferation and metastasis

2.2 抑制劑阻斷融合細胞中PI3K/AKT和MAPK/ERK通路效果檢測

檢測LY294002和PD98059特異性抑制劑處理對融合細胞中PI3K/AKT和MAPK/ERK信號通路的阻斷效果。Western Blot實驗結(jié)果表明，LY294002和PD98059抑制劑處理導(dǎo)致融合細胞中磷酸化的p-AKT和p-ERK1/2表達水平顯著降低，而未磷酸化的AKT和ERK1/2表達則沒有明顯變化(圖2)。該結(jié)果也進一步說明融合細胞中的PI3K/AKT和MAPK/ERK信號通路是處于被激活的狀態(tài)。

圖2 LY294002和PD98059抑制劑處理對融合細胞中PI3K/AKT和MAPK/ERK信號通路的影響Figure 2 Effects of LY294002 and PD98059 inhibitor treatment on PI3K/AKT and MAPK/ERK signaling pathways in the fused cells,respectively

2.3 抑制劑對融合細胞增殖的影響

通過CCK-8實驗分析LY294002和PD98059抑制劑阻斷PI3K/AKT和MAPK/ERK信號通路后細胞的增殖能力變化。從圖3(a)和(b)中可以看出，對照乳腺癌N2O2細胞組在450 nm處的吸光值明顯低于融合細胞組，說明融合細胞的增殖能力顯著強于對照乳腺癌細胞，LY294002和PD98059抑制劑處理導(dǎo)致對照乳腺癌細胞和融合細胞的增殖能力均受到抑制，尤其對融合細胞的抑制效果更明顯。

(a)對照乳腺癌細胞CCK-8實驗結(jié)果；(b)融合細胞CCK-8實驗結(jié)果。* P<0.05; ** P<0.01。圖3 CCK-8實驗分析抑制PI3K/AKT和MAPK/ERK信號通路對細胞增殖能力的影響Figure 3 Effects of inhibition of PI3K/AKT and MAPK/ERK signaling pathways on the cell proliferation ability by CCK-8 assay

2.4 抑制劑對融合細胞遷移能力的影響

通過劃痕損傷實驗分析LY294002和PD98059抑制劑處理后融合細胞的遷移能力變化。結(jié)果表明與未經(jīng)抑制劑處理組相比，LY294002和PD98059抑制劑處理12 h和24 h組融合細胞的劃痕明顯愈合較慢，劃痕也較寬一些[圖4(a)]。通過定量分析發(fā)現(xiàn)LY294002和PD98059抑制劑處理組細胞的相對遷移率明顯低于未處理對照組，抑制劑處理導(dǎo)致融合細胞的遷移顯著受阻[圖4(b)]。

此外，進一步通過Transwell實驗分析LY294002和PD98059抑制劑處理后融合細胞的遷移能力變化，發(fā)現(xiàn)阻斷PI3K/AKT和MAPK/ERK信號通路后，融合細胞的遷移能力顯著被抑制[圖5(a)和(b)]。

2.5 抑制劑對融合細胞侵襲能力的影響

通過Transwell侵襲實驗分析LY294002和PD98059抑制劑處理后融合細胞的侵襲能力變化。結(jié)果如圖6(a)和(b)所示，LY294002和PD98059抑制劑處理阻斷PI3K/AKT和MAPK/ERK信號通路后，融合細胞的侵襲能力也明顯被抑制。

(a)細胞劃痕損傷實驗結(jié)果(標尺：100 μm)；(b)細胞遷移能力的相對定量統(tǒng)計分析。* P<0.05; ** P<0.01。圖4 劃痕損傷實驗分析抑制PI3K/AKT和MAPK/ERK信號通路對融合細胞遷移能力的影響Figure 4 Effects of inhibition PI3K/AKT and MAPK/ERK signaling pathways on the migration ability of the fused cells by wound healing assay

(a)Transwell遷移實驗結(jié)果(×200)；(b)Transwell遷移實驗結(jié)果的定量統(tǒng)計分析(隨機選取5個視野統(tǒng)計分析)。** P<0.01。圖5 Transwell實驗分析抑制PI3K/AKT和MAPK/ERK信號通路對融合細胞遷移能力的影響Figure 5 Effects of inhibition PI3K/AKT and MAPK/ERK signaling pathways on the migration ability of the fused cells by Transwell migration assay

(a)Transwell侵襲實驗結(jié)果(×200)；(b)Transwell侵襲實驗結(jié)果的定量統(tǒng)計分析(隨機選取5個視野統(tǒng)計分析)。* P<0.05； ** P<0.01。圖6 Transwell實驗分析抑制PI3K/AKT和MAPK/ERK信號通路對融合細胞侵襲能力的影響Figure 6 Effects of inhibition PI3K/AKT and MAPK/ERK signaling pathways on the migration ability of the fused cells by Transwell invasion assay

3 討論與結(jié)論

細胞融合是腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的一種常見現(xiàn)象，研究表明腫瘤細胞同其他正常細胞形成的融合細胞往往表現(xiàn)出比親代腫瘤細胞更惡性的特征，包括形成異倍體，增殖轉(zhuǎn)移能力增強，獲得耐藥性及干細胞樣特性等[2,16-19]。腫瘤細胞融合理論目前也被認為是腫瘤轉(zhuǎn)移的一種新機制[11-12,20]。通過對腫瘤細胞與間充質(zhì)干細胞融合研究發(fā)現(xiàn)，不同的腫瘤細胞與間充質(zhì)干細胞融合對腫瘤的生長轉(zhuǎn)移存在一定爭議。多數(shù)研究認為間充質(zhì)干細胞融合促進腫瘤生長轉(zhuǎn)移[4,16,21]；還有一些研究認為間充質(zhì)干細胞融合抑制腫瘤生長轉(zhuǎn)移[22-23]。巨噬細胞作為腫瘤微環(huán)境中重要的免疫細胞，也是細胞融合研究經(jīng)常選用的細胞類型。我們前期通過建立小鼠乳腺癌細胞與巨噬細胞融合模型研究發(fā)現(xiàn)融合細胞的惡性增殖和遷移侵襲能力明顯增強，巨噬細胞融合會促進乳腺癌增殖轉(zhuǎn)移[9]。

研究表明腫瘤細胞與間充質(zhì)干細胞融合是通過誘導(dǎo)EMT促進腫瘤轉(zhuǎn)移[24-25]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌細胞與巨噬細胞融合也會誘發(fā)EMT促進乳腺癌增殖轉(zhuǎn)移[9]。經(jīng)典的TGF-β、Wnt/β-catenin、Notch等信號通路均被證實參與EMT調(diào)控[13]。此外，與增殖轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的PI3K/AKT和MAPK/ERK信號通路也與EMT調(diào)控相關(guān)[26-27]。EMT相關(guān)信號通路的異?；罨瘎t促進腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移。已有研究表明細胞融合可通過不同的信號通路調(diào)控腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移。Ozel等[15]發(fā)現(xiàn)乳腺上皮細胞和乳腺癌細胞融合形成的雜交細胞表現(xiàn)出RAF-AKT信號通路的交叉對話。Fu等[28]發(fā)現(xiàn)巨噬細胞可通過分泌IL-8激活JAK2/STAT3/Snail信號通路，從而誘導(dǎo)肝癌細胞發(fā)生EMT促進肝癌轉(zhuǎn)移。我們前期結(jié)果表明乳腺癌細胞與巨噬細胞融合是通過激活Wnt/β-catenin信號通路誘發(fā)EMT促進乳腺癌增殖轉(zhuǎn)移[9]。

本研究重點分析乳腺癌細胞與巨噬細胞融合對增殖轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的PI3K/AKT和MAPK/ERK信號通路的影響。結(jié)果表明：與對照乳腺癌細胞相比，融合細胞中這兩條通路的標志蛋白即磷酸化的p-PI3K、p-AKT和p-ERK1/2表達水平顯著升高，而總PI3K、AKT和ERK1/2表達沒有變化；LY294002和PD98059抑制劑阻斷PI3K/AKT和MAPK/ERK信號通路后，融合細胞中p-AKT和p-ERK1/2表達明顯降低，而且融合細胞的增殖、遷移和侵襲能力均顯著被抑制。結(jié)果初步表明乳腺癌細胞與巨噬細胞融合可能通過激活PI3K/AKT和MAPK/ERK信號通路誘導(dǎo)EMT從而促進乳腺癌增殖轉(zhuǎn)移。

在本研究基礎(chǔ)上，再結(jié)合前期研究結(jié)果，進一步提示乳腺癌細胞與巨噬細胞融合可能會通過激活多條EMT相關(guān)的信號通路誘導(dǎo)EMT從而促進乳腺癌增殖轉(zhuǎn)移。由此推斷，調(diào)控細胞融合與腫瘤轉(zhuǎn)移的信號通路是復(fù)雜多樣的，細胞融合可能會導(dǎo)致多條EMT相關(guān)信號通路的改變協(xié)同調(diào)控腫瘤的發(fā)生轉(zhuǎn)移。因此，關(guān)于細胞融合、信號通路調(diào)控與腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移之間的具體作用機制仍有待深入研究。