響應(yīng)面法優(yōu)化竹葉青茶末中茶氨酸的提取工藝

蘭 林，汪晟羽，張晉森，袁 源，錢葉遷，謝 玲，李玉鋒*，李篤新

1.西華大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，四川 成都 611730；2.四川大觀梁生態(tài)農(nóng)業(yè)科技有限公司 四川 巴中 636000

竹葉青茶（Bamboo leaf tea）屬于眾多茶類中的一種，生長(zhǎng)于“秀甲天下”的峨眉山，有著世界公認(rèn)的產(chǎn)茶黃金地帶[1]。茶葉中含有多種人體所需的微量元素，近年來，一些國內(nèi)、外的科學(xué)家均發(fā)現(xiàn)茶對(duì)健康的有益影響，如防癌、保護(hù)心血管、降血壓、調(diào)節(jié)免疫力等[2-6]。隨著茶產(chǎn)業(yè)的發(fā)展和人們需求的變化，茶副產(chǎn)物不斷增多。近年來，隨著茶葉深加工的不斷發(fā)展，剩余茶廢料得到有效利用，提取和分離純化得到多種生物活性物質(zhì)。

茶氨酸（L-theanine）是茶葉中特有的非蛋白氨基酸，占茶葉游離氨基酸總量的50%左右，是茶湯主要的呈味物質(zhì)之一[7]，其保健功能和藥理作用不斷被發(fā)掘，并成為茶葉功能成分開發(fā)利用的熱點(diǎn)之一。有關(guān)研究表明，茶氨酸是一種安全、無毒、具備多種生物活性成分，具有延緩衰老、降血壓、鎮(zhèn)定、增強(qiáng)記憶力和減少焦慮或抑郁等功效[8-12]；目前茶氨酸已在食品的添加、功能性保健產(chǎn)品的開發(fā)、疾病的防御等多個(gè)鄰域有廣泛應(yīng)用[13-14]。但據(jù)研究報(bào)道，與天然茶氨酸相比，合成的茶氨酸體內(nèi)生物活性低[15]。因此，提取茶葉中的茶氨酸成為研究重點(diǎn)之一。目前，已有較多方法應(yīng)用于茶氨酸的提取，如超臨界CO2萃取法提取[16]、利用超聲輔助提取[17]、利用復(fù)合酶法提取分離[18]、利用某些有機(jī)或無機(jī)試劑可與氨基酸形成不溶性反應(yīng)物的特性分離法[19]及運(yùn)用超濾膜法富集分離茶氨酸[20]等。但這些方法存在或多或少的問題，如微波輔助提取，提取率不能得到顯著提升；沉淀法操作復(fù)雜，對(duì)環(huán)境不友好，且容易造成茶氨酸損失；膜法分離技術(shù)的特點(diǎn)是工藝簡(jiǎn)單、無相變，用于茶氨酸的初步提取，得到的茶氨酸純度不高等。綜合考慮采用離子交換層析法成本低廉，原料易得，樹脂可以循環(huán)反復(fù)使用，綠色且環(huán)保，操作不難和收率高[21]。本試驗(yàn)以竹葉青茶末為研究對(duì)象，采用響應(yīng)面法優(yōu)化竹葉青茶末中茶氨酸提取工藝條件，為竹葉青茶末中茶氨酸的提取開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

竹葉青茶末，會(huì)園茶廠，四川樂山；磷酸氫二鈉、磷酸氫二鉀、碳酸鈉、水合茚三酮，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；茶氨酸標(biāo)品，源葉生物科技有限公司；NKA-II樹脂、大孔吸附樹脂AB-8，天津光復(fù)精細(xì)化工研究所；PA6樹脂、PA66樹脂，山東優(yōu)索化工科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

高速粉碎機(jī)，永康皇代五金制品有限公司；BPG-9070A恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器；Molecular Devices SpectraMaxi3 X型多功能酶標(biāo)儀及HHS-數(shù)據(jù)恒溫水浴鍋，美谷分子儀器有限公司；BT 423S電子天平，北京賽多斯科學(xué)儀器。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 茶氨酸的提取

參照曹博等[22]的方法。取一定量的竹葉青茶末用粉碎機(jī)制成茶粉，稱取1 g過60目篩的茶粉放入燒杯中添加蒸餾水?dāng)嚢杈鶆颍″伬锝嵋欢〞r(shí)間后提取茶湯備用。

超濾濃縮：選擇4種不同截留分子量的超濾離心管，截留分子量分別為100 KD、50 KD、10 KD、3 KD，對(duì)浸提后的茶湯進(jìn)行超濾濃縮。

樹脂吸附：首先將 PA6、PA66、AB-8、NKA-II樹脂用超純水浸泡，通過浮選的樹脂用濃度為0.5 mol/L的HCl溶液浸泡24 h，沖洗至中性，用75%的乙醇溶液浸泡24 h，超純水沖洗至渾濁液出現(xiàn)，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2% NaOH溶液浸潤(rùn)24 h，用95%的乙醇沉淀，采取濕法上柱方式，沉淀后經(jīng)冷凍干燥后即得茶氨酸。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

參照周國蘭[23]等人采用茚三酮檢測(cè)法，取1 mL待測(cè)樣液于試管中，加入500 μLpH值為8的磷酸緩沖液和500 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的茚三酮溶液，在100℃水浴下沸騰15 min，待自然冷卻，加水定容至25 mL。放置10 min，取1 mL于24孔板中，570 nm測(cè)定OD值。配制濃度為0.01 mg/mL、0.02 mg/mL、0.04 mg/mL、0.06 mg/mL、0.08 mg/mL、0.10 mg/mL的茶氨酸標(biāo)準(zhǔn)液，每組試驗(yàn)平行三次。并以濃度為X軸、OD值為Y軸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

分別選用不同孔徑的目篩過濾茶末（20目、40目、60目、80目、100目）、提取溫度（60℃、70℃、80℃、90℃、100℃）、提取時(shí)間（20 min、40 min、60 min、80 min、100 min）和液料比（1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30）進(jìn)行單因素試驗(yàn)，考察各因素對(duì)茶氨酸提取率的影響，確定最佳提取工藝。

1.3.4 響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用Design-Expert 8.0.6中的Box-Behnken設(shè)計(jì)試驗(yàn)組合，分別選取液料比（A）、提取時(shí)間（B）和提取溫度（C）對(duì)茶氨酸得率影響顯著的三因素進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)（表1）。

表1 響應(yīng)面水平和因素設(shè)計(jì)Table 1 Response surface level and factor design

1.3.5 數(shù)據(jù)分析

采用Origin 9.0軟件進(jìn)行試驗(yàn)圖表繪制，采用Design-Expert 8.0.6統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 茚三酮標(biāo)準(zhǔn)曲線

結(jié)果見圖1。根據(jù)分析得到線性回歸方程式：Y= 0.1216X+0.0068，R2= 0.9995，可見，線性關(guān)系良好。

圖1 茚三酮標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 1 Standard curve of ninhydrin standard

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 液料比對(duì)茶氨酸提取率的影響

由圖2可知，在提取溫度80℃、提取時(shí)間60 mim、蒸餾水中提取條件下，隨著液料比增加到1∶15時(shí)茶氨酸含量達(dá)到最大，隨后便降低。因此，考慮綠色環(huán)保等因素，試驗(yàn)選用液料比為 1∶15。

圖2 液料比對(duì)茶氨酸提取率的影響Figure 2 Effect of liquid material ratio on the extraction rate of theanine

2.2.2 提取溫度對(duì)茶氨酸提取率的影響

由圖3可知，隨著提取溫度的升高，茶氨酸提取率呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，80℃時(shí)達(dá)到最高。因此，試驗(yàn)選擇80℃為最佳提取溫度。

圖3 提取溫度對(duì)茶氨酸提取率的影響Figure 3 Effect of extraction temperature on the extraction rate of theanine

2.2.3 提取時(shí)間對(duì)茶氨酸提取率的影響

由圖4可知，隨著提取時(shí)間的增加，茶氨酸提取率逐漸上升，60 min時(shí)達(dá)到最高，后隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)迅速降低。因此，試驗(yàn)選取提取時(shí)間為60 min最佳。

圖4 提取時(shí)間對(duì)茶氨酸提取率的影響Figure 4 Effect of extraction time on the extraction rate of theanine

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

試驗(yàn)結(jié)果見表2。利用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)上表2試驗(yàn)中所得數(shù)據(jù)建立二次回歸方程分析，得到回歸模型：Y=2.84+0.051A+0.11B+0.14C-0.02AB+0.022AC+0.03BC-0.3A2-0.11B2-0.21C2。響應(yīng)面回歸模型的方差分析結(jié)果見表3。實(shí)驗(yàn)所選模型P= 0.0002 < 0.05，模型具有極顯著性；由F= 2.53，失擬項(xiàng)P值= 0.1959 > 0.05，失擬項(xiàng)不顯著；R2Adj= 0.9264，擬合程度良好。此模型測(cè)試誤差小，說明模型試驗(yàn)值和預(yù)測(cè)值有很好的相關(guān)性。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Response surface test design scheme and test results

表3 響應(yīng)面回歸模型結(jié)果方差分析Table 3 Analysis of variance of response surface regression model results

為了更好研究各變量之間的關(guān)系，基于上述回歸方程結(jié)果，利用響應(yīng)面軟件進(jìn)行可視化分析，繪制響應(yīng)曲面圖和等高線圖如圖5所示。由圖5可看出：隨著液料比和提取時(shí)間的增加，茶氨酸提取率逐漸增高，且交互作用堅(jiān)強(qiáng)，響應(yīng)面曲面較陡；液料比和提取溫度等高線呈現(xiàn)較圓且等高線較短交互作用不明顯；提取時(shí)間和提取溫度對(duì)茶氨酸提取率交互效應(yīng)次之。試驗(yàn)提取參數(shù)對(duì)茶氨酸提取的影響程度從大到小依次為提取溫度>提取時(shí)間>液料比。

圖5 各因素交互作用對(duì)茶氨酸提取得率的響應(yīng)面及等高線圖Figure 5 Response surface and contour plots of the interaction of various factors on the theanine extraction rate

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

基于踐行節(jié)約資源降低成本的原則，為驗(yàn)證模型的準(zhǔn)確性，采用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面進(jìn)行驗(yàn)證，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果確定竹葉青茶末中茶氨酸提取的最佳工藝為液料比15∶1、提取溫度80℃和提取時(shí)間60 min，進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)驗(yàn)證，得到茶氨酸提取率為44.12%，與試驗(yàn)預(yù)測(cè)值較為接近，表明試驗(yàn)?zāi)Ｐ涂煽俊?/p>

3 結(jié)論

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上結(jié)合Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理模型的分析方法對(duì)竹葉青茶末中茶氨酸提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，建立液料比、提取溫度和提取時(shí)間與茶氨酸的回歸模型。結(jié)果表明，模型具有較高顯著性合理可靠，最后得出最佳提取工藝參數(shù)為液料比1∶15、提取溫度80℃和提取時(shí)間60 min。在此工藝參數(shù)的驗(yàn)證試驗(yàn)下茶氨酸得率為44.12%，且純度為91.23%（根據(jù)QB/T 4263—2011方法檢測(cè)），與響應(yīng)面的預(yù)測(cè)結(jié)果有較好的一致性，說明運(yùn)用響應(yīng)面法優(yōu)化竹葉青茶末中茶氨酸的提取工藝可行，可為茶葉中茶氨酸的提取與開發(fā)利用提供一定的參考。