通過ACEⅡ通路治療男性不育癥的中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

王璐，李海松，王繼升，馮雋龍，鄧省，鮑丙豪，趙 琦，王彬

（北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，北京 100700）

近年來，男性不育癥的發(fā)病率逐年升高，相關(guān)研究表明：在國(guó)外一些地區(qū)，12%～18%的育齡夫妻處于不育狀態(tài)；國(guó)內(nèi)不育患者的比率接近10%，其中半數(shù)為男方因素導(dǎo)致[1-2]。約75%的患者表現(xiàn)為少弱精子癥，本病屬于多種因素共同導(dǎo)致，相關(guān)發(fā)病機(jī)制目前尚未研究明確，臨床上主要進(jìn)行對(duì)因治療，輔助應(yīng)用激素等藥物，療效差強(qiáng)人意，存在一定的不良反應(yīng)[3-4]。對(duì)本病的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行研究，提高臨床療效是目前迫切需要解決的問題。隨著對(duì)男性不育癥研究的不斷深入，腎素-血管緊張素通路被發(fā)現(xiàn)可能與相關(guān)類型的睪丸炎癥相關(guān)[5]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)根據(jù)藥物-靶點(diǎn)-疾病的關(guān)聯(lián)構(gòu)成網(wǎng)絡(luò)，對(duì)藥物作用機(jī)制進(jìn)行闡釋的現(xiàn)代研究方法，通常應(yīng)用于輔助研究藥物對(duì)疾病的作用機(jī)制。本研究從已知的通路入手，利用中藥多成分、多靶點(diǎn)的特性，針對(duì)ACEⅡ通路和少弱精的交集靶點(diǎn)，運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，探索治療的有效中藥及活性化合物，以期針對(duì)腎素-血管緊張素通路對(duì)生精功能潛在的具有治療及保護(hù)作用的中藥。

1 材料與方法

1.1 ACEⅡ通路靶點(diǎn)檢索

通過KEGG數(shù)據(jù)庫（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, www.kegg.jp）檢索腎素-血管緊張素通路（檢索詞：Renin-angiotensin system,ID:ko04614）。下載通路中靶點(diǎn)名稱及相關(guān)通路圖。

1.2 少弱精子癥相關(guān)靶點(diǎn)檢索

通過Genecards數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org/）檢索少弱精子癥（檢索詞：oligospermia,asthenospermia），下載相關(guān)靶點(diǎn)后，與檢索到的ACEⅡ通路靶點(diǎn)取得交集，視為新冠肺炎通過腎素-血管緊張素系統(tǒng)對(duì)少弱精子癥產(chǎn)生影響的靶點(diǎn)。

1.3 有效中成藥篩選

運(yùn)用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫及分析平臺(tái)（TCMSP,http://tcmspw.com/tcmsp.php）檢索交集靶點(diǎn)，篩選并下載相關(guān)的有效中藥，并記錄各中藥的總靶點(diǎn)數(shù)，以及共同靶點(diǎn)數(shù)。

1.4 中藥活性化合物篩選

根據(jù)交集靶點(diǎn)，通過TCMSP篩選出中藥活性化合物，并從DrugBank數(shù)據(jù)庫（www.drugbank.ca）中確認(rèn)出活性化合物的有效作用靶點(diǎn)，記錄共同靶點(diǎn)數(shù)。

1.5 有效中藥-活性化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

匯總篩選得出的交集靶點(diǎn)、有效中藥、以及中藥活性化合物數(shù)據(jù)，運(yùn)用Cytoscape3.7.0（www.cytoscape.org）軟件構(gòu)建有效中藥-活性化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，并運(yùn)用NetworkAnalyzer功能分析化合物、中藥、及網(wǎng)絡(luò)構(gòu)成情況。

2 結(jié)果

2.1 ACEⅡ通路靶點(diǎn)檢索

通過KEGG數(shù)據(jù)庫檢索腎素-血管緊張素系統(tǒng)，針對(duì)ACEⅡ通路檢索關(guān)鍵靶點(diǎn)名稱，下載相關(guān)通路圖，發(fā)現(xiàn)該通路中共有7個(gè)關(guān)鍵靶，分別為血管緊張素原（angiotensinogen, AGT）、腎素（renin, REN）、糜酶（chymase, CMA1）、組織蛋白酶G（cathepsinG, CTSG）、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（angiotensin-convertingenzyme, ACE）、谷氨酰氨基肽酶（glutamylaminopeptidase, ENPEP）、血管緊張素Ⅱ1型受體（type-1angiotensinⅡreceptor,AGTR1）。見表1。

表1 ACEⅡ通路靶點(diǎn)

2.2 少弱精子癥相關(guān)靶點(diǎn)檢索

通過Genecards數(shù)據(jù)庫檢索出500個(gè)少弱精子癥相關(guān)靶點(diǎn)，通過與ACEⅡ通路靶點(diǎn)取交集后，得到2個(gè)靶點(diǎn)，分別為REN和ACE。

2.3 有效中成藥篩選

運(yùn)用TCMSP數(shù)據(jù)平臺(tái)，根據(jù)檢索交集靶點(diǎn)，篩選并下載相關(guān)的中藥，發(fā)現(xiàn)共有194味中藥含該通路靶點(diǎn)。取排名前10位的有效中藥（共同靶點(diǎn)/總靶點(diǎn)）如下：麻黃、桑葉、柴胡、芫荽、沙棘、桂枝、生姜、桑椹、枇杷葉、牛蒡子。見表2。

表2 與 ACEⅡ通路具有共同靶點(diǎn)的中藥前10位

2.4 中藥活性化合物篩選

通過TCMSP平臺(tái)，根據(jù)檢索交集靶點(diǎn)，篩選出中藥活性化合物，并進(jìn)一步從DrugBank數(shù)據(jù)庫確認(rèn)和下載有效作用靶點(diǎn)，分別為alpha-humulene,GLY, L-Ile, (-)-trans-Carveol, anethole, (S)-p-Mentha-1,8-dien-7-al, FMT, Terragon, chavicol, (1R, 2R,4R)-Dihydrocarveol, PPI, Azeton, acetic acid,(5S)-5-butyloxolan-2-one,[(4R)-4-isopropenyl-1-cyclohexenyl]methanol,Butenone,1,3-p-Menthadien-7-al,1-Vinylcyclohexanol, (5S)-3,5-dimethylcyclohex-2-en-1-one,(-)-epicatechin,見表3。

表3 ACEⅡ通路具有共同靶點(diǎn)的活性化合物

2.5 有效中藥-活性化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

通 過 KEGG、TCMSP、DrugBank數(shù) 據(jù) 庫，根據(jù)交集靶點(diǎn)，以及篩選得出的有效中藥（前10位）、活性化合物，運(yùn)用Cytoscape 3.7.0軟件構(gòu)建有效中藥-活性化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，并運(yùn)用NetworkAnalyzer功能計(jì)算化合物、中藥及網(wǎng)絡(luò)構(gòu)成情況，分析4個(gè)網(wǎng)絡(luò)維度（Degree、Average Shortest PathLength、Betweenness Centrality、Closeness Centrality）的相關(guān)結(jié)果。發(fā)現(xiàn)在中藥-活性化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，以麻黃Degree最高（Degree=7），桑葉、芫荽次之（Degree=5），活性化合物按Degree排序以acetic acid（Degree=11）、anethole（Degree=4）、Terragon（Degree=4）居前3位。詳細(xì)網(wǎng)絡(luò)維度結(jié)果，見表4，表5。

表4 化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中的有效中藥

表5 化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中的有效成分

3 討論

ACE2是首個(gè)被發(fā)現(xiàn)的人類血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（ACE）的同源物，屬于1型跨膜蛋白，廣泛存在于心、腎、肺等細(xì)胞表面。腎素-血管緊張素（renin angiotensin-aldosterone system，RASS）系統(tǒng)是人體血管的收縮、重塑，電解質(zhì)、損傷反應(yīng)等的重要調(diào)節(jié)軸。其中腎素與血管緊張素原分別主要來源于腎臟與肝臟，血管緊張素原在腎素的調(diào)控下轉(zhuǎn)化成血管緊張素I（AgI）。AgI通過血液循環(huán)進(jìn)入肺臟，在血管緊張素轉(zhuǎn)換酶的作用下分解為血管緊張素II（AgII），對(duì)血管收縮以及血壓等產(chǎn)生調(diào)控作用，起到平衡肺部的炎癥損傷、氧化應(yīng)激反應(yīng)等作用。研究[6-7]發(fā)現(xiàn)RASS系統(tǒng)在多種肺部疾病的治療中，均有著重要的作用。

目前，在男性不育癥的治療中，中醫(yī)藥在協(xié)助人體抵抗病毒、提高人體生理機(jī)能、防治睪丸炎癥、改善生育功能等方面起到了重要作用[8]。孫自學(xué)[9]認(rèn)為男性不育癥的主要病機(jī)是“腎虛絡(luò)阻”，以“補(bǔ)腎益氣，活血通絡(luò)”法治療男性不育癥，療效較好。陳其華[10]將精道瘀滯總結(jié)為本病主要病機(jī)，在治療上“以通為用”，輔以補(bǔ)益脾腎之品，使精道得通，每獲良效。

本研究構(gòu)建了有效中藥-活性化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)麻黃、桑葉、芫荽的Degree排名最高。麻黃首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具發(fā)汗解表、宣肺平喘、利水消腫功效。李俊濤等[11]認(rèn)為，臨床應(yīng)用麻黃“振奮腎陽”功用治療相關(guān)男性疾病，可產(chǎn)生明顯的療效。麻黃既可以改善精液液化情況，又可以興奮腎上腺素能，進(jìn)而改善射精功能，間接影響受孕概率[12]。藥理研究發(fā)現(xiàn)，桑葉具有清除氧自由基的效果，而氧自由基是弱精性不育癥相關(guān)機(jī)理之一，較高含量的活性氧會(huì)引起精子各運(yùn)動(dòng)速度參數(shù)和精子比例參數(shù)的顯著下降，精子DNA完整性的顯著下降，以及精子存活率的顯著下降[13]。芫荽性味偏于辛溫，具有解表、健胃的功效。芫荽中含有脂肪醛和脂肪醇類化合物，以及黃酮類、酚酸類及香豆素類等化學(xué)成分，具有抗菌、降血糖、抗氧化、抗焦慮、利尿等療效[14]。

通過網(wǎng)絡(luò)分析得到的前3位活性化合物為acetic acid（Degree =11）、anethole（Degree = 4）、Terragon（Degree = 4），且僅有 acetic acid 可同時(shí)作用于REN和ACE兩個(gè)靶點(diǎn)?，F(xiàn)有文獻(xiàn)中并未有acetic acid治療少弱精子癥的報(bào)道，但是acetic acid廣泛存在于有明確的治療少弱精子癥的中藥當(dāng)中，本化合物是基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)的可能具有治療ACEⅡ通路受損的少弱精子癥，但也有可能其療效并不顯著，仍需相關(guān)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

睪丸具有產(chǎn)生精子的重要作用，但較為脆弱，容易被病毒侵襲。多種病毒均對(duì)睪丸有損傷作用，導(dǎo)致生育力下降，如腮腺炎病毒可以導(dǎo)致患兒在成年后出現(xiàn)不育，甚至睪丸萎縮。寨卡病毒可以在生殖系統(tǒng)中轉(zhuǎn)錄甚至在精液中存活數(shù)月，誘發(fā)男性睪丸炎以及附睪炎癥。乙肝病毒、艾滋病病毒等都會(huì)影響睪丸生精功能，導(dǎo)致男性不育。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，初步探究對(duì)睪丸可能具有保護(hù)及治療作用的中藥及化合物。在常規(guī)用藥之外，對(duì)保護(hù)睪丸生精功能提供了新的思路，但本研究是基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及生物信息技術(shù)的預(yù)測(cè)結(jié)果，尚未對(duì)結(jié)果進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。