參歸補(bǔ)血湯提取工藝的優(yōu)化及對(duì)IDA小鼠貧血的改善作用和JAK2/STAT3信號(hào)通路的影響

秦 瑞，吉世禹，劉俊寶，曹璐，冷維春*

（1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院婦產(chǎn)科，長(zhǎng)春 130033；2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院藥學(xué)部，長(zhǎng)春 130033）

參歸補(bǔ)血湯（參歸補(bǔ)血湯方）由當(dāng)歸10 g，人參5 g，熟地黃10 g，白芍10 g等4味中藥組成，方中阿魏酸及多糖成分被認(rèn)為是治療貧血類疾病的有效活性成分。因中藥復(fù)方中成分繁多、服用量大，因此以高效、減量、著重提取有效成分及部位為目的的提取工藝優(yōu)化是當(dāng)前研究的重中之重[1-2]。

本研究首先進(jìn)行參歸補(bǔ)血湯提取工藝優(yōu)化，基于小鼠缺鐵性貧血模型，考察其對(duì)缺鐵性貧血的有效性，并結(jié)合IL6誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞模型，探索參歸補(bǔ)血湯對(duì)缺鐵性貧血的改善作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性ICR（SPF級(jí)）小鼠購(gòu)自長(zhǎng)春億斯動(dòng)物技術(shù)有限公司，60只，體質(zhì)量（19±3）g，室內(nèi)保持恒溫狀態(tài)（24±1）℃，普通飼料喂養(yǎng)，不限制進(jìn)食和飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.2 儀器與材料

1.2.1 儀器1）FA2004分析天平（常州市幸運(yùn)電子設(shè)備公司）；2）高速離心機(jī)、RT-PCR儀（德國(guó)艾本德）；3）低速控溫臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；4）qRT-PCR、電泳儀、半干轉(zhuǎn)儀（美國(guó)BIO-RAD）；紫外可見分光光度計(jì)（上海元析儀器有限公司）；高效液相色譜儀（日本島津）；酶標(biāo)儀（奧地利TECAN）。

1.2.2 材料1）蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、葡萄糖分析標(biāo)準(zhǔn)品（源葉公司）；2）低鐵飼料（北京協(xié)同生物）；3）甲醇、乙腈（色譜純，美國(guó)Fisher公司），其余試劑均為分析純；4）中藥飲片當(dāng)歸（批號(hào)：190606）、熟地（批號(hào)：10219027）、人參（批號(hào)：180501）、白芍（批號(hào)：07219029），均符合《中華人民共和國(guó)藥典》2020版一部藥用標(biāo)準(zhǔn)；5）復(fù)方硫酸亞鐵片（吉林西點(diǎn)藥業(yè)，批號(hào)189200）；6）Elisa試劑盒（長(zhǎng)春晶美科技公司）；7）RNA提取試劑盒（北京全式金生物公司）；8）反轉(zhuǎn)錄試劑（TAKARA生物公司）；9）抗體（美國(guó)CST公司）。

1.3 提取方法的設(shè)計(jì)及驗(yàn)證

1.3.1 水提取正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)根據(jù)參歸補(bǔ)血湯方主要活性成分的理化特點(diǎn)，采以水為提取媒介，進(jìn)行提取工藝研究。按生產(chǎn)化要求，以加水倍數(shù)（15、20、25倍）、提取時(shí)間（0.5 h、1.0 h、1.5 h）及提取次數(shù)（1、2、3次）為考察因素，以L9（34）進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，確定最佳條件，因素水平見表1。

表1 參歸補(bǔ)血湯水提取因素水平

1.3.2 水提取工藝驗(yàn)證取5批處方量藥材樣品，按最優(yōu)工藝條件提取。測(cè)定各批提取液中阿魏酸及粗多糖的含量，計(jì)算RSD值。

1.3.3 有效成分含量測(cè)定1）阿魏酸含量測(cè)定。色譜柱：安捷倫C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：0.1%磷酸和乙睛，比例從9:1梯度洗脫至7:3，梯度洗脫15 min，流速1 mL·min-1，進(jìn)樣量10 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)230 nm；阿魏酸的線性回歸方程：Y= 6 503.1X-120.96，r2= 1，在 0.2～ 1.8 mg范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。2）粗多糖含量測(cè)定。取湯劑樣品50 μL置比色管中，補(bǔ)水至2 mL，加5%苯酚1 mL，渦旋混勻后加10 mL濃硫酸，沸水浴2 min，485 nm測(cè)定吸光度?？偠嗵堑木€性回歸方程：Y= 3.805 7X+ 0.0258，r2= 0.998 5，在 0～ 0.25 mg范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

1.4 小鼠缺鐵性貧血模型的建立

1.4.1 動(dòng)物分組及給藥60只雌性小鼠分成空白、模型、陽(yáng)性、低劑量、中劑量及高劑量6組，每組10只?？瞻捉M給予正常飼料；其余組給予低鐵飼料，飼養(yǎng)期間避免與鐵器接觸。造模40 d后持續(xù)給藥15 d，低劑量組 200 mg·kg-1·d-1、中劑量組 400 mg·kg-1·d-1、高劑量組800 mg·kg-1·d-1，陽(yáng)性對(duì)照組給予復(fù)方硫酸亞鐵片 13 mg·kg-1·d-1。

1.4.2 Hepcidin及缺鐵性貧血藥效學(xué)相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)稱量各組小鼠體質(zhì)量后，眼球取血，置4℃冰箱備用。按Elisa試劑盒說明書，測(cè)定血液中Hepcidin、Hb、FEP、Si、stfr和 TIBC 含量。

1.5 參歸補(bǔ)血湯抑制IL-6誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞Hepcidin表達(dá)的研究

1.5.1 CCK8法檢測(cè)補(bǔ)血湯對(duì)HepG2細(xì)胞的抑制作用HepG2細(xì)胞鋪于96孔板中，密度每毫升5×103個(gè)。貼壁后空白組給予培養(yǎng)基100 μL；其余分別給予 50 μg·mL-1、100 μg·mL-1、150 μg·mL-1、200 μg·mL-1、400 μg·mL-1、600 μg·mL-1及800 μg·mL-1當(dāng)歸補(bǔ)血湯 100 μL，48 h 后加入 CCK8孵育50 min，于450 nm處檢測(cè)吸光度。

1.5.2 體外構(gòu)建IL-6誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞Hepcidin高表達(dá)的模型將HepG2細(xì)胞鋪于6孔板中，密度每毫升45×104個(gè)。貼壁后模型組給予50 ng·mL-1IL-6；給藥組造模后給予當(dāng)歸補(bǔ)血湯200 μg·mL-1，48 h后提取細(xì)胞總蛋白及總RNA。1）Hepcidin mRNA的檢測(cè)：采用總RNA提取試劑盒提取HepG2細(xì)胞RNA，Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒轉(zhuǎn)錄，引物見表2，mRNA測(cè)定由PCR儀完成。2）JAK2/STAT3信號(hào)通路檢測(cè)：取各組由RIPA裂解的蛋白樣品加Loading Buffe后沸水浴5 min，進(jìn)行SDS-PAGE。4 ℃過夜孵育一抗Betaactin（1:1 000）、JAK2（1:800）及 STAT3（1:200 0）后，孵育HRP標(biāo)記的二抗（1:300 0）1 h，ECL法顯色。

表2 引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 水提取正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

采用多指標(biāo)綜合加權(quán)評(píng)分法對(duì)參歸補(bǔ)血湯中當(dāng)歸阿魏酸及湯劑總多糖收率2項(xiàng)考察指標(biāo)進(jìn)行方差分析。設(shè)定滿分為100分，指標(biāo)成分的比重分?jǐn)?shù)為阿魏酸50、粗多糖50。在此基礎(chǔ)上進(jìn)行總加權(quán)評(píng)分，利用綜合評(píng)分值（Pi）對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析：以NXY表示第Y個(gè)指標(biāo)成分下第X個(gè)指標(biāo)成分的測(cè)定值，以各指標(biāo)的最大值作為參照對(duì)同一指標(biāo)各數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理；AXY表示第Y個(gè)指標(biāo)成分下的第X個(gè)測(cè)定值的標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)。BXY=NXY/（NY）max，其中 X=1-9，Y=1，2。綜合評(píng)分Pi=∑比重分?jǐn)?shù)×AXY。將總分結(jié)果帶入正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果中即得（見表3，表4）。

表3 參歸補(bǔ)血湯L9（3 4）水提取正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表與結(jié)果分析

表4 參歸補(bǔ)血湯水提取工藝參數(shù)方差分析表

由綜合評(píng)分方差分析結(jié)果可知，各因素對(duì)提取效果影響均為顯著。確定最終提取工藝為：提取次數(shù)2次、提取1 h、加水量25倍。

2.2 水提取工藝重復(fù)性驗(yàn)證結(jié)果

精密量取第5組A2B2C3方案的復(fù)方提取液，進(jìn)行五次處方提取，測(cè)定吸光度。得5批次阿魏酸RSD = 1.35%，五批次多糖RSD = 2.83%，重復(fù)性均良好（見表5）。

表5 參歸補(bǔ)血湯水提取工藝重復(fù)性驗(yàn)證結(jié)果

2.3 參歸補(bǔ)血湯對(duì)缺鐵性貧血小鼠相關(guān)指標(biāo)及Hepcidin改善作用

與空白組相比，模型組小鼠的耳朵和爪子明顯蒼白，眼暗淡無色，毛發(fā)脫落，反應(yīng)遲緩，體質(zhì)量降低；Hepcidin、FEP顯著升高（P＜ 0.01），Hb、SI、stfr，TIBC和體質(zhì)量明顯降低（P＜0.05或P＜0.01），證明貧血模型建立成功[9]。給藥15 d后，與模型組相比，參歸補(bǔ)血湯高劑量組小鼠的血常規(guī)指標(biāo)和體質(zhì)量明顯改善（P＜0.05或P＜0.01），且改善效果與陽(yáng)性藥相當(dāng)（見表6）。

表6 參歸補(bǔ)血湯對(duì)小鼠的體質(zhì)量和血常規(guī)指標(biāo)的影響（n=70）

2.4 參歸補(bǔ)血湯對(duì)IL-6誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞相關(guān)信號(hào)通路影響

2.4.1 參歸補(bǔ)血湯對(duì)HepG2細(xì)胞的抑制作用CCK8結(jié)果可知 50 μg·mL-1、100 μg·mL-1和 150 μg·mL-1參歸補(bǔ)血湯對(duì)癌細(xì)胞無抑制效果，濃度200～800 μg·mL-1湯劑對(duì)HepG2細(xì)胞毒性抑制作用顯著增加（P＜0.001），后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用200 μg·mL-1進(jìn)行機(jī)制驗(yàn)證。

2.4.2 參歸補(bǔ)血湯對(duì)IL-6誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞Hepcidin mRNA及相關(guān)信號(hào)通路蛋白影響結(jié)果表明參歸補(bǔ)血湯顯著降低經(jīng)IL-6造模后的Hepcidin mRNA的表達(dá)（P＜0.001）（見圖2）；同時(shí)，WB結(jié)果表明相關(guān)JAK2/STAT3信號(hào)通路蛋白表達(dá)量顯著減低（P＜0.001）（見圖3）。

圖1 CCK8檢測(cè)參歸補(bǔ)血湯對(duì)HepG2細(xì)胞抑制率的影響（n = 8）

圖2 參歸補(bǔ)血湯對(duì)IL-6 誘導(dǎo)HepG2 細(xì)胞的Hepcidin mRNA表達(dá)的影響（n = 3）

圖3 參歸補(bǔ)血湯對(duì)IL-6誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞的相關(guān)通路蛋白表達(dá)的影響（n=3）

3 討論

本實(shí)驗(yàn)表明參歸補(bǔ)血湯水提取工藝穩(wěn)定，提取效率佳；其對(duì)缺鐵性貧血小鼠貧血情況改善明顯，與模型組相比，小鼠血液中Hepcidin與FEP明顯下降，體質(zhì)量、Hb、Si、STfR及TIBC明顯增加，其高劑量組效果與陽(yáng)性藥組效果相似；其對(duì)IL6誘導(dǎo)的肝癌HepG2細(xì)胞共培養(yǎng)后Hepcidin mRNA表達(dá)顯著降低，相關(guān)p-JAK2及p-STAT3通路蛋白表達(dá)水平也顯著降低。結(jié)果表明參歸補(bǔ)血湯能通過抑制JAK2/STAT3通路下調(diào)Hepcidin的表達(dá)，從而達(dá)到改善缺鐵性貧血的作用。

Hepcidin是組織中鐵吸收和釋放的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，能維持對(duì)紅細(xì)胞和其他組織的穩(wěn)定鐵供應(yīng)，同時(shí)避免高水平鐵對(duì)器官產(chǎn)生的有害作用[4]。實(shí)驗(yàn)表明，通過抑制Hepcidin表達(dá)能夠升高貧血模型中血清鐵水平，進(jìn)而糾正貧血癥狀[5]，與本研究結(jié)論一致，說明參歸補(bǔ)血湯具有改善缺鐵性貧血作用。另外，Hepcidin在腫瘤細(xì)胞中合成升高，增加胞內(nèi)鐵保留，從而促進(jìn)腫瘤存活[6-8]。提示我們，能夠通過降低Hepcidin表達(dá)進(jìn)而促使鐵排出，達(dá)到抑制腫瘤的目的[9]。本研究中，參歸補(bǔ)血湯能降低肝癌HepG2細(xì)胞中Hepcidin mRNA表達(dá)，說明其調(diào)控鐵代謝不僅可改善缺鐵性貧血，亦具有抗腫瘤潛力。

IL-6能通過STAT3信號(hào)傳導(dǎo)刺激鐵調(diào)素轉(zhuǎn)錄。在未受刺激細(xì)胞中，STAT3在細(xì)胞質(zhì)中保持無活性形式。IL-6/STAT3通路可將刺激信號(hào)從細(xì)胞表面?zhèn)鲗?dǎo)至細(xì)胞核，從而調(diào)控Hepcidin表達(dá)[10]。先前研究證明，JAK2/STAT3通路能夠通過調(diào)控Hepcidin，達(dá)到抑制胃癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的作用[11]。本研究發(fā)現(xiàn)參歸補(bǔ)血湯能夠通過抑制JAK2/STAT3通路表達(dá)，而實(shí)現(xiàn)對(duì)Hepcidin的調(diào)控作用。