唾液牙齦卟啉單胞菌、MMP-8及TIMP-1水平與牙周炎的相關(guān)性分析

李明霞 徐玉 朱斐然 宋琳 李華 劉穎 張子路 楊秋波

[摘要] 目的 探討唾液生物標(biāo)志物牙齦卟啉單胞菌（P. gingivalis）、基質(zhì)金屬蛋白酶-8（MMP-8）及金屬蛋白酶組織抑制劑-1（TIMP-1）水平與牙周炎的相關(guān)性。 方法 選取2020年10月至2021年1月首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京口腔醫(yī)院牙周科收治的牙周炎患者25例作為牙周炎組，另外同期該院牙周健康者22名作為牙周健康組。記錄所有研究對象牙周臨床參數(shù)，收集非刺激性唾液，實時定量PCR測定P. gingivalis水平，ELISA測定MMP-8及TIMP-1水平。比較牙周炎組和牙周健康組唾液P. gingivalis、MMP-8、TIMP-1水平及MMP-8/TIMP-1比值，分析生物標(biāo)志物單獨或聯(lián)合應(yīng)用對牙周炎的診斷效能。 結(jié)果 牙周炎組唾液P. gingivalis、MMP-8水平及MMP-8/TIMP-1比值高于牙周健康組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。兩組TIMP-1水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。唾液P. gingivalis、MMP-8水平及MMP-8/ TIMP-1比值與牙周臨床參數(shù)均呈正相關(guān)。P. gingivalis和MMP-8單獨對Ⅱ期及以上牙周炎的預(yù)測價值中等，MMP-8/TIMP-1比值單獨、P. gingivalis聯(lián)合MMP-8和P. gingivalis聯(lián)合MMP-8/TIMP-1比值對Ⅱ期及以上牙周炎的預(yù)測價值均較高。 結(jié)論 唾液P. gingivalis，MMP-8，尤其是MMP-8/TIMP-1比值及其聯(lián)合是檢測Ⅱ期及以上牙周炎的潛在候選，唾液生物標(biāo)志物的聯(lián)合應(yīng)用進一步提高了牙周診斷的準(zhǔn)確性。

[關(guān)鍵詞] 牙周炎;唾液;牙齦卟啉單胞菌;基質(zhì)金屬蛋白酶-8;金屬蛋白酶組織抑制劑-1

[中圖分類號] R781.4? ? ? ? ? [文獻標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2021）28-0013-05

Correlation between salivary Porphyromonas gingivalis， MMP-8 and TIMP-1 levels and periodontitis

LI Mingxia1? ?XU Yu1? ?ZHU Feiran1? ?SONG Lin2? ?LI Hua2? ?LIU Ying1? ?ZHANG Zilu1? ?YANG Qiubo1

1.Beijing Institute of Dental Research， Capital Medical University School of Stomatology， Beijing? 100050， China; 2.Department of Periodontics， Beijing Stomatological Hospital， Capital Medical University， Beijing? ?100050， China

[Abstract] Objective To investigate the correlation between salivary biomarkers Porphyromonas gingivalis （P. gingivalis）， matrix metalloproteinase-8 （MMP-8）， and tissue inhibitor of metalloproteinase-1 （TIMP-1） levels and periodontitis. Methods A total of 25 patients with periodontitis admitted to the Department of Periodontics of Beijing Stomatological Hospital， Capital Medical University from October 2020 to January 2021 were selected as the periodontitis group. Another 22 subjects of periodontal health in the hospital during the same period were selected as the periodontally healthy group. Periodontal clinical parameters were recorded in all study subjects. Unstimulated saliva was collected. Real-time quantitative PCR was performed to determine P. gingivalis level. MMP-8 and TIMP-1 levels were measured by ELISA. The levels of P. gingivalis， MMP-8 and TIMP-1 and MMP-8/TIMP-1 ratio in saliva were compared between the periodontitis and control groups， and the diagnostic power of biomarkers for periodontitis was analyzed. Results Salivary P. gingivalis， MMP-8 levels， and MMP-8/TIMP-1 ratio in the periodontitis group were higher than those in the periodontally healthy group， and the differences were statistically significant （P<0.05）. There was no significant difference in TIMP-1 level between the two groups （P>0.05）. Salivary P. gingivalis， MMP-8 levels， and MMP-8/TIMP-1 ratio were positively correlated with periodontal clinical parameters. The predictive value of P. gingivalis and MMP-8 alone for stage Ⅱ and above periodontitis was moderate. The predictive value of MMP-8/TIMP-1 ratio alone， P. gingivalis combined with MMP-8， and P. gingivalis combined with MMP-8/TIMP-1 ratio for stage Ⅱ and above periodontitis was high. Conclusion Salivary P. gingivalis， MMP-8， especially MMP-8/TIMP-1 ratio， and their combinations are potential candidates for detecting stage Ⅱ and above periodontitis， and the combination of salivary biomarkers further improves the accuracy of periodontal diagnosis.

[Key words] Periodontitis; Saliva; Porphyromonas gingivalis; Matrix metalloproteinase-8; Tissue inhibitor of metalloproteinase-1

牙周炎是發(fā)生在牙齒支持組織（牙周組織）的疾病，如果不及時診斷和治療，會導(dǎo)致牙周軟組織和硬組織不可逆破壞，最終導(dǎo)致牙齒脫落[1]。牙周炎不僅是導(dǎo)致成年人牙齒喪失的主要原因，還與廣泛的系統(tǒng)性疾病有關(guān)[2]。目前牙周炎的診斷主要依靠牙周檢查，而傳統(tǒng)牙周檢查的準(zhǔn)確性依賴于檢查者的臨床經(jīng)驗，主觀性較強，通常需要牙周?？漆t(yī)師完成。唾液作為無創(chuàng)，易取的一種生物液體，可反映口腔整體情況。研究已經(jīng)揭示了識別和測定唾液中的生物標(biāo)志物用于診斷牙周病及監(jiān)測進展的潛力[3]。目前大多研究僅探究單一生物標(biāo)志物與牙周炎的關(guān)系。然而，使用單一的唾液標(biāo)志物來檢測牙周炎，受到疾病的偶發(fā)性和多因素特征的挑戰(zhàn)，敏感度和特異度較低，聯(lián)合使用唾液生物標(biāo)志物會產(chǎn)生更可靠的結(jié)果[3-4]。與牙周炎相關(guān)的生物標(biāo)志物根據(jù)其來源可分為微生物源性和宿主源性。在關(guān)于牙周病的微生物病因研究中，牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonas gingivalis，P. gingivalis）被認(rèn)為是牙周炎的關(guān)鍵病原體[5]。多項研究證實，唾液中P. gingivalis水平與牙周炎相關(guān)[6-7]。而牙周組織的降解主要是由炎癥過程中宿主釋放的酶引起的，特別是細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶（Matrix metalloproteinases，MMPs）[8]。其中，MMP-8被報道為牙周病的主要金屬蛋白酶，多項研究證明其與牙周病的嚴(yán)重程度有關(guān)，高水平存在于齦溝液和唾液中[8-10]。金屬蛋白酶組織抑制劑-1（Tissue inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1）是MMPs的主要抑制劑，分布廣泛，精確調(diào)控MMPs的活性和功能[11]，MMP/TIMP比值往往決定細(xì)胞外基質(zhì)蛋白降解的程度。因此本研究提出，將微生物來源的P. gingivalis和宿主來源的MMP-8及TIMP-1聯(lián)合應(yīng)用分析其與牙周炎的關(guān)系，為牙周炎生物標(biāo)志物的聯(lián)合應(yīng)用提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2020年10月至2021年1月首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京口腔醫(yī)院牙周科收治的牙周炎患者25例作為牙周炎組，另外同期該院牙周健康者22名作為牙周健康組，根據(jù)2018年最新牙周病與植體周病新分類診斷標(biāo)準(zhǔn)[12]。牙周炎（Ⅱ期及以上）組納入標(biāo)準(zhǔn)：①鄰間最嚴(yán)重位點臨床附著喪失（Clinical attachment loss，CAL）≥3 mm，伴有探診深度（Probing depth，PD）≥5 mm，影像學(xué)骨喪失至少大于牙根全長15%;②患者知情同意并簽署知情同意書。牙周健康組納入標(biāo)準(zhǔn)：①完整牙周組織的牙齦健康，PD≤3 mm且探診出血（Bleeding on probing，BOP）<10%，無附著喪失位點，無牙槽骨破壞影像學(xué)征象，無牙周炎病史;②患者知情同意并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①年齡<18歲，無自主決定能力者;②有吸煙史者;③有相關(guān)系統(tǒng)性疾病或狀況者，如糖尿病;④3個月內(nèi)服用過抗生素或抗炎藥物者;⑤12個月內(nèi)接受過牙周治療者;⑥備孕、妊娠或哺乳期女性;⑦口內(nèi)余留牙少于20顆者;⑧存在唾液過少相關(guān)疾病者，如干燥綜合征。記錄所有研究對象牙周臨床參數(shù)，包括菌斑指數(shù)（Plaque index，PLI）、PD、CAL、BOP及牙齦指數(shù)（Gingival index，GI）。本研究已通過首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京口腔醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審查（CMUSH-IRB-KJ-PJ-2020-16）批準(zhǔn)。

1.2 試劑與設(shè)備

1.2.1 主要試劑? 細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司）、引物和質(zhì)粒（生工生物工程股份有限公司）、PowerUp SYBR Green Master Mix（美國Thermo SCIENTIFIC），人總MMP-8和人TIMP-1 ELISA試劑盒（美國R&D公司）。

1.2.2 主要設(shè)備? 臺式高速冷凍離心機和NanoDrop 2000超微量紫外分光光度計（美國Thermo SCIENTIFIC）、SpectraMax Paradigm多功能酶標(biāo)儀（美國Molecular Devices）和CFX熒光定量PCR儀（美國Bio-Rad）。

1.3 方法

1.3.1 牙周臨床參數(shù)記錄? 記錄所有研究對象牙周臨床參數(shù)，包括PLI、PD、CAL、BOP及GI。PLI計分標(biāo)準(zhǔn)：0=齦緣區(qū)無菌斑;1=齦緣區(qū)的牙面有薄的菌斑，但視診不易見，若用探針尖的側(cè)面可刮出菌斑;2=在齦緣或鄰面可見中等量菌斑;3=齦溝內(nèi)或齦緣區(qū)及鄰面有大量軟垢。PD是指齦緣至袋底的距離。CAL是指釉牙骨質(zhì)界至袋底的距離。BOP是根據(jù)探診后15 s牙齦有無出血，記為BOP陽性或陰性。GI計分標(biāo)準(zhǔn)：0=正常牙齦;1=牙齦略有水腫，探針探之不出血;2=牙齦水腫并探診出血;3=牙齦有自發(fā)出血傾向或潰瘍。

1.3.2 樣本采集? 采集所有受試者無刺激性唾液樣本，過程如下：2 h禁食、禁水，自來水輕輕漱口，然后取坐位，稍低頭，讓唾液在口腔底部聚集，從口角被動地流入10 mL的無菌離心管內(nèi)。若唾液中有血液或食物殘渣則棄用該樣本，重新取樣。每管200 μL唾液樣本分裝，10 000×g，4℃離心5 min，收集上清和沉淀，分別于-20℃儲存。

1.3.3 實時定量PCR測定P. gingivalis水平? ①提取細(xì)菌DNA：使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取唾液沉淀細(xì)菌DNA，操作步驟按照試劑盒說明書進行。紫外分光光度計檢測DNA濃度與純度，A260/A280比值應(yīng)為1.7～1.9，提取DNA于-20℃儲存。②質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品制備：選取質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品，質(zhì)粒基因序列選取GenBank L16492.1 P. gingivalis ATCC 33277 16S核糖體RNA基因部分序列，測序結(jié)果與 GenBank 上提交的序列進行比對（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）。利用紫外分光光度計測A260計算標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的質(zhì)量濃度，依據(jù)以下公式計算：質(zhì)粒DNA濃度（copies/μL）=質(zhì)粒濃度（ng/μL）/質(zhì)粒分子量×NA;質(zhì)粒分子量=（載體堿基數(shù)+插入片段）×2×堿基平均分子量（324.5 g/mol）。NA為阿伏伽德羅常數(shù)，其值為6.02×1023 copies/mol。將質(zhì)粒10倍比稀釋為103～108 copies/μL，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。③實時定量PCR：參照Yang等[13]設(shè)計P. gingivalis引物，正向引物：5'-ACTGTCTTCCTTC-ACGCGACTT-3'，反向引物：5'-GGAGGCAGCAGTG-AGGAATATT-3'，擴增長度為72 bp。PCR反應(yīng)體系的組成：2.0 μL引物，10.0 μL PowerUp SYBR Green Master Mix，2.0 μL 模板DNA，6.0 μL ddH2O，總體積為20.0 μL。PCR反應(yīng)條件：50℃ UDG酶激活 2 min，95℃ 預(yù)變性2 min，40個循環(huán)（95℃變性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min）。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣本中P. gingivalis濃度。

1.3.4 ELISA測定MMP-8及TIMP-1水平? 使用MMP-8及TIMP-1 ELISA試劑盒檢測唾液上清中MMP-8及TIMP-1水平，操作步驟按照試劑盒說明書進行。在5 min內(nèi)測定每孔的光密度，酶標(biāo)儀測定波長設(shè)置為450 nm，校正波長設(shè)置為540 nm。使用試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算濃度，再乘以稀釋倍數(shù)即為樣本實際濃度。并計算MMP-8/TIMP-1比值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 26.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以中位數(shù)[M（P25，P75）]表示，各組間數(shù)據(jù)的比較采用Mann-Whitney U檢驗，采用Spearman 秩相關(guān)分析之間的相關(guān)性，采用Logistic回歸分析和受試者工作特征（Receiver operating characteristic，ROC）曲線評價唾液生物標(biāo)志物與牙周炎的關(guān)系，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組牙周臨床參數(shù)比較

牙周炎組牙周臨床參數(shù)PLI、PD、CAL、BOP陽性率及GI均高于牙周健康組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

2.2 兩組唾液生物標(biāo)志物水平比較

牙周炎組P. gingivalis、MMP-8水平及MMP-8/ TIMP-1比值高于牙周健康組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。兩組TIMP-1水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表2。

2.3 唾液生物標(biāo)志物水平與牙周臨床參數(shù)的相關(guān)性

通過Spearman 秩相關(guān)分析，P. gingivalis、MMP-8水平及MMP-8/ TIMP-1比值與牙周各臨床參數(shù)之間均呈正相關(guān)，其中MMP-8/ TIMP-1比值與牙周各臨床參數(shù)之間相關(guān)性最強。見表3。

2.4 唾液MMP-8水平、MMP-8/TIMP-1比值與P. gingivalis的相關(guān)性

通過Spearman 秩相關(guān)分析，MMP-8水平及MMP-8/TIMP-1比值與P. gingivalis呈正相關(guān)。見表4。

2.5 唾液生物標(biāo)志物在牙周炎中的診斷效能

ROC曲線，又稱為感受性曲線，是反映敏感度和特異度連續(xù)變量的綜合指標(biāo)，其是根據(jù)一系列不同的二分類方式（分界值或決定閾），以敏感度為縱坐標(biāo)，1-特異度為橫坐標(biāo)繪制的曲線。見封三圖1～2。

ROC曲線可直觀地比較兩種或兩種以上不同診斷試驗對疾病的識別能力，也可通過ROC曲線下面積（Area under curve，AUC）進行比較。AUC是指ROC曲線下與坐標(biāo)軸圍成的面積，通常介于0.5～1之間，AUC越大，診斷準(zhǔn)確性越高。統(tǒng)計學(xué)上一般認(rèn)為，AUC≤0.7，表示預(yù)測價值較低;AUC為0.7～0.9，表示預(yù)測價值中等;AUC>0.9，可認(rèn)為預(yù)測價值較高?？芍?，P. gingivalis和MMP-8水平單獨對Ⅱ期及以上牙周炎的預(yù)測價值中等，MMP-8/TIMP-1比值單獨、P. gingivalis聯(lián)合MMP-8水平和P. gingivalis聯(lián)合MMP-8/TIMP-1比值對Ⅱ期及以上牙周炎的預(yù)測價值均較高。其中，P. gingivalis聯(lián)合MMP-8/TIMP-1比值對Ⅱ期及以上牙周炎的預(yù)測價值最高。使用約登指數(shù)（靈敏度和特異度之和減去1）為每個生物標(biāo)志物獲得區(qū)分牙周健康和牙周炎的最佳截點，即臨界值，并求出相應(yīng)的敏感度和特異度?？芍?，相較于其他唾液生物標(biāo)志物，綜合考慮敏感度和特異度時，P. gingivalis聯(lián)合MMP-8/TIMP-1比值的臨界值取5.804時，診斷Ⅱ期及以上牙周炎的敏感度和特異性最好，分別為0.880和0.818。見表5。

3 討論

生物標(biāo)志物是一項經(jīng)客觀測量能夠反映人體內(nèi)生理或病理過程改變的代表性指標(biāo)，其所提供的信息在疾病預(yù)測、診斷、預(yù)后判斷、療效評價和疾病監(jiān)測等方面具有重要價值。大量研究證實，唾液中檢測到的特定細(xì)菌或宿主來源的生物標(biāo)志物可表明牙周炎的存在、進展或緩解。研究者提出，在唾液中同時檢測微生物來源和宿主來源的生物標(biāo)志物可以大大提高牙周診斷的準(zhǔn)確性[4]。因此，本研究將聯(lián)合應(yīng)用微生物來源和宿主來源的目前最有用或最有效的生物標(biāo)志物，分析其對牙周炎的診斷效能，為牙周炎生物標(biāo)志物的聯(lián)合應(yīng)用提供依據(jù)。

本研究結(jié)果顯示，牙周炎患者唾液中P. gingivalis、MMP-8水平及MMP-8/TIMP-1比值高于牙周健康組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），且與牙周臨床參數(shù)呈正相關(guān)。O'Brien-Simpson等[6]證實，唾液中P. gingivalis水平與牙周臨床參數(shù)呈正相關(guān)，且與齦下菌斑中P. gingivalis水平相關(guān)。Zhang等[14]研究者表示，牙周炎患者唾液MMP-8水平明顯高于牙周健康組，可作為牙周炎的生物標(biāo)志物。Gursoy等[15]研究表明，唾液MMP-8水平，特別是MMP-8/TIMP-1比值是晚期牙周炎的潛在檢測對象，而且在吸煙牙周炎和牙周健康組中仍存在差異。研究還發(fā)現(xiàn)，牙周炎患者MMP-8水平在牙周非手術(shù)治療后降低[16-17]，持續(xù)升高的MMP-8濃度可能表明傳統(tǒng)牙周治療反應(yīng)不良的患者[17]?？芍?，上述研究與本研究結(jié)果一致，均證實唾液P. gingivalis、MMP-8水平及MMP-8/TIMP-1比值可為牙周炎的候選生物標(biāo)志物。

本研究表明，相對于生物標(biāo)志物P. gingivalis和MMP-8水平，MMP-8/TIMP-1比值、P. gingivalis聯(lián)合MMP-8水平和P. gingivalis聯(lián)合MMP-8/TIMP-1比值對牙周炎的預(yù)測價值較高。Salminen等[18]研究了唾液四種主要牙周病原體在牙周炎診斷中的價值，發(fā)現(xiàn)與四種病原菌單獨分析相比，病原菌組合與牙周炎的相關(guān)性更強。Gursoy等[15]研究者證實，唾液MMP-8，TIMP-1，Ⅰ型膠原羧基端吡啶并啉交聯(lián)肽，特別是它們的比值和組合是檢測晚期牙周炎的潛在候選生物標(biāo)志物。Gursoy等[19]研究小組聯(lián)合應(yīng)用P. gingivalis、白細(xì)胞介素-1β和MMP-8開發(fā)了一種累積風(fēng)險評分的診斷方法，結(jié)果表明該方法在檢測牙周炎中為單一生物標(biāo)志物的固定閾值帶來了額外的能力。這些研究均證實，牙周炎唾液生物標(biāo)志物的聯(lián)合應(yīng)用提高了對牙周炎的診斷能力。

雖然ROC曲線分析在生物標(biāo)志物研究中常用，但選擇的臨界值的診斷能力高度依賴于測量的生物標(biāo)志物的濃度范圍和研究人群中疾病的患病率[19]。因此，本研究后期應(yīng)加大樣本量，在大樣本研究中驗證臨界值的診斷能力。研究提出，當(dāng)考慮在牙周病的個性化模型中使用唾液的可能性時，應(yīng)該在多個層次上進行，包括篩查、疾病檢測、治療結(jié)果監(jiān)測和難治性或進展性病例的識別[8]。因此，本研究后續(xù)也應(yīng)開展縱向研究，探討唾液生物標(biāo)志物水平變化與牙周炎進展及治療預(yù)后的關(guān)系，為牙周炎唾液生物標(biāo)志物的應(yīng)用提供更多依據(jù)。

綜上所述，在目前的研究范圍內(nèi)，可以得出結(jié)論，唾液P. gingivalis，MMP-8，尤其是MMP-8/TIMP-1比值及其聯(lián)合是檢測Ⅱ期及以上牙周炎的潛在候選，唾液標(biāo)志物的聯(lián)合應(yīng)用進一步提高了牙周診斷的準(zhǔn)確性。

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（收稿日期：2021-04-12）