一株產(chǎn)紅色素的壯觀鏈霉菌分離鑒定及其發(fā)酵條件優(yōu)化

蔡婉瑤　蒲佳琳　葛雯　廖淑敏　張卉

摘要：從5個地區(qū)采集樣本，對樣本分離篩選后，利用形態(tài)學(xué)鑒定和16SrDNA序列分析構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，篩選出1株產(chǎn)紅色素的壯觀鏈霉菌AX-3。利用單因素和正交試驗確定菌株的最佳發(fā)酵配方為：可溶性淀粉2%、甘油2%、硝酸鉀0.2%、磷酸氫二鉀0.02%、氯化鎂0.02%、氯化鈉0.01%。

關(guān)鍵詞：鏈霉菌;天然色素;正交試驗;紅色素;發(fā)酵優(yōu)化

中圖分類號：TQ920.6? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A? ? 文章編號：1674-1161（2021）06-0059-04

色素廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、紡織等領(lǐng)域。近年來，國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)合成色素具有一定的毒性和致癌性，使得開發(fā)安全性更高的天然色素成為新趨勢。微生物源色素具有不受季節(jié)和環(huán)境限制、生產(chǎn)周期短等優(yōu)點，應(yīng)用前景廣闊。從自然界分離的色素微生物產(chǎn)量低，性質(zhì)不穩(wěn)定。從土壤分離得到1株產(chǎn)紅色素的鏈霉菌AX-3，對該菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，明確其分類地位，并通過正交試驗優(yōu)化其產(chǎn)色素條件，旨在提高色素產(chǎn)量和降低發(fā)酵成本，為該色素的產(chǎn)業(yè)化奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌株來源 土壤樣本采集自西安市秦嶺山地、鞍山市岫巖花園、大連市甘井子區(qū)、三明市泰寧縣、遼陽市牛犋村共5個地區(qū)。

1.1.2 培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基，NA培養(yǎng)基，高氏一號培養(yǎng)基。種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基：參照朱運平方法。

1.2 菌株的分離和純化

分別利用高氏一號培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基和NA培養(yǎng)基，采用稀釋涂布平板法分離樣品中的微生物，于28 ℃倒置培養(yǎng)7 d后，再于37 ℃倒置培養(yǎng)2 d。挑取帶顏色的單菌落進(jìn)行劃線純化。將純化后的鏈霉菌AX-3接種于高氏斜面培養(yǎng)基中培養(yǎng)并保藏。

1.3 菌株AX-3的鑒定

1.3.1 形態(tài)鑒定 觀察菌株AX-3在高氏一號培養(yǎng)基的菌落形態(tài)，并利用掃描電鏡觀察菌絲孢子形態(tài)特征和排列。

1.3.2 分子生物學(xué)鑒定 常規(guī)方法提取AX-3菌株DNA，采用放線菌通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至華大基因公司測序。通過NCBI進(jìn)行BLAST比對，分別采用MEGA7.0軟件和Neighbor-Joining方法進(jìn)行序列分析和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 色素提取

取發(fā)酵液10 000 r/min離心10 min，沉淀用無菌水洗滌3次，收集菌體。乙酸乙酯與菌體20︰1混懸，超聲處理后10 000? r/min離心10 min，得到色素溶液，在467 nm測定吸光度。

1.5 單因素試驗

1.5.1 碳源優(yōu)化 以相同濃度的玉米粉、葡萄糖、甘油、可溶性淀粉、甘油和葡萄糖（1︰1）、甘油和可溶性淀粉（1︰1）作為發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源，其他條件不變。

培養(yǎng)測定條件為：裝液量50 mL/250 mL，接種量10%，于28 ℃、180 r/min條件下發(fā)酵7 d后，取發(fā)酵液離心測定色素含量。每個處理3個重復(fù)。

1.5.2 氮源優(yōu)化 分別以相同濃度的硝酸鉀、酵母浸膏、硝酸銨、酵母浸膏和硝酸銨（1︰1）、氯化銨作為發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源，碳源為甘油和可溶性淀粉，其他條件不變。培養(yǎng)測定條件同1.5.1。

1.5.3 溫度優(yōu)化 分別設(shè)定發(fā)酵溫度為22，25，28，31，

34 ℃，在可溶性淀粉1%、甘油1%、硝酸鉀0.1%、磷酸氫二鉀0.02%、氯化鎂0.02%、氯化鈉0.01%的培養(yǎng)基培養(yǎng)。培養(yǎng)測定條件同1.5.1。

1.6 正交試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選取篩選出最佳碳源、氮源3個因素，分別取3個水平進(jìn)行L9（33）正交試驗，每個處理3個重復(fù)，因素設(shè)計見表1。

1.7 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 25.0進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 鏈霉菌AX-3的分離及篩選結(jié)果

將15株土樣通過稀釋涂布平板法培養(yǎng)，獲得9株有顏色的土壤菌株，如表2所示。對這些菌株進(jìn)行平板劃線分離，獲得2株顏色鮮艷的土壤放線菌，分別為紅色放線菌和黃色放線菌。對這兩株土壤放線菌進(jìn)行復(fù)篩，發(fā)現(xiàn)紅色放線菌長勢更好，因此選定鏈霉菌AX-3進(jìn)行后續(xù)研究。

2.2 鏈霉菌AX-3鑒定

經(jīng)鑒定，菌株AX-3為壯觀鏈霉菌（Streptomyces spectabilis），其形態(tài)特征和掃描電鏡觀察如圖1所示。其菌落呈圓形，中間有突起，氣生菌絲為紅色。孢子絲連在一起，呈網(wǎng)狀，且表面粗糙。鏈霉菌AX-3的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖2所示。

2.3 碳源種類對鏈霉菌AX-3的影響

不同碳源對色素產(chǎn)量的影響見圖3。

結(jié)果表明：在相同培養(yǎng)時間內(nèi)，不同碳源對色素產(chǎn)量的影響不同，甘油和可溶性淀粉作為碳源時鏈霉菌AX-3色素產(chǎn)量最大，甘油次之。菌種對這2種碳源利用效果最好，因而選擇甘油和可溶性淀粉作為碳源。

2.4 氮源種類對鏈霉菌AX-3的影響

在最佳碳源培養(yǎng)基中分別添不同氮源作為唯一氮源，對色素產(chǎn)量的影響如圖4所示。

結(jié)果表明，在相同培養(yǎng)時間內(nèi)，幾種氮源對色素產(chǎn)量的影響不同。硝酸鉀作為氮源時，鏈霉菌色素產(chǎn)量最高，因此選擇硝酸鉀作為氮源。

2.5 發(fā)酵溫度對鏈霉菌AX-3的影響

溫度對色素產(chǎn)量的影響如圖5所示。

結(jié)果表明：溫度為22～28 ℃時，溫度升高有利于生長代謝和色素產(chǎn)生，色素含量逐漸增加;當(dāng)溫度為28 ℃時，培養(yǎng)菌體產(chǎn)生的色素含量較高;溫度為28～34 ℃時，隨著溫度升高代謝速度隨之下降，影響菌體正常生長，導(dǎo)致色素含量降低。因此，選擇28 ℃作為發(fā)酵培養(yǎng)溫度。

2.6 正交試驗分析

由表3—4可以看出：3個因素中有2個對菌體色素產(chǎn)量有明顯影響;由極差分析結(jié)果確定C>B>A，即硝酸鉀>甘油>可溶性淀粉;菌體發(fā)酵產(chǎn)色素的最高組合為可溶性淀粉2%、甘油2%、硝酸鉀0.02%。在此條件下，測得色素OD467值為0.524。綜合分析，選取菌體發(fā)酵產(chǎn)色素的最佳組合為A2B2C2。

3 結(jié)論

從遼寧鞍山岫巖花園土中分離篩選一株產(chǎn)紅色素的鏈霉菌AX-3，鑒定為壯觀鏈霉菌屬（Streptomyces

spectabilis）。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用正交試驗優(yōu)化該菌株產(chǎn)紅色素的發(fā)酵條件，得出最佳發(fā)酵培養(yǎng)基組分為：可溶性淀粉2%、甘油2 %、硝酸鉀0.2%、磷酸氫二鉀0.02%、氯化鎂0.02%、氯化鈉0.01%。

試驗數(shù)據(jù)可為該菌株所產(chǎn)紅色素的分離純化、組分分析等方面提供試驗依據(jù)，也為色素在食品、化妝品等行業(yè)中的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。目前，對鏈霉菌AX-3分子量、化學(xué)式等尚不了解，今后應(yīng)開展對色素組分分離和結(jié)構(gòu)鑒定的研究。

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Isolation and Identification of a Red Pigment Producing Streptomyces

Spectabilis and Optimization of Fermentation Conditions

CAI Wanyao， PU Jialin， GE Wen， LIAO Shumin， ZHANG Hui*

（College of Pharmaceutical and Biological Engineering Shenyang University of Chemical Technology， Shenyang 110142， China）

Abstract： Samples were collected from five regions and after sample isolation and screening， a phylogenetic tree was constructed using morphological identification and 16SrDNA sequence analysis to screen one red pigment Streptomyces spectabilis AX-3. The best fermentation formula of the strains was determined by single factor and orthogonal tests： Soluble starch 2%， glycerol 2%， potassium nitrate 0.2%， potassium bisphosphate 0.02%， magnesium chloride 0.02%? and sodium chloride 0.01% .

Key words： streptomycete; natural pigment; orthogonal test; red pigment; fermentation optimization

收稿日期：2021-10-12

基金項目：沈陽化工大學(xué)創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)大賽國家級項目（202010149018）

作者簡介：蔡婉瑤（2000—），女，從事生物工程方面的研究。

通信作者：張 卉（1968—），女，博士，副教授，從事天然產(chǎn)物的研究與開發(fā)。