遵義煙區(qū)不同海拔下植煙土壤細(xì)菌群落及影響因素分析

李茂森 高衛(wèi)鍇, 任天寶 蔣石香 何小亞 駱樂琴 云 菲 柯曉婷

（1河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院/河南省生物炭研究工程技術(shù)中心/生物炭技術(shù)河南省工程實驗室，450002，河南鄭州；2廣東中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，510032，廣東廣州；3貴州省煙草公司遵義市公司，563000，貴州遵義）

海拔是烤煙種植區(qū)域類型選擇的重要影響因素之一[1-2]，海拔的變化常常會導(dǎo)致環(huán)境發(fā)生顯著變化，光、溫、水、土等資源也會隨之改變，影響土壤的發(fā)育和理化性質(zhì)[3-4]。土壤微生物是評價土壤質(zhì)量和健康狀況的重要指標(biāo)之一，對土壤外部環(huán)境的變化十分敏感[5]。土壤微生物在土壤生物地球化學(xué)循環(huán)過程中具有重要的作用[6]。研究[7]發(fā)現(xiàn)，土壤環(huán)境可以影響土壤微生物群落結(jié)構(gòu)及其多樣性，主要包括土壤含水量、pH和土壤類型等，其中土壤pH往往是支配土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和功能菌組成的首要因子。隨著對土壤微生物研究的日益深入，微生物地理分布規(guī)律的研究受到廣泛關(guān)注。雖然人們一直試圖揭示土壤微生物群落組成、結(jié)構(gòu)及多樣性在空間上如何變化，以及它們與生態(tài)系統(tǒng)中物理、化學(xué)和生物特征的關(guān)系，但是對微生物的地理分布以及影響它們的生物和非生物因素知之甚少[5]。已有研究[8]認(rèn)為，土壤微生物在水平梯度上具有空間分異規(guī)律。垂直梯度作為一種綜合環(huán)境因子，會導(dǎo)致山地的生境差異及溫度、光照、降雨、土壤等多方面環(huán)境因子的改變，影響物種多樣性，進(jìn)而造成土壤細(xì)菌群落組成在海拔梯度上的差異。

目前，植煙土壤微生物多樣性方面前人已有較多研究，但關(guān)于不同海拔下植煙土壤微生物多樣性的差異，以及導(dǎo)致不同海拔植煙土壤微生物多樣性變化的環(huán)境主導(dǎo)因子方面的研究鮮有報道。因此，以貴州省遵義地區(qū)不同海拔下植煙土壤為研究對象，開展2個方面的研究：一是分析植煙土壤微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性在不同海拔下的變化趨勢；二是明晰植煙土壤中影響優(yōu)勢微生物群落的重要生態(tài)因子，以豐富不同海拔下植煙土壤細(xì)菌群落基礎(chǔ)理論并為烤煙的大田管理提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗區(qū)概況與材料

2020年在貴州省遵義市播州區(qū)下轄鴨溪鎮(zhèn)鴨溪基地單元進(jìn)行取樣，該地區(qū)年降雨量1043.4mm，平均氣溫14.6℃，無霜期280d。地形以低山丘陵和崗前緩坡為主，海拔800～1200m。土壤以水稻土和山地黃壤為主。取樣地點共有3處，其概況及土壤理化性質(zhì)見表1。

表1 不同取樣地點概況及植煙土壤理化指標(biāo)Table 1 Physicochemical indexes of tobacco planting soil at different sample sites

供試烤煙品種為云煙87，3個海拔烤煙的移栽期、栽培及施肥技術(shù)措施完全相同。肥料為貴州省煙草公司統(tǒng)一提供的煙草專用肥，栽培措施按照《貴州特色優(yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)規(guī)范》進(jìn)行，2020年4月中旬移栽。3個海拔處理的煙株大田生育期基本相同。

1.2 測定項目及方法

1.2.1 供試土壤與樣品采集 2020年9月1日，在貴州省遵義市鴨溪基地單元沿著海拔按200m高度差進(jìn)行采樣，3個采樣地，分別為江北咀、新華村和新土村，分別記為ZL、ZS和ZH。按5點取樣法進(jìn)行取樣，每個處理取5株，收集完成后混勻并分為3部分，一部分用干冰保存在10mL無菌離心管中，用于檢測微生物多樣性；一部分保存于-4℃冰箱，用于檢測土壤微生物量；一部分在陰涼處自然風(fēng)干后研磨，用于分析土壤理化性質(zhì)。

1.2.2 土壤理化指標(biāo)及養(yǎng)分 參照《土壤農(nóng)業(yè)化學(xué)分析方法》[9]測定土壤理化性質(zhì)，對采樣點做平行組。采用烘干法測定土壤含水率；采用環(huán)刀法測定土壤容重；以超純水為浸提劑，按照土:水=1:2.5浸提，用精密pH計（型號：IS128C）直接測定pH；采用碳酸氫鈉浸提法測定土壤速效磷含量；采用濃硫酸―重鉻酸鉀外加熱法測定土壤有機碳含量；采用堿解擴散法測定堿解氮含量；采用氯仿熏蒸―硫酸鉀浸提法測定微生物量碳、氮含量[10]。

1.2.3 土壤細(xì)菌多樣性 使用E.Z.N.A.?soil試劑盒（OMEGA）進(jìn)行土壤DNA提取和PCR擴增，利用 NanoDrop 2000超微量分光光度計（Thermo Fisher Scientific公司）檢測DNA純度，檢測合格后用338F和806R引物對V3-V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴增[11]。

用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物，混合后送IlluminaMiSeq平臺進(jìn)行基因序列測定[11]。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析

用Excel 2016整理數(shù)據(jù)，用SPSS 22.0進(jìn)行方差分析以及主成分分析，用R軟件的vegan包繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同海拔下土壤細(xì)菌α多樣性

所有樣品共獲得有效序列 717 026條。依據(jù)97%序列相似性對所測序列進(jìn)行聚類分析，樣本平均OTUs數(shù)為4028。3個海拔處理的共有OTUs數(shù)為2466，高海拔處理OTUs數(shù)顯著高于低海拔處理（圖1）。

圖1 不同海拔條件下土壤細(xì)菌群落OTUs數(shù)Fig.1 OTUs number of soil bacterial community at different altitudes

由表2可得，Simpson指數(shù)、Shannon指數(shù)和Chao指數(shù)均在 ZS和 ZH處理之間表現(xiàn)出顯著差異，其中ZS處理的Shannon和Chao指數(shù)顯著高于ZH處理，而Simpson指數(shù)則相反，土壤細(xì)菌多樣性和群落豐富度在中低海拔地區(qū)表現(xiàn)較好。試驗樣本測序覆蓋度均達(dá)到98%以上，滿足后續(xù)分析。

表2 海拔對土壤細(xì)菌群落α多樣性的影響Table 2 Effects of altitude on α diversity of soil bacterial community

2.2 不同海拔土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

2.2.1 土壤細(xì)菌門水平上物種相對豐度 如圖2所示，植煙土壤中的優(yōu)勢菌門分別為放線菌門（Actinobacteriota）、變形菌門（Proteobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）和酸桿菌門（Acidobacteriota），其相對豐度之和達(dá)到79.11%以上。不同海拔下，門水平上土壤細(xì)菌豐度具有一定的差異，放線菌門的相對豐度以ZL處理最高，相較于ZH處理提高了34.22%；變形菌門表現(xiàn)則相反，ZH處理變形菌門豐度較ZL處理有明顯提高（圖3）。綠彎菌門與酸桿菌門豐度在3個海拔中表現(xiàn)較為一致，均為ZS＞ZL＞ZH，其中ZL和ZH處理綠彎菌門和酸桿菌門豐度差異不大。

圖2 門水平上細(xì)菌群落相對豐度Fig.2 Relative abundance of bacterial community on phylum level

圖3 ZL和ZH處理門水平上細(xì)菌群落相對豐度比較Fig.3 Comparison of relative abundance of bacterial communities on phylum level between ZL and ZH treatment

2.2.2 對土壤細(xì)菌群落主成分的影響 土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)主成分分析如圖4所示，PC1軸和PC2軸對樣本組成差異的貢獻(xiàn)值分別為 47.09%和17.25%。由圖4a可以看出，ZL與ZS處理樣本點的距離較近，說明這2個處理的土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似，但與ZH處理的距離較遠(yuǎn)，說明海拔對土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)有明顯的影響，且隨著海拔的高度差變大，影響也變大。由圖4b可以看出，ZL和ZS處理呈左偏態(tài)分布，且重合較多；ZH處理呈右偏態(tài)分布，與ZL和ZS處理表現(xiàn)出明顯的分離。

2.3 不同海拔下土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與土壤環(huán)境因子的相關(guān)性分析

門水平上相對豐度前20名的細(xì)菌門類與土壤因子之間的相關(guān)關(guān)系如圖5所示。pH、速效鉀、溫度和微生物量氮均對土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出顯著性影響。其中變形菌門、擬桿菌門（Firmicutes）、髕骨菌門（Patescibacteria）和Armatimonadota與土壤微生物量氮和速效鉀均顯著相關(guān)。pH與藍(lán)細(xì)菌（Cyanobacteria）和Armatimonadota顯著正相關(guān)（P＜0.01和P＜0.001），與變形菌門顯著負(fù)相關(guān)；土壤含水率與Armatimonadota、藍(lán)細(xì)菌和綠彎菌門顯著正相關(guān)，與變形菌門顯著負(fù)相關(guān)。

圖5 土壤細(xì)菌優(yōu)勢門類與環(huán)境因子之間的相關(guān)關(guān)系Fig.5 Correlation between bacterial dominant phylum and environmental factors

3 討論

3.1 不同海拔下植煙土壤理化特性

土壤養(yǎng)分含量隨海拔、土壤類型等環(huán)境條件的變化而產(chǎn)生較大的差異[12]。研究[13-17]表明，隨著海拔的變化，土壤光、溫、水、熱等資源會產(chǎn)生很大的差異，造成土壤pH以及土壤基礎(chǔ)養(yǎng)分的變化。

烤煙對土壤酸堿度的適應(yīng)能力較強，在pH為4～9的土壤環(huán)境中均能生長，但土壤pH 5.5～6.5最適合優(yōu)質(zhì)煙葉的生產(chǎn)。本研究結(jié)果表明，低海拔土壤pH顯著低于中海拔，但高于高海拔，低海拔土壤pH最適宜烤煙生長，高海拔土壤pH較低，在施肥時應(yīng)適當(dāng)增施堿性肥料。鄧小華等[14]研究發(fā)現(xiàn)，海拔對湘西州植煙土壤pH有顯著影響，隨海拔升高pH有降低的趨勢。劉瓊峰等[17]的研究發(fā)現(xiàn)，張家界煙區(qū)植煙土壤pH在800m以下海拔差異不大，但800m以上的土壤pH顯著低于低海拔土壤。已有研究[18-19]表明，植煙土壤有機質(zhì)、堿解氮、速效磷、速效鉀等養(yǎng)分在高、中、低海拔間差異顯著。土壤有機質(zhì)和堿解氮決定了土壤供氮能力，植煙土壤有機質(zhì)含量以10～30g/kg為宜。本研究結(jié)果表明，高海拔土壤有機質(zhì)含量顯著高于低海拔，這與焦敬華等[18]研究結(jié)果一致。本研究中3個海拔高度有機質(zhì)含量均適宜優(yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)，但中海拔地區(qū)土壤堿解氮含量較低，適量增施氮肥更有利于烤煙生長。低海拔土壤速效磷含量顯著高于中海拔，這與朱三榮等[19]研究結(jié)果相反，這可能是由于取樣地區(qū)生態(tài)環(huán)境不同造成的。高海拔地區(qū)速效鉀含量低于植煙土壤適宜范圍（150～220mg/kg），在該地區(qū)增施鉀肥更適宜烤煙生長。

3.2 不同海拔下植煙土壤細(xì)菌群落組成及多樣性

土壤微生物群落組成及多樣性是反映土壤微生物群落生態(tài)功能的重要指標(biāo)，在本研究中，3個不同海拔的土壤細(xì)菌Simpson指數(shù)、Shannon指數(shù)和Chao指數(shù)均呈顯著性差異，其中中低海拔細(xì)菌Simpson指數(shù)低于高海拔，而Shannon指數(shù)和Chao指數(shù)則高于高海拔，說明中、低海拔更有利于土壤微生物生長，從而增加土壤生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性。研究[20]發(fā)現(xiàn)，Simpson指數(shù)與海拔呈顯著負(fù)相關(guān)，說明隨著海拔的降低土壤微生物的物種多樣性和豐富度增加，從而增加土壤生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性。高靜等[21]研究認(rèn)為，高寒草甸土壤固碳微生物豐度和多樣性隨海拔的上升顯著提高。土壤微生物是維持土壤生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定的重要組成部分，微生物的豐富度和數(shù)量的增大會明顯提高整個土壤生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性和多樣性?；贠TUs豐度的土壤菌落結(jié)構(gòu)主成分分析表明，土壤微生物群落結(jié)構(gòu)隨著海拔的變化出現(xiàn)明顯的分離，中、低海拔土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似，而其與高海拔的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)出現(xiàn)明顯的分離。

3.3 不同海拔下植煙土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與土壤因子的關(guān)系

溫度、水分、pH等理化性質(zhì)對土壤有機質(zhì)含量具有重要的影響，環(huán)境因子通過影響土壤微生物的活性和豐度來間接控制土壤有機碳的周轉(zhuǎn)速率[22]。Lynn等[23]研究認(rèn)為，土壤中參與碳固定的細(xì)菌類群多樣性與土壤類型、土壤環(huán)境因子等顯著相關(guān)。本研究表明，土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)受多種環(huán)境因子的驅(qū)動調(diào)節(jié)，土壤變形菌門、擬桿菌門、髕骨菌門、Armatimonadota、藍(lán)細(xì)菌和綠彎菌門與土壤速效鉀、pH、溫度、含水率和微生物量氮含量有明顯的相關(guān)性，變形菌和放線菌是土壤中豐度較高的菌群。變形菌含有尿素酶，可以分解尿素，固定土壤中的氮素，放線菌大多為腐生菌，參與土壤物質(zhì)循環(huán)和能量轉(zhuǎn)換。本試驗結(jié)果表明，低海拔地區(qū)土壤放線菌豐度較高，這更有利于土壤有機質(zhì)的分解利用。研究[24]表明，海拔可顯著影響土壤微生物群落，并且在不同海拔梯度下土壤pH和地上植被組成與土壤微生物群落存在極明顯的相關(guān)性。研究[25]發(fā)現(xiàn)，隨著海拔升高，OTU數(shù)和微生物種群組成都會發(fā)生明顯的變化。Zhang等[26]研究發(fā)現(xiàn)，植被通過改變土壤 pH和 C/N進(jìn)而對土壤微生物群落組成產(chǎn)生影響。張杰等[27]認(rèn)為，不同植被群落下的土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在顯著差異。該研究中，不同的海拔梯度下土壤細(xì)菌群落之間存在顯著差異。因此推測，不同海拔梯度下的植被類型通過改變pH和土壤有機碳間接影響細(xì)菌分布。土壤對烤煙的產(chǎn)量和質(zhì)量具有直接的影響，海拔的改變直接造成局部地區(qū)土壤發(fā)育和土壤理化性質(zhì)的變化，從而對煙草種植造成影響。通過適當(dāng)?shù)脑耘喙芾泶胧梢詼p輕海拔變化對煙草品質(zhì)造成的不利影響。馮慧琳等[11]研究發(fā)現(xiàn)，通過施加生物炭能夠顯著提高植煙土壤酶活性及土壤養(yǎng)分，改善土壤微生態(tài)環(huán)境，促進(jìn)根際土壤細(xì)菌群落的變化。另有研究[28]發(fā)現(xiàn)，生物炭對土壤微生物量碳和氮含量有顯著性提高，施加生物炭提高作物的礦化效率，提高烤煙的產(chǎn)量和質(zhì)量，增加烤煙的可利用性。本研究通過研究不同海拔下土壤pH和養(yǎng)分的差異，尋找土壤細(xì)菌群落和土壤因子的相關(guān)性，為烤煙的生長管理提供一定的參考。

4 結(jié)論

不同海拔下植煙土壤細(xì)菌群落表現(xiàn)出一定的差異性，低海拔地區(qū)土壤細(xì)菌群落豐度高于高海拔地區(qū)。影響細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵因子為土壤pH、溫度、含水率和土壤微生物量氮含量。不同海拔植煙地區(qū)土壤環(huán)境因子差異影響微生物多樣性以及群落結(jié)構(gòu)。