利用染色體片段置換系定位低溫影響水稻萌芽期根長和芽長QTL

余鎂霞 鄧浩東 譚景艾 宋貴廷 吳光亮 陳利平劉睿琦 鄒安東 賀浩華,2 邊建民,2

（1作物生理生態(tài)與遺傳育種教育部/江西省重點(diǎn)實驗室，330045，江西南昌；2江西省水稻高水平工程研究中心，330045，江西南昌）

水稻起源于熱帶和亞熱帶，對低溫敏感。隨著人口數(shù)量的增加，對水稻的需求量增加，導(dǎo)致水稻種植面積不斷向高緯度低溫地區(qū)擴(kuò)展[1]。低溫不僅影響水稻內(nèi)部代謝物的產(chǎn)生，如脯氨酸、蔗糖和活性氧等，還會影響根和芽的形態(tài)[2]。水稻主要依靠根和芽的通氣組織輸送氧氣[3]，根和芽發(fā)育不良會使植株整體缺氧，不利于產(chǎn)量形成。因此，在低溫條件下，研究水稻萌發(fā)期根和芽的遺傳機(jī)制對培育耐冷優(yōu)良品種和促進(jìn)水稻生產(chǎn)具有重要指導(dǎo)作用。

水稻耐冷性是一個復(fù)雜的數(shù)量性狀，可以通過較多指標(biāo)衡量[4-5]。迄今為止，已通過存活率、發(fā)芽率、發(fā)芽力、種子活力等指標(biāo)定位到多個與水稻耐冷相關(guān)的QTL，如qCTS12[6]、qLTG3-1[7]、COLD-1[8]、qLTB3[9]和qCTB7[10]等。但對衡量水稻耐冷性重要指標(biāo)的根長和芽長的研究相對較少。

在水稻根系眾多性狀中，根長是一個能反映水稻在逆境條件下生長發(fā)育健壯程度的重要指標(biāo)。Steele等[11]在灌溉和干旱脅迫處理下以近等基因系（near-isogenic line，NIL）為材料，在第9號染色體 RM242-RM201間定位到 1個根長 QTL。Shimizu等[12]在磷缺乏的條件下，以秈稻品種Kasalath和粳稻品種日本晴構(gòu)建的染色體片段置換系（chromosome fragment replacement line，CSSL）群體為材料，在第 6號染色體定位到影響根長的QTLqREP-6。Mitsuhiro等[13]通過更換以 NH4+為唯一氮源的營養(yǎng)液建立適合量取根長的生長條件，利用粳稻品種 Koshihikari和秈稻品種 Kasalath雜交衍生出的CSSL，在第6號染色體檢測出控制根長的QTLqRL6.1。Wang等[14]利用短根保持系協(xié)青早B和長根恢復(fù)系 R9308雜交獲得的重組自交系（recombinant inbred line，RIL）群體，在第7號染色體檢測到影響根長的QTLqRL7。徐曉明等[15]以超級稻協(xié)優(yōu) 9308衍生 RIL群體與輪回親本中恢9308回交多代的高代回交群體，在第4號染色體定位到影響根長的QTLqRL4。趙春芳等[16]在低磷條件下，以 9311為背景親本、日本晴為供體親本衍生的染色體片段置換系為材料，在第5號染色體定位到1個與根長相關(guān)的QTL。

與根長相比，芽長作為另一個反映水稻生長發(fā)育健壯程度的重要指標(biāo)，前人對其研究甚少。Redona等[17]利用粳稻Labelle和秈稻Black Gora衍生的RIL群體，在18℃和25℃溫度條件下，定位到4個影響芽長的QTL。Fukuda等[18]通過秈稻和粳稻雜交的近交系在低溫16℃條件下，檢測到改善芽生長的QTLqSL3和qSL8。Zhang等[19]利用粳稻Lemont和秈稻Teqing雜交衍生的RIL，在18℃條件下定位到4個影響芽長的主效QTL。此外，班超等[20]通過整理水旱條件下水稻根系性狀QTL，得到水稻第1、2、3、5和11號染色體共11個區(qū)域很可能存在“一因多效”位點(diǎn)。這表明水稻根和芽可能存在協(xié)調(diào)發(fā)育的可能。但是對水稻根長和芽長的遺傳表型及其二者關(guān)系，特別是低溫條件下的關(guān)系知之甚少。

基于此，本研究利用9311（受體）/日本晴（供體）衍生的CSSL群體，在正常溫度（25℃）和低溫（15℃）條件下，分析水稻萌芽期根長和芽長的遺傳表現(xiàn)，并定位其中影響水稻萌芽期根長和芽長QTL。同時分析QTL間的關(guān)系，為后續(xù)研究其遺傳機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

從受體親本秈稻 9311和供體親本粳稻日本晴雜交、回交的后代群體中選出121個性狀穩(wěn)定的株系，利用全基因組重測序技術(shù)進(jìn)行基因分型，獲得高質(zhì)量的Bin標(biāo)記；同時結(jié)合JoinMap 4.2軟件構(gòu)建CSSL群體的高密度圖譜。

1.2 試驗方法

從親本和每個株系所收獲的種子中選取 40粒飽滿健康的種子，經(jīng)3.5%次氯酸鈉消毒后，用蒸餾水漂洗干凈。隨后將種子置于底部放有一層濾紙的9cm無菌培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿中加入恰好浸沒種子的蒸餾水。并放置于28℃條件下催芽。待種子萌發(fā)后，選擇其中整齊一致的30粒種子，置于15℃、12/12h（晝/夜）恒溫培養(yǎng)箱處理 7d，然后在 25℃恢復(fù)生長7d，期間每天隨機(jī)選取10粒幼芽測量根長（cm）和芽長（cm），測量后放回培養(yǎng)皿。

1.3 統(tǒng)計分析

采用 IciMapping V4.2軟件完備區(qū)間作圖法（ICIM）對 CSSL群體進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和 QTL定位[21-22]。QTL按照q+目標(biāo)性狀+所在染色體號數(shù)或連鎖群代號原則命名，名稱用斜體[23-24]。用 SPSS 22.0與Excel 2017進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 遺傳圖譜構(gòu)建

利用多態(tài)性標(biāo)記對 CSSL群體基因型進(jìn)行劃分，與日本晴相同的基因型轉(zhuǎn)化為標(biāo)記2，與9311相同的基因型轉(zhuǎn)化為標(biāo)記0，無法判斷的基因型轉(zhuǎn)化為標(biāo)記-1。以100kb為一個bin窗口，滑動所有子代樣品的每條染色體，根據(jù)每個樣品基因型來源，以 bin為單位得到該群體每個子代 marker信息，最終獲得655個Bin標(biāo)記（表 1）。利用這些Bin標(biāo)記構(gòu)建染色體片段置換系圖譜，其中約97%的基因組被日本晴片段置換覆蓋（圖1）。

圖1 染色體片段置換系圖譜基因型圖示Fig.1 Graphical genotypes of the CSSLs

表1 染色體標(biāo)記數(shù)及bin間遺傳距離Table 1 The bin marker numbers and genetic distance between adjacent bins Mb

2.2 2個溫度下親本和CSSL群體表型分析

由表2得，15℃條件下，2個親本根長在第1天和第2天、芽長在第6天和第7天存在顯著差異，其余生長時期2個親本根長或芽長差異不顯著。25℃條件下，2個親本的根長在第1、2、3、4天、芽長在第3、4、5、6天存在顯著差異，其余生長時期差異不顯著。CSSL群體中，幼芽根長和芽長均表現(xiàn)出不同程度的差異，在2個溫度條件下均呈現(xiàn)連續(xù)變異，具有廣泛的變異幅度，均表現(xiàn)出明顯的超親分離現(xiàn)象（表2和圖2）。表明15℃和25℃條件下，水稻幼芽的根長和芽長表現(xiàn)出明顯的數(shù)量性狀特征，符合QTL定位要求。

圖2 15℃和25℃處理下CSSL群體表型分布Fig.2 Phenotypic distribution of CSSL population at 15℃ and 25℃

表2 親本及CSSL群體在2個溫度條件下根長和芽長表型分析Table 2 Phenotype analysis of root length and bud length under two temperatures of their parents and CSSL population

2.3 2個溫度條件下根長和芽長的QTL定位

2個溫度條件下共定位32個QTL。其中，18個QTL與根長相關(guān)，14個QTL與芽長相關(guān)。這些QTL分布在水稻的第1、2、3、6～12號染色體上，貢獻(xiàn)率為0.58%～38.26%。大部分QTL（75%）分布在水稻的第3、7～10號染色體（表3和圖3）上。有9個QTL增效等位基因來自日本晴，其余均來自9311。

圖3 CSSL群體定位的2個溫度處理后影響根長和芽長QTL染色體分布Fig.3 Distribution of QTL related root length and bud length on genetic map under two temperature treatments of CSSL population

表3 CSSL群體定位2個溫度條件下幼芽生長不同時期影響根長和芽長的QTLTable 3 QTL mapping for root length and bud length under two temperatures using CSSL population at different stages of sprout growth

2.3.1 15℃條件下 QTL定位 15℃條件下，共定位到 9個根長 QTL：qRL15T2.1、qRL15T7.1、qRL15T7.2、qRL15T7.3、qRL15T10.1、qRL15T10.2、qRL15T10.3、qRL15T10.4和qRL15T10.5，貢獻(xiàn)率為8.66%～24.36%。其中，qRL15T7.2和qRL15T10.3在不同時期被重復(fù)檢測到。除qRL15T2.1增效等位基因來自于日本晴外，其余均來自9311。

15℃條件下，定位到9個芽長QTL，分別位于第 1～3、6～10號染色體上，貢獻(xiàn)率為 1.73%～28.90%，其中qBL15T6、qBL15T7、qBL15T9和qBL15T10被重復(fù)檢測到。qBL15T3.1、qBL15T3.2、qBL15T7和qBL15T10促進(jìn)芽生長的等位基因來自9311，而qBL15T1、qBL15T2、qBL15T6、qBL15T8和qBL15T9促進(jìn)芽生長的等位基因來自日本晴。

2.3.2 25℃條件下 QTL定位 25℃條件下，在 6條染色體共檢測到9個影響根長的QTL，貢獻(xiàn)率為5.22%～12.82%。所有位點(diǎn)上促使根生長的等位基因均來自9311。qRL25T7、qRL25T9.3、qRL25T10和qRL25T12被重復(fù)檢測到。

25℃條件下，有5個影響芽長的QTL被檢測到。其中qBL25T11位于第 11號染色體上，qBL25T3.1、qBL25T3.2、qBL25T3.3和qBL25T3.4分布于第3號染色體。QTL貢獻(xiàn)率為0.58%～38.26%。只有qBL25T3.3在芽生長不同時期被重復(fù)檢測到。除qBL25T3.1促進(jìn)芽生長的等位基因來自9311，其余位點(diǎn)增效等位基因均來自日本晴。

2.4 多效性QTL分析

由表4可知，第2、7、9、10號染色體的4個Bin標(biāo)記區(qū)域存在同一溫度影響不同性狀或不同溫度影響不同性狀的位點(diǎn)。標(biāo)記bin113、bin393和bin507所在的位點(diǎn)在15℃條件下對根長和芽長生長均有影響，這3個位點(diǎn)的增效等位基因均來自9311。標(biāo)記bin448所在的位點(diǎn)對15℃芽長和25℃根長產(chǎn)生影響，其等位基因分別來源于日本晴和9311。

表4 對性狀有多效性的染色體標(biāo)記對應(yīng)區(qū)域Table 4 Chromosomal markers corresponding to regions with pleiotropic effects on traits

3 討論

3.1 芽期低溫脅迫后水稻恢復(fù)生長的遺傳機(jī)制

為探究芽期低溫脅迫后水稻恢復(fù)生長的遺傳機(jī)制，本研究利用 9311/日本晴衍生的CSSL群體在低溫（15℃）和正常溫度（25℃）下對根長和芽長進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示，不同親本在同一溫度下存在差異。CSSL群體根長和芽長在萌發(fā)期不同階段均表現(xiàn)出連續(xù)變異，表明低溫和正常溫度下水稻根長和芽長均表現(xiàn)為數(shù)量性狀遺傳。此外，在幼芽生長不同階段，只有少數(shù) QTL被重復(fù)檢測到，并且在不同時期其加性效應(yīng)值不同，表明水稻幼芽期不同階段基因是選擇性表達(dá)，其耐低溫性受多個QTL（基因）控制，這與陳利華等[25]研究結(jié)果類似。

2個溫度條件下，生長前期9311根長顯著長于日本晴，后期由于粳稻日本晴生長速度加快[26-27]，根長差異不顯著。生長前期2個親本間芽長無顯著差異，生長后期 15℃條件下日本晴芽長顯著長于9311，25℃條件下表現(xiàn)不明顯，這可能與粳稻耐冷性強(qiáng)有關(guān)。在同一生長時期，2個溫度條件下所定位的 QTL均不同，即低溫和正常溫度下，控制水稻芽期生長的基因（QTL）均存在差異，表明低溫處理后，幼芽恢復(fù)生長遺傳機(jī)制與常溫條件下正常生長可能存在差異。

3.2 定位的根長和芽長QTL比較

25℃條件下，檢測到9個影響根長的QTL，其等位基因均來自于9311，其中影響最大的QTL為qRL25T9.3（LOD值16.75，貢獻(xiàn)率44.89%）；檢測到5個影響芽長的QTL，其中影響最大的QTL為qBL25T3.3（LOD 值 51.60，貢獻(xiàn)率 43.86%），除qBL25T3.1外，其余QTL位點(diǎn)增效等位基因均來自于日本晴。結(jié)果表明，常溫條件下2個親本等位基因?qū)ΩL和芽長均產(chǎn)生主要影響。15℃條件下，檢測到9個影響根長的QTL，其中影響最大的QTL為qRL15T10.3（LOD值9.77，貢獻(xiàn)率31.63%），除qRL15T2.1外，其余QTL位點(diǎn)增效等位基因均來自于9311；檢測到9個影響芽長的QTL，qBL15T3.1、qBL15T3.2、qBL15T7和qBL15T10中增效等位基因來自于 9311，而qBL15T1、qBL15T2、qBL15T6、qBL15T8和qBL15T9中增效等位基因來自于日本晴，其中影響最大的 QTL為qBL15T10（LOD值61.39，貢獻(xiàn)率 64.37%），其增效等位基因來源于9311。結(jié)果表明，秈稻 9311中也存在耐低溫的基因。盡管較多的研究表明粳稻較秈稻耐冷，特別是幼苗期和抽穗揚(yáng)花期，但Fujino等[28]和Miura等[29]研究結(jié)果表明，秈稻芽期耐冷性強(qiáng)于粳稻，同時定位了多個秈稻芽期耐冷QTL，這與本研究結(jié)果較一致，表明秈稻和粳稻中可能均存在耐冷的基因。因此，可以聚合這些耐低溫的基因（QTL），并通過分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)將其轉(zhuǎn)入到其他秈稻品種中，使其根和芽能夠更好地在低溫環(huán)境下生長。

本研究共定位了到 32個影響幼芽生長的QTL。其中qRL15T2.1（19.75～20.75 Mb）與 Courtois等[30]定位到影響每蘗根重QTL（RG171-RG157）位置接近。qRL25T1（35.9～38.35 Mb）與Zheng等[31]定位控制根粗（RZ730-RZ801）的QTL位置相近。徐吉臣等[32]（C711-G103）研究中也曾提及，qRL25T9.1（6.5～7.25Mb）所在位點(diǎn)控制最大根長。qRL25T9.3（20.6～21.05Mb）所在位點(diǎn)分別影響水稻生長后期根中木質(zhì)部血管數(shù)目及移栽后生根[33-34]。在qBL25T3.2位置分別定位到控制苗長的OsMRP5和oni1[35-36]。此外，目前暫未發(fā)現(xiàn)與其他位點(diǎn)相同或接近的與根和芽相關(guān)性狀的QTL。這些QTL的定位為解析水稻芽期遭遇低溫冷害后恢復(fù)生長的遺傳機(jī)制提供了參考。通過聚合這些 QTL使水稻在芽期遭遇低溫后更快地恢復(fù)生長。

3.3 多效性QTL分析

本研究表明，2個溫度條件下，根和芽的生長相互影響。本試驗發(fā)現(xiàn)標(biāo)記區(qū)域bin113（qRL15T2.1和qBL15T2）、bin393（qRL15T7.3和qBL15T7）及bin507（qBL15T10和qRL15T10.4）同時在15℃條件下對根長和芽長恢復(fù)生長有影響，bin448（qBL15T9和qRL25T9.2）對15℃芽長和25℃根長有影響，為多效性QTL，影響根和芽的協(xié)同發(fā)育。因此將其視為根和芽協(xié)調(diào)發(fā)育中的多效QTL[37]。

4 結(jié)論

以9311（受體）/日本晴（供體）CSSL群體為材料，在15℃低溫處理后，共檢測到9個影響根長及9個影響芽長的QTL。以25℃為對照，共檢測到 9個影響根長及 5個影響芽長的 QTL。除qRL15T2.1、qRL25T1、qRL25T9.1、qRL25T9.3及qBL25T3.2外，其余均可能是新的影響根和芽生長的QTL。同時，在第2、7、9和10號染色體上4個Bin標(biāo)記區(qū)域檢測到影響根和芽協(xié)調(diào)發(fā)育的多效性QTL。此外，在15℃定位的根長或芽長QTL與在25℃定位的根長或芽長QTL均不相同，表明低溫條件下控制水稻幼芽期根和芽生長的遺傳機(jī)制可能與常溫下不同。