30 份紅三葉種質(zhì)資源耐銅性綜合評(píng)價(jià)

張鶴山 ，高秋 ，張婷婷 ，陸姣云 ，田宏 ，熊軍波 ，劉洋 *

（1. 湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，湖北武漢430064；2. 全國(guó)畜牧總站牧草種質(zhì)資源保存中心，北京100125）

隨著城鎮(zhèn)工業(yè)化的發(fā)展，重金屬污染帶來的環(huán)境問題日益突出［1-2］。銅作為植物生長(zhǎng)必需的微量營(yíng)養(yǎng)元素，參與植物各種基本代謝活動(dòng)［3］，然而，過量的銅會(huì)對(duì)植物產(chǎn)生毒害作用［4］。通常，當(dāng)植物組織銅含量≥20 mg·kg-1干物質(zhì)（dry matter，DM）會(huì)產(chǎn)生毒害作用，將導(dǎo)致植物形態(tài)、解剖、生理等方面的改變，從而降低植物的產(chǎn)量和質(zhì)量［5-6］。近幾十年，由于采礦、冶煉、廢物處理、農(nóng)藥、殺菌劑和大氣沉降等原因，銅被廣泛釋放到環(huán)境中［7-10］。許多地區(qū)的土壤受到了銅的輕度或中度污染［11］，如湖北已廢棄3000 多年的銅綠山古冶煉渣礦的總銅含量達(dá)7789 mg·kg-1［12］，浙江哩鋪銅礦區(qū)土壤中銅含量超過 700 mg·kg-1［13］。在一些果園，銅在土壤中積累得越來越多，山東省某蘋果園的土壤銅濃度在2008-2014 年以每年1.37～1.45 mg·kg-1的速率遞增［14-16］，巴西南部（里約熱內(nèi)盧）的一處葡萄園，土壤銅的最大濃度值高達(dá)3200 mg·kg-1。這些銅污染的土壤不僅造成農(nóng)業(yè)糧食減產(chǎn)，而且會(huì)威脅人類的身體健康［17-18］。

國(guó)內(nèi)外開展了許多環(huán)境中的銅修復(fù)研究［19］。目前，物理修復(fù)、化學(xué)修復(fù)和生物修復(fù)策略已被人們普遍采用，然而，高昂的成本和低下的效率限制了物理和化學(xué)修復(fù)措施的應(yīng)用［20］，而植物修復(fù)技術(shù)因利用植物及其根際微生物對(duì)土壤污染物的吸收、提取、分解、轉(zhuǎn)化和固定的特點(diǎn)，被學(xué)術(shù)界稱為“綠色修復(fù)”，近年來備受關(guān)注。一些耐銅性或能夠富集Cu2+的植物如海洲香薷（Elsholtzia harchowensis）［21］和蕨類植物［22］能夠在高土壤銅含量環(huán)境中正常生長(zhǎng)，已經(jīng)在土壤銅污染修復(fù)中得到廣泛應(yīng)用。許多學(xué)者也開展了牧草類物種如巨菌草（Pennisetumsp.）［23］、葦狀 羊 茅（Festuca arundinacea）［24］、蘇 丹 草（Sorghum sudanense）［25］、雜 交 狼 尾 草（Pennisetum americanum×P.purpureum）［26］、紫花苜蓿（Medicago sativa）［27-28］、紫云英（Astragalus sinicus）［29］等草種的耐銅性研究，并被用于土壤重金屬污染的修復(fù)。

我國(guó)湖北、江西、湖南等地區(qū)有大量的銅尾礦，修復(fù)這些銅污染土壤成為生態(tài)保護(hù)建設(shè)的重要內(nèi)容。紅三葉（Trifolium pratense）是豆科車軸草屬多年生草本植物，廣泛栽培于長(zhǎng)江流域及西南地區(qū)，是家畜重要的蛋白來源，也具有生長(zhǎng)快、根系發(fā)達(dá)、地上部生物量高等潛在的植物修復(fù)能力。研究發(fā)現(xiàn)，紅三葉可以在Cu2+含量為1200 mg·kg-1的土壤中正常生長(zhǎng)，表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐銅脅迫能力［30］，具有在銅礦區(qū)生產(chǎn)應(yīng)用的潛力。鑒于此，本研究以來自國(guó)內(nèi)外的不同紅三葉種質(zhì)為材料，在萌發(fā)期和苗期研究其生長(zhǎng)發(fā)育特性并開展耐銅性綜合評(píng)價(jià)，以期篩選出能夠在銅尾礦或銅污染土壤正常生長(zhǎng)的優(yōu)良種質(zhì)材料，為耐銅性紅三葉新品種選育及開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

30 份紅三葉種質(zhì)材料由全國(guó)畜牧總站牧草種質(zhì)資源保存中心提供。材料信息見表1。

表1 供試材料信息Table 1 Information of red clover germplasm resources

1.2 試驗(yàn)方法

萌發(fā)期脅迫試驗(yàn)在人工氣候培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行，試驗(yàn)期12 d（2021 年1 月2 日-14 日），培養(yǎng)箱溫度為（25±1）℃，光照設(shè)置 16 h 黑暗/8 h 光照交替進(jìn)行。試驗(yàn)處理設(shè)置 4 個(gè) Cu2+脅迫濃度：0.5、2.0、4.0 和 8.0 mmol·L-1，以去離子水處理為對(duì)照，每個(gè)處理4 次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)100 粒種子。采用濾紙發(fā)芽法，每個(gè)發(fā)芽盒放置2 層濾紙，加入25 mL 相應(yīng)濃度處理溶液，均勻擺放紅三葉種子，于人工氣候箱進(jìn)行培養(yǎng)。試驗(yàn)過程中不再加入處理液。

苗期脅迫試驗(yàn)在人工氣候室內(nèi)進(jìn)行，試驗(yàn)期 60 d（2021 年 1 月 5 日-3 月 6 日），氣候室溫度為（24±2）℃，濕度50%～60%。試驗(yàn)處理設(shè)置3 個(gè)Cu2+脅迫濃度：5、20 和50 mmol·L-1，對(duì)照為去離子水，每個(gè)處理4 次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)8 株苗。采用盆栽法，花盆上部?jī)?nèi)徑15 cm，底部?jī)?nèi)徑13 cm，高15 cm，底部有孔；每個(gè)花盆裝等量“品氏”泥炭土（PINDSTRUP SPHAGNUM），使土壤表面低于花盆約2 cm；每盆播種12～15 粒，出苗后定苗8 株，期間正常澆水；待幼苗正常生長(zhǎng)至3 片真葉出現(xiàn)，停止?jié)菜? d 后進(jìn)行脅迫處理。方法是將所有試驗(yàn)花盆放入多個(gè)方形塑料試驗(yàn)箱內(nèi)（60 cm×60 cm×15 cm），保證同一Cu2+脅迫濃度處理的種質(zhì)材料放置在相同的試驗(yàn)箱內(nèi)；將配制完成的某一濃度Cu2+處理液澆灌至對(duì)應(yīng)的處理組花盆內(nèi)，一次性澆透，然后向試驗(yàn)箱內(nèi)加入相應(yīng)濃度處理液至約5 cm 高，確保每個(gè)試驗(yàn)箱加入的Cu2+處理液量相等；對(duì)照組按相同方法加入等量去離子水。為防止溶液蒸發(fā)，用塑料膜將試驗(yàn)箱與花盆之間的空隙封閉，試驗(yàn)期間不再添加處理液或去離子水，利用泥炭土的吸水特性可以保證土壤中的Cu2+濃度維持不變。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

在種子萌發(fā)第10 天統(tǒng)計(jì)發(fā)芽數(shù)及測(cè)定胚根特征指標(biāo)。發(fā)芽率（germination ratio，GR）：統(tǒng)計(jì)每個(gè)發(fā)芽盒內(nèi)的發(fā)芽種子數(shù)，以發(fā)芽種子數(shù)占總種子數(shù)的百分比表示發(fā)芽率；胚根長(zhǎng)度（radicle length，RL）和胚根直徑（radicle diameter，RD）：利用掃描儀（Expression 10000XL，日本）掃描根系后，用根系分析系統(tǒng)（WinRHIZO software 5.0，Regent instruments，加拿大）進(jìn)行分析，每個(gè)重復(fù)測(cè)定10 株，取平均值。

苗期脅迫各性狀指標(biāo)在脅迫14 d 后進(jìn)行。存活率（survival ratio，SR）：統(tǒng)計(jì)每個(gè)花盆紅三葉存活株數(shù)，以植株未枯死并有正常綠色生長(zhǎng)芽為存活株，以脅迫后存活株數(shù)占處理前定苗株數(shù)的百分比表示存活率；地上生物量（aboveground biomass，AB）：收獲每株幼苗地上部分莖葉（已死亡植株收集其干枯莖葉），置于烘箱105 ℃殺青1 h，然后75 ℃烘干至恒重后稱重；地下生物量（underground biomass，UB）：收獲每株幼苗地下部分根系，洗凈后擦干水，置于烘箱105 ℃殺青1 h，然后75 ℃烘至恒重后稱重；根冠比（root to stem ratio，RSR）以地下生物量與地上生物量的比值表示；利用根系分析系統(tǒng)測(cè)定根總長(zhǎng)度（total root length，TRL）、根尖數(shù)（number of root tip，NRT）和根體積（root volume，RV），每個(gè)重復(fù)測(cè)定6 株。

1.4 耐銅性綜合評(píng)價(jià)

采用隸屬函數(shù)法［31-32］進(jìn)行紅三葉耐銅性綜合評(píng)價(jià)；參照張鶴山等［33］的方法計(jì)算各指標(biāo)權(quán)重系數(shù)。

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)值確立 假定一個(gè)耐銅性理想品種的參考數(shù)列，記為｛X0(k)｝（k=1，2，3，…，n），n為用于評(píng)價(jià)的性狀指標(biāo)數(shù)。被評(píng)價(jià)種質(zhì)的比較數(shù)列記為｛Xi（k）｝（i=1，2，3，…，m），m為紅三葉種質(zhì)數(shù)。關(guān)聯(lián)系數(shù)計(jì)算公式為：

式中：Ai(k)為第i個(gè)材料第k個(gè)指標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)值；|X0(k)-Xi(k)|表示X0(k)數(shù)列與Xi(k)數(shù)列在k點(diǎn)的絕對(duì)差值；minimink|X0(k)-Xi(k)|為二級(jí)最小差值；maximaxk|X0(k)-Xi(k)|為二級(jí)最大差值；ρ為分辨系數(shù)，本研究取值0.5。

1.4.2 各指標(biāo)權(quán)重系數(shù)

式中：ωk表示第k個(gè)指標(biāo)的權(quán)重系數(shù)；Pk為第k個(gè)指標(biāo)的變異系數(shù)。

1.4.3 各種質(zhì)關(guān)聯(lián)系數(shù)

式中：ri為第i個(gè)種質(zhì)材料的關(guān)聯(lián)系數(shù)，其值越大表示該種質(zhì)越接近理想品種，其耐銅性越強(qiáng)。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

以相對(duì)值為基礎(chǔ)分析數(shù)據(jù)，即脅迫處理下的測(cè)定值與對(duì)照處理下的測(cè)定值的比值。采用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用Duncan 法多重比較，采用分層聚類法聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 萌發(fā)期Cu2+脅迫下各性狀特征及差異分析

Cu2+脅迫對(duì)紅三葉種質(zhì)發(fā)芽率、胚根長(zhǎng)度和胚根直徑具有顯著影響（表2）。隨著Cu2+濃度的增加，發(fā)芽率逐漸下降，Cu2+脅迫濃度在0.5～4.0 mmol·L-1時(shí)，紅三葉發(fā)芽率為對(duì)照的94%，但濃度增至8.0 mmol·L-1時(shí)，發(fā)芽率下降至對(duì)照的78%。胚根長(zhǎng)度和胚根直徑受Cu2+脅迫影響較為明顯，在8.0 mmol·L-1的Cu2+脅迫下，紅三葉胚根無法正常生長(zhǎng)。在0.5 mmol·L-1時(shí)，胚根長(zhǎng)度為對(duì)照的54%，在4.0 mmol·L-1時(shí)僅為對(duì)照的13%；胚根直徑在Cu2+脅迫下增大，即使Cu2+濃度在0.5 mmol·L-1時(shí)胚根直徑也為對(duì)照的110%，在Cu2+濃度為2.0 mmol·L-1時(shí)更是達(dá)到156%。

表2 紅三葉萌發(fā)期發(fā)芽率及根系特征Table 2 Germination rate and root characteristics of red clover in the germination stage

不同種質(zhì)間性狀差異最大的為4.0 mmol·L-1處理下的胚根長(zhǎng)度，其最大值（0.47）為最小值（0.06）的7.83倍，差異最小的為2.0 mmol·L-1處理下的發(fā)芽率（1.28 倍）。相同性狀在不同處理下其指標(biāo)值亦有差異，發(fā)芽率在8.0 mmol·L-1濃度脅迫下比其他3 個(gè)處理有更大的變異幅度，其最大值為最小值的1.52 倍，而在0.5、2.0 和4.0 mmol·L-1處理下分別為 1.30、1.28 和1.35 倍；胚根長(zhǎng)度變化幅度隨濃度的增加而增大，在 0.5、2.0 和4.0 mmol·L-1處理下其最大值分別為最小值的1.73、3.30 和7.83 倍；而胚根直徑在2.0 mmol·L-1處理時(shí)其指標(biāo)最大值為最小值的1.86 倍。變異系數(shù)結(jié)果表明，4.0 mmol·L-1處理下的胚根長(zhǎng)度變異程度最大（70.14%），其次為2.0 mmol·L-1處理下胚根長(zhǎng)度（30.78%），而2.0 mmol·L-1處理下發(fā)芽率變異程度最?。?.45%），這與各性狀特征差異統(tǒng)計(jì)結(jié)果一致。經(jīng)方差分析，紅三葉種質(zhì)在發(fā)芽率和胚根長(zhǎng)度的所有處理梯度均具有顯著差異性（P＜0.05），其中發(fā)芽率在 0.5、2.0 和 4.0 mmol·L-1處理下、胚根長(zhǎng)度在 2.0 和 4.0 mmol·L-1處理下種質(zhì)間在 0.001水平差異顯著（P＜0.001）；胚根直徑僅在0.5 mmol·L-1的Cu2+脅迫下種質(zhì)間存在顯著差異（P＜0.05）。

2.2 苗期Cu2+脅迫下各性狀特征及差異分析

相比于萌發(fā)期，紅三葉幼苗具有更高的Cu2+耐受性（表3）。在5 mmol·L-1脅迫時(shí)，紅三葉所有種質(zhì)均可存活并正常生長(zhǎng)，在20 mmol·L-1時(shí)平均存活率達(dá)到87%；但是Cu2+脅迫濃度達(dá)到50 mmol·L-1時(shí)，種質(zhì)平均存活率快速下降，僅為3%。Cu2+脅迫顯著抑制了紅三葉莖葉和根系的生長(zhǎng)，Cu2+脅迫處理下的紅三葉地上生物量和地下生物量均低于對(duì)照，在脅迫濃度為5 mmol·L-1時(shí)分別為對(duì)照的69%和57%，在50 mmol·L-1時(shí)則僅為對(duì)照的31%和10%。從根冠比看，所有處理的根冠比相對(duì)值均小于1，說明Cu2+脅迫對(duì)根系生長(zhǎng)的抑制強(qiáng)于地上莖葉部分。表征根系特征的指標(biāo)如根總長(zhǎng)度、根尖數(shù)和根體積在不同Cu2+脅迫濃度下具有一致的變化趨勢(shì)，均隨脅迫濃度的增加而減小，在5 mmol·L-1時(shí)，根總長(zhǎng)度、根尖數(shù)和根體積分別為對(duì)照的76%、60%和68%，在50 mmol·L-1時(shí)分別降低到對(duì)照的19%、11%和28%，這與地下生物量性狀變化趨勢(shì)相一致。變異分析表明，紅三葉苗期變異系數(shù)最大的性狀是50 mmol·L-1Cu2+脅迫下的存活率，為175.71%，其次為50 mmol·L-1Cu2+脅迫下根冠比，變異系數(shù)為109.40%。在不同Cu2+濃度處理下，各性狀變異系數(shù)均隨脅迫濃度的增加而增大，說明Cu2+脅迫濃度的增加進(jìn)一步突顯了種質(zhì)間的差異。進(jìn)一步方差分析表明，不同處理濃度下，各性狀在紅三葉種質(zhì)間的差異性有所不同。在5 mmol·L-1處理下，不同紅三葉種質(zhì)材料間只有根尖數(shù)存在顯著差異（P＜0.01）；而在20 mmol·L-1處理時(shí)，所有性狀均存在顯著差異（P＜0.05）。在50 mmol·L-1處理下，除存活率性狀外，種質(zhì)間其他性狀均差異顯著?？梢姡啾扔诘虲u2+脅迫濃度（5 mmol·L-1），20 或50 mmol·L-1的Cu2+脅迫濃度可以更好地區(qū)分紅三葉不同種質(zhì)間耐銅性的差異。

表3 苗期各指標(biāo)特征差異性Table 3 The difference between characteristics of red clover in the seedling stage

2.3 苗期各性狀差異性分析

為進(jìn)一步理解Cu2+脅迫濃度和種質(zhì)雙重因素對(duì)紅三葉各性狀的影響，對(duì)10 個(gè)性狀進(jìn)行了雙因素方差分析（表4）。分析表明，所有性狀在不同Cu2+脅迫濃度間和不同種質(zhì)間均達(dá)到差異顯著水平（P＜0.05），其中，除根冠比和存活率外，其余性狀更是在P＜0.001 水平上呈顯著差異，說明這些性狀可以作為紅三葉種質(zhì)耐銅性篩選評(píng)價(jià)的有效指標(biāo)。綜上分析，0.5 mmol·L-1Cu2+處理下的3 個(gè)萌發(fā)性狀（發(fā)芽率、胚根長(zhǎng)度和胚根直徑）和20 mmol·L-1Cu2+處理下的7 個(gè)苗期性狀（存活率、地上生物量、地下生物量、根冠比、根總長(zhǎng)度、根尖數(shù)、根體積）在不同紅三葉種質(zhì)間均具有顯著的差異性，因此，本研究將這些指標(biāo)用于后續(xù)的灰色關(guān)聯(lián)分析、相關(guān)性分析和回歸分析。

表4 10 個(gè)耐銅性指標(biāo)方差分析Table 4 Analysis of variance of 10 copper resistance indexes

2.4 不同性狀相關(guān)性分析

對(duì)所有材料的不同耐銅性指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析（表5），胚根長(zhǎng)度與胚根直徑具有顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系（P＜0.01），胚根長(zhǎng)度越小、直徑越大；地下生物量與地上生物量、根冠比、根尖數(shù)間具有顯著相關(guān)關(guān)系，且與根冠比、根尖數(shù)在0.001 水平顯著相關(guān)；此外，根尖數(shù)與胚根長(zhǎng)度、根總長(zhǎng)度亦呈現(xiàn)顯著的相關(guān)性，其中與根總長(zhǎng)度在0.001 水平上顯著相關(guān)。其余性狀間未表現(xiàn)出顯著相關(guān)性。

表5 10 個(gè)耐銅性狀相關(guān)性分析Table 5 Analysis of correlation of 10 copper resistance indexes

2.5 紅三葉耐銅性綜合評(píng)價(jià)

利用上述選取的10 個(gè)性狀指標(biāo)進(jìn)行隸屬函數(shù)分析，首先利用公式（1）確定各材料每個(gè)性狀的標(biāo)準(zhǔn)值，然后利用公式（2）確定發(fā)芽率、胚根長(zhǎng)度、胚根直徑、存活率、地上生物量、地下生物量、根冠比、根總長(zhǎng)度、根尖數(shù)和根體積的權(quán)重系數(shù)，分別為0.029、0.060、0.064、0.040、0.109、0.152、0.158、0.107、0.154 和 0.127，再通過公式（3）計(jì)算紅三葉不同種質(zhì)與理想品種關(guān)聯(lián)系數(shù)（綜合評(píng)價(jià)值）（表6）。種質(zhì)CF022167 與理想材料的關(guān)聯(lián)度最高，綜合評(píng)價(jià)值為0.698，表示其對(duì)Cu2+脅迫的耐受性最強(qiáng)；其次為種質(zhì)CF022178 和CF022232，綜合評(píng)價(jià)值分別為0.643 和0.636；關(guān)聯(lián)度最低的是種質(zhì)CF022234，綜合評(píng)價(jià)值僅為0.390。

表6 紅三葉耐銅性綜合評(píng)價(jià)值及預(yù)測(cè)值Table 6 Comprehensive evaluation and prediction value based on 4 important traits of copper tolerance in red clover

為篩選紅三葉耐銅性評(píng)價(jià)的關(guān)鍵指標(biāo)，依據(jù)最小二乘法，通過回歸分析選擇對(duì)紅三葉耐銅性評(píng)價(jià)具有顯著性的因子，得到最優(yōu)回歸模型。以上述耐銅性綜合評(píng)價(jià)關(guān)聯(lián)系數(shù)為因變量，以各指標(biāo)相對(duì)值為自變量，采用多元逐步回歸分析建立最優(yōu)回歸方程，得出各種質(zhì)耐銅性預(yù)測(cè)值（D值）與指標(biāo)的關(guān)系：D=0.1573X1+0.147X2+0.158X3+0.108X4，R2=0.977（P＜0.01），式中：X1為胚根長(zhǎng)度；X2為幼苗存活率；X3為地下生物量；X4為根總長(zhǎng)度。分析發(fā)現(xiàn)，利用該回歸模型預(yù)測(cè)的紅三葉耐銅性強(qiáng)弱與綜合評(píng)價(jià)結(jié)果基本一致（表6），其預(yù)測(cè)值排序位次和綜合評(píng)價(jià)值相同的有16 個(gè)種質(zhì)，占種質(zhì)材料總數(shù)量的1/2 以上，12 個(gè)種質(zhì)僅向前或后波動(dòng)一個(gè)位次，位次波動(dòng)最大的是種質(zhì)CF022230 和CF022172，其預(yù)測(cè)值比綜合評(píng)價(jià)值上升兩個(gè)位次?？梢?，以4 個(gè)關(guān)鍵指標(biāo)建立的預(yù)測(cè)模型可以有效地對(duì)紅三葉種質(zhì)耐銅性強(qiáng)弱進(jìn)行初步評(píng)價(jià)。

3 討論

重金屬對(duì)植物種子萌發(fā)和生長(zhǎng)發(fā)育的影響一直是研究者關(guān)注的焦點(diǎn)［34］。許多研究表明，過量的Cu2+能夠氧化損傷植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)［35-36］，降低種子萌發(fā)率，抑制植物根系生長(zhǎng)［37-38］，這已在牧草植物如紅三葉［39］、紫花苜蓿［40］、多花黑麥草（Lolium multiflorum）［41］、蘇丹草［25］以及作物類如水稻（Oryza sativa）［42］、小麥（Triticum aestivum）［43］、番茄（Solanum lycopersicum）［44］等物種內(nèi)得到證實(shí)。魚小軍等［39］對(duì)銅脅迫下的紅三葉發(fā)芽率的研究表明Cu2+濃度為 200 mg·L-1（3.12 mmol·L-1）時(shí)相對(duì)發(fā)芽率為 82%，趙思怡等［45］發(fā)現(xiàn) Cu2+濃度為 100 mg·L-1時(shí) 51 份紅三葉種質(zhì)的平均相對(duì)發(fā)芽率為62%，本研究中30 份紅三葉平均相對(duì)發(fā)芽率在4.0 mmol·L-1時(shí)仍達(dá)到94%，可能是由種質(zhì)數(shù)量及種質(zhì)材料的差異引起的。胚根長(zhǎng)度隨著Cu2+脅迫濃度的增加而降低，在8.0 mmol·L-1時(shí)胚根生長(zhǎng)停滯，可能是由于植物中的銅離子毒性導(dǎo)致細(xì)胞伸長(zhǎng)受到抑制［46-47］。相對(duì)于發(fā)芽率，紅三葉胚根對(duì)Cu2+脅迫更為敏感，王波等［48］在南荻（Triarrhena lutarioriparia）種子萌發(fā)中也發(fā)現(xiàn)了類似的現(xiàn)象，這可能是由于種子萌發(fā)時(shí)根尖最先突破種皮吸水，從而使根尖受脅迫時(shí)間較長(zhǎng)，積累更多的重金屬［49］。因此，眾多研究者通常將根系變化作為非生物脅迫評(píng)價(jià)的主要依據(jù)。

重金屬主要積累在草本植物的根部，以降低其對(duì)植物地上部分的損傷程度［50-52］。韓曉姝等［30］發(fā)現(xiàn)紅三葉根部對(duì)銅的積累高于莖葉部分，根系受危害程度更明顯，銅脅迫更多的是降低紅三葉的地下生物量，而對(duì)株高和地上生物量并沒有顯著影響。本研究結(jié)果與其不盡相同，本研究中所有銅脅迫處理不僅顯著降低了紅三葉的地下生物量、根總長(zhǎng)度、根體積和根尖數(shù)，也抑制了紅三葉地上部分的生長(zhǎng)，而且在高濃度（50 mmol·L-1）銅脅迫下，植株幾乎全部死亡。造成兩者結(jié)果不同的原因可能是前者是在紅三葉植株成株后（生長(zhǎng)季結(jié)束后）測(cè)定的數(shù)據(jù)，由于植物本身對(duì)脅迫有防御和修復(fù)能力［53-54］，使得不同脅迫強(qiáng)度間的差異弱化；而本研究指標(biāo)測(cè)定是在幼苗期（脅迫后第14 天），其對(duì)外界脅迫的反應(yīng)較為敏感，更能反映紅三葉種質(zhì)間的性狀差異。

種子萌發(fā)期對(duì)外界脅迫較為敏感，而苗期能更好地模擬植物自然生長(zhǎng)條件，因此許多學(xué)者分別在種子萌發(fā)期［6，39，44，55］和幼苗生長(zhǎng)階段［30，56-57］研究銅脅迫對(duì)植物的影響。然而，植物抗逆性評(píng)價(jià)是一個(gè)綜合的多指標(biāo)分析過程，更全面的指標(biāo)可以使評(píng)價(jià)結(jié)果更客觀［32，58-59］。本研究采用隸屬函數(shù)法，以紅三葉萌發(fā)期和苗期的生長(zhǎng)性狀指標(biāo)進(jìn)行耐銅性綜合評(píng)價(jià)，所有參與評(píng)價(jià)的性狀在紅三葉不同種質(zhì)間均具有顯著差異性，能夠有效區(qū)分種質(zhì)材料間耐銅性的強(qiáng)弱。對(duì)各指標(biāo)的權(quán)重系數(shù)分析表明，苗期指標(biāo)具有更大的權(quán)重，其中地下生物量權(quán)重最大，幼苗期的根部特征指標(biāo)權(quán)重占比約70%，說明幼苗根系特征是紅三葉耐銅性評(píng)價(jià)的主要指示性狀。綜合評(píng)價(jià)分析表明，種質(zhì)CF022167、CF022178 和CF022232 具有較強(qiáng)的耐銅能力，這與趙思怡等［45］研究結(jié)果有所差異，雖然其也發(fā)現(xiàn)種質(zhì)CF022167 具有較強(qiáng)的耐銅性，但卻將種質(zhì)CF022232 耐銅性評(píng)價(jià)為弱，一方面可能是本研究評(píng)價(jià)指標(biāo)除了萌發(fā)期的3 個(gè)指標(biāo)之外，還選擇了幼苗期的7 個(gè)指標(biāo)，而后者只采用萌發(fā)期的性狀；另一方面，兩者選的試驗(yàn)樣本種類和數(shù)量不盡相同，抗性評(píng)價(jià)本就是一個(gè)相對(duì)的綜合比較，因此試驗(yàn)材料的差異也會(huì)造成結(jié)果的不同。

紅三葉各性狀間具有不同程度的相關(guān)性［60］，選擇更多的指標(biāo)參與評(píng)價(jià)使得結(jié)果更準(zhǔn)確，但也會(huì)增加研究難度，造成資源浪費(fèi)。因此，篩選在抗逆性評(píng)價(jià)中起關(guān)鍵作用的指示性指標(biāo)成為一種有效手段［61］。本研究從10 個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)中篩選出胚根長(zhǎng)度、幼苗存活率、地下生物量和根總長(zhǎng)度4 個(gè)關(guān)鍵性指標(biāo)，建立其耐銅性預(yù)測(cè)值與綜合評(píng)價(jià)值回歸方程，依次對(duì)紅三葉種質(zhì)耐銅性進(jìn)行初步篩選。王瑞等［61］利用篩選出的5 個(gè)耐鹽關(guān)鍵指標(biāo)對(duì)42 份偃麥草（Elytrigia repens）進(jìn)行了評(píng)價(jià)，其預(yù)測(cè)值與綜合評(píng)價(jià)值相關(guān)系數(shù)為0.979，本研究中相關(guān)系數(shù)為0.977，達(dá)顯著相關(guān)水平（P＜0.01）。由此可見，以這4 個(gè)關(guān)鍵指標(biāo)構(gòu)建的回歸模型可以有效地對(duì)紅三葉耐銅性進(jìn)行初步評(píng)價(jià)。

4 結(jié)論

無論在萌發(fā)期還是幼苗生長(zhǎng)階段，Cu2+脅迫對(duì)紅三葉生長(zhǎng)發(fā)育均有顯著的抑制作用，胚根長(zhǎng)度隨Cu2+濃度的增加而減小，但胚根直徑變大；相對(duì)于發(fā)芽率，胚根生長(zhǎng)對(duì)Cu2+脅迫更為敏感。在銅脅迫下，紅三葉幼苗地上生物量和地下生物量顯著降低，根尖數(shù)和根總長(zhǎng)度減少。紅三葉萌發(fā)期和苗期各性狀在不同Cu2+濃度間具有顯著差異性，并且同一性狀在不同紅三葉種質(zhì)間也具有顯著差異性。

根系相關(guān)性狀如生物量、根尖數(shù)、根總長(zhǎng)度是紅三葉耐銅性評(píng)價(jià)的重要權(quán)重指標(biāo)，胚根長(zhǎng)度、幼苗存活率、地下生物量和根總長(zhǎng)度4 個(gè)指標(biāo)可以作為紅三葉耐銅強(qiáng)弱預(yù)測(cè)的關(guān)鍵指標(biāo)。紅三葉種質(zhì)CF022167、CF022178 及CF022232 具有較高的銅耐受性，可以作為紅三葉育種基礎(chǔ)材料或在生產(chǎn)中直接利用。