施鈣對酸性紅壤花生根系內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響

張 瑋 洪艷云 劉登望 張博文 易圖永,* 李 林,* 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院 / 植物病蟲害生物學(xué)與防控湖南省重點(diǎn)實驗室, 湖南長沙 408; 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)旱地作物研究所,湖南長沙 408

花生(Arachis hypogaeaL.)是一種重要的油料作物, 在我國境內(nèi)廣泛種植[1]。然而我國花生主產(chǎn)區(qū)受海洋大氣環(huán)流影響, 降雨量高, 鈣素極易流失, 從而導(dǎo)致土壤酸化缺鈣[2]?；ㄉ鞘肉}作物, 缺鈣會影響果實發(fā)育, 形成空殼, 造成減產(chǎn)甚至絕收[3], 嚴(yán)重影響經(jīng)濟(jì)效益[4-6]。同時缺鈣容易誘發(fā)籽仁生理病變使之更易感染真菌病害。在植物與病原菌互作過程中, 鈣參與植物的防御反應(yīng)和組織結(jié)構(gòu)的形成, 增強(qiáng)植物細(xì)胞穩(wěn)定性和抗病能力[7]。鈣能直接抑制病原菌菌絲生長、孢子萌發(fā)、附著胞形成等,甚至能參與病原真菌的致病性調(diào)控[8-11]。

近期研究表明, 微生物菌群可以影響植物和病原物之間的相互作用, 有益微生物能夠促進(jìn)植物的生長, 同時增加植物對非生物脅迫的耐受性[12]。許多根際促生菌能夠增強(qiáng)宿主抵抗病原物的能力, 通過誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性(induced systemic resistance, ISR)使地上部分能抵抗病原微生物的侵襲和害蟲的取食[13-14]。同時植物根系分泌物也能通過改變土壤理化性質(zhì)吸引附近土壤環(huán)境微生物向根部聚集, 進(jìn)而影響根際微生物的群落結(jié)構(gòu)[15]。Yuan 等[16]證實, 擬南芥在受到葉部病原菌丁香假單胞菌番茄致病變種(Pseudomonas syringaepv.tomato,Pst)侵染后, 可通過增加氨基酸和長鏈有機(jī)酸分泌量等途徑改變根系分泌物成分, 從而調(diào)控土壤微生物群落來加強(qiáng)自身抵御病害的能力。Molina 等[17]通過將惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)、鞘氨醇單胞菌(Sphingomonassp.)、巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)以及不動桿菌(Acinetobactersp.)的混合菌群接種至玉米根部,從而提高了玉米的抗旱性。Berendsen 等[14]用活體營養(yǎng)型卵菌擬南芥無色霜霉菌(Hyaloperonospora arabidopsidis)侵染擬南芥葉片后, 通過促進(jìn)根際3種特異誘導(dǎo)ISR 的細(xì)菌增殖, 起到抗霜霉病的作用。這些研究進(jìn)一步證實了接種微生物混合種比單一菌株在抵御病害與應(yīng)對脅迫上具有更好的效果。

目前, 植物與微生物互作的研究大多數(shù)基于模式生物擬南芥或者水稻、玉米等主要糧食作物, 而對花生根系內(nèi)生菌群落結(jié)構(gòu)鮮有報道。本研究通過對不同鈣處理下花生根系內(nèi)生菌的群落基因組進(jìn)行16SrRNA 基因V3–V4 區(qū)測序, 試圖探析對鈣敏感花生植株在酸性低鈣條件下, 施鈣處理對其根系微生物群落結(jié)構(gòu)的影響, 為合理施用礦質(zhì)營養(yǎng)元素、改良酸性土壤品質(zhì)、降低花生病害發(fā)生提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗地點(diǎn)為湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)耘園科研基地?；ㄉ捎脟抑魍频拇笞哑贩N湘花2008, 由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)旱地作物研究所選育, 對鈣敏感; 酸性低鈣土壤取自湖南省瀏陽市普跡鎮(zhèn)書院村月光坪的第四紀(jì)紅壤表層土, pH 4.5, 含有機(jī)質(zhì)27.3 g kg-1、全氮(N)0.82 g kg-1、全磷(P) 0.33 g kg-1、全鉀(K) 17 g kg-1、堿解氮(N) 64 mg kg-1、速效鉀(K) 82 mg kg-1、陽離子交換量13 cmol (+) kg-1、交換性鈣(Ca) 0.74 cmol(1/2 Ca2+) kg-1、交換性鎂(Mg) 0.13 cmol (1/2 Mg2+)kg-1、有效鋅(Zn) 0.63 mg kg-1、有效硫(S) 143.7 mg kg-1、有效硼(B) 0.12 mg kg-1、有效鉬(Mo) 0.08 mg kg-1, 有效磷(P)未檢出, 為典型酸性缺鈣紅壤(依發(fā)明專利“花生種質(zhì)鈣敏感性的土壤鑒定方法”進(jìn)行土壤鑒定, 具體鑒定方法詳見專利附錄)。

選取內(nèi)徑36 cm、高75 cm、壁厚度0.5 cm 的PVC 管組裝成塑料大桶, 一端置于地膜之上以防止供試土壤與試驗地原有土壤接觸。每桶內(nèi)裝供試土壤90 kg。施鈣組每桶施加生石灰(CaO) 12.5 g (125 kg hm-2), 與桶中表層供試土壤充分混勻, 對照組不施加生石灰(CaO)。為保證除鈣以外的其他基本養(yǎng)分平衡一致的供給, 本試驗除進(jìn)行施鈣及對照處理外,各樣品組其他養(yǎng)分均依臨界值進(jìn)行養(yǎng)分平衡: 于土柱表層0～20 cm 處, 參照大田標(biāo)準(zhǔn)(45%氮磷鉀等比例復(fù)合肥750 kg hm-2)每桶施尿素4.02 g、磷酸二氫鉀8.23 g 及六水氯化鎂8.50 g, 并混勻。施鈣組與對照組各相同處理10 桶作為重復(fù)。依十字將大桶劃分為4 個區(qū)域, 每桶定苗4 株(作為不同生育期采集檢測樣本), 始花期每桶噴施等量硼肥?；ㄉL發(fā)育階段進(jìn)行正常的水分和病蟲草害的管理。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品采集及處理 分別于苗期(2019-06-04)、花針期(2019-06-24)與飽果期(2019-08-14)采集施鈣組與對照組植株根系樣品。每組設(shè)置3 個重復(fù)。將各組樣品植株全株拔出, 抖動根系以去除疏松的大塊土壤。用2 把無菌剪刀分別在施鈣組與對照組樣品根莖交界處正下方切下約5 cm 的根。抖落大塊土壤, 并用滅菌毛刷清除表面小顆粒狀土壤, 再用無菌水多次反復(fù)沖洗樣本表面, 并摘去小側(cè)根。將處理后的根放入5%次氯酸鈉溶液浸泡5 min, 再轉(zhuǎn)移至裝有適量無菌玻璃珠及無菌水的50 mL 滅菌離心管中, 劇烈搖晃以便物理去除根表土壤微生物, 用無菌水重復(fù)振蕩沖洗3 次。稱取2 g 根系組織, 用滅菌剪刀盡可能剪碎, 放入滅菌三角瓶, 加入20 mL 無菌的1×PBS 緩沖液, 搖床振蕩4 h, 40 KHz 超聲波超聲振蕩15 min, 5 μm 濾膜真空抽濾。將濾液15,000×g離心15 min, 棄上清收集菌體沉淀。使用EasyPure Genomic DNA Kit 試劑盒提取菌體沉淀中的根系內(nèi)生細(xì)菌基因組DNA, 使用NanoDrop2000 檢測所提樣品的核酸質(zhì)量, 合格后送天津諾禾致源生物信息科技有限公司進(jìn)行16S 擴(kuò)增子測序, 樣品編號如表1 所示。

表1 16S 擴(kuò)增子測序樣品分組編號Table 1 Group number of 16S amplicon sequencing sample

1.2.2 16S 擴(kuò)增子測序 取適量樣本DNA 于離心管中, 使用無菌水稀釋樣本至1 ng μL-1, 以稀釋后的基因組DNA 為模板, 根據(jù)測序區(qū)域16S V3-V4 選擇 特 異 引 物 341F (Forward primer 5′-CCTAYG GGRBGCASCAG-3′)與806R (Reverse primer 5′-GG ACTACNNGGGTATCTAAT-3′)進(jìn)行PCR。PCR 產(chǎn)物使用 2%濃度的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測后使用GeneJET 試劑盒純化回收目標(biāo)條帶。使用Ion Plus Fragment Library Kit 試劑盒進(jìn)行文庫構(gòu)建。構(gòu)建好的文庫經(jīng)質(zhì)檢合格后使用Thermofisher 的Ion S5 XL進(jìn)行上機(jī)測序, 對測序后下機(jī)的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接和過濾, 得到Clean Reads。

1.2.3 OTUs 聚類分析 默認(rèn)以 97%的一致性(Identity)對 Clean Reads 進(jìn)行 OTUs (operational Taxonomic units)聚類, 然后通過與數(shù)據(jù)庫Silva132的比對進(jìn)行物種注釋。分析微生物群落結(jié)構(gòu)差異并繪制差異OTUs 韋恩圖、UPGMA 聚類樹及屬水平下物種相對豐度柱形圖。選取屬分類水平下Top40優(yōu)勢物種, 使用SPSS 軟件對施鈣處理與對照下不同生育期各物種相對豐度差異進(jìn)行獨(dú)立樣品T 檢驗統(tǒng)計分析, 顯著差異的分析結(jié)果使用OriginPro 2019軟件繪制柱狀圖。

1.2.4 LEfSe 分析 LEfSe (LDA effect size)是一種用于發(fā)現(xiàn)和解釋高維度生物標(biāo)識(基因、通路和分類單元)的分析工具, 它強(qiáng)調(diào)統(tǒng)計意義和生物相關(guān)性,能夠在組與組之間尋找具有統(tǒng)計學(xué)差異的Biomarker, 讓研究人員能夠識別不同豐度的特征以及相關(guān)聯(lián)的類別, 以便找出哪些核心菌群引起組間群落的顯著差異。本研究以3 作為LDA Score 的篩選值對各樣品組測序數(shù)據(jù)進(jìn)行LEfSe 分析并繪制進(jìn)化分支圖。在進(jìn)化分支圖中, 由內(nèi)至外輻射的圓圈代表了由門至屬(或種)的分類級別。在不同分類級別上的每一個小圓圈代表該水平下的一個分類, 小圓圈直徑大小與相對豐度大小呈正比。著色原則為無顯著差異的物種統(tǒng)一著色為黃色, 差異物種Biomarker 跟隨組進(jìn)行著色。

1.2.5 共發(fā)生網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 分別對施鈣組與對照組樣品中相對豐度排名Top100 的微生物屬進(jìn)行Pearson相關(guān)系數(shù)計算, 以優(yōu)勢微生物屬作為核心節(jié)點(diǎn), 選取Pearson 相關(guān)系數(shù)大于0.6 或小于-0.6 且顯著差異(P<0.05)的連接作為有效連接, 使用Cytoscape 軟件進(jìn)行共發(fā)生網(wǎng)絡(luò)圖繪制, 以便更加清晰的看出不同樣品組中某個微生物屬和其他微生物的關(guān)聯(lián)狀況。

2 結(jié)果與分析

2.1 根系微生物基因組16S V3-V4 的PCR 擴(kuò)增結(jié)果

以稀釋后基因組DNA 為模板, 選擇16S V3-V4的特異引物341F (5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′)與806R (5′-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3′)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。部分樣品基因組特異引物擴(kuò)增后電泳檢測結(jié)果如圖1 所示。

2.2 16S 擴(kuò)增子測序數(shù)據(jù)分析

2.2.1 OTU 聚類及物種注釋概況 經(jīng)過物種注釋及對不同分類層級統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn), 共有2378 個OTUs, 其中能夠注釋到數(shù)據(jù)庫的OTUs 數(shù)目為2372(99.75%), 在門水平上, 發(fā)現(xiàn)占據(jù)主導(dǎo)地位的物種包括厚壁菌門 (Firmicutes) 、變形菌門(Proteobacteria)、藍(lán)藻門(Cyanobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)及放線菌門(Actinobacteria); 在綱水平上主要有芽孢桿菌綱(Bacilli)、γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)、梭菌綱(Clostridia)、α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)及擬桿菌綱(Bacteroidia);在目水平上的優(yōu)勢物種為芽孢桿菌目(Bacillales)、腸桿菌目(Enterobacteriales)、根瘤菌目(Rhizobiales)、梭 菌 目 (Clostridiales) 以及黃單胞菌目(Xanthomonadales); 在科水平上的主要物種為芽孢桿菌科(Bacillaceae)、腸桿菌科(Enterobacteriaceae)、伯克氏菌科(Burkholderiaceae) 、 根瘤菌科(Rhizobiaceae)及黃單胞菌科(Xanthomonadaceae)。

2.2.2 花生根系內(nèi)生菌群落結(jié)構(gòu) 為分析不同生育期花生根系內(nèi)生細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu), 研究不同樣本組之間的相似性, 本研究通過對樣本以Binary Jaccard 距離矩陣進(jìn)行UPGMA 等級聚類, 構(gòu)建樣本的聚類樹。同時根據(jù)聚類得到的OTUs 分析不同樣本組之間共有及特有的OTUs 并繪制成韋恩圖, 如圖2 所示。根據(jù)差異OTUs 韋恩圖分析可以發(fā)現(xiàn), 除43 個共有的核心OTUs 以外, 隨著花生植株的生長發(fā)育, 各生育期特有的OTUs 逐漸減少: 苗期施鈣與不施鈣樣品組特有的OTUs 數(shù)目為177、117; 花針期施鈣組特有24 個差異OTUs, 而不施鈣組特有47 個差異OTUs; 飽果期施鈣組與對照組的差異OTUs 數(shù)分別為5、8。

選取不同生育期不同處理下各樣品組在屬(Genus)分類水平上相對豐度排名前20 的物種繪制物種相對豐度柱形圖, 以便直觀查看各樣品組中相對豐度較高的優(yōu)勢物種及其所占比例(圖3)。根據(jù)測序結(jié)果, 統(tǒng)計了各生育期不同處理樣品組的優(yōu)勢物種(相對豐度排名前5 的優(yōu)勢屬), 如表2 所示。苗期不施鈣樣品組優(yōu)勢菌屬有不動桿菌屬(Acinetobacter:16.9%)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella: 16.8%)、腸桿菌屬(Enterobacter: 7.5%) 、厭氧芽孢桿菌屬(Anoxybacillus: 5.0%)、草螺菌屬(Herbaspirillum:4.9%)等; 苗期施鈣樣品組優(yōu)勢菌屬包括克雷伯氏菌屬(Klebsiella: 30.1%)、芽孢桿菌屬(Bacillus: 26.3%)、腸桿菌屬(Enterobacter: 6.1%) 、水棲菌屬(Enhydrobacter: 5.1%) 、慢生根瘤菌屬(Bradyrhizobium: 1.8%)等; 花針期不施鈣樣品組優(yōu)勢菌屬有克雷伯氏菌屬(Klebsiella: 16.9%)、腸桿菌屬(Enterobacter: 8.9%)、不動桿菌屬(Acinetobacter:6.7%)、泛菌屬(Pantoea: 5.0%)、戴氏菌屬(Dyella:3.7%)等; 花針期施鈣樣品組優(yōu)勢菌屬有克雷伯氏菌屬 (Klebsiella: 37.2%) 、寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas: 13.1%) 、假單胞菌屬(Pseudomonas: 8.7%)、從毛單胞菌屬(Comamonas:8.3%)、腸桿菌屬(Enterobacter: 7.4%)等; 飽果期不施鈣樣品組優(yōu)勢菌屬為克雷伯氏菌屬(Klebsiella:33.4%)、腸桿菌屬(Enterobacter: 11.3%)、類芽孢桿菌屬(Paenibacillus: 6.3%)、假單胞菌屬(Pseudomonas:4.9%)、芽孢桿菌屬(Bacillus: 1.7%)等; 飽果期施鈣樣品組優(yōu)勢菌屬為克雷伯氏菌屬(Klebsiella: 30.9%)假單胞菌屬(Pseudomonas: 8.9%)、類芽孢桿菌屬(Paenibacillus: 8.7%) 、 賴氨酸芽孢桿菌屬(Lysinibacillus: 8.3%)、芽孢桿菌屬(Bacillus: 3.2%)等; 部分主要優(yōu)勢物種未鑒定到屬分類水平, 如伯克氏菌科 (Burkholderiaceae) 、 根瘤菌科(Rhizobiaceae)、 梭菌目(Clostridiales)、藍(lán)藻門(Cyanobacteria)等故而未列入上述不同樣品組中優(yōu)勢物種排名。綜合各樣品組數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn), 克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、腸桿菌屬(Enterobacter)在所有樣品組中均為優(yōu)勢物種且相對豐度較高。

表2 屬分類水平下不同生育期不同處理相對豐度百分比Top 10 的根系內(nèi)生菌Table 2 Percentage of the Top 10 relative abundance under different growth stage and different treatments at the genus level

2.2.3 優(yōu)勢菌屬差異 為了尋找不同處理下不同生育期樣品組中具有顯著差異的微生物屬, 選取屬分類水平下Top40 優(yōu)勢物種, 對施鈣處理與對照下的不同生育期各物種相對豐度差異進(jìn)行獨(dú)立樣品T檢驗(T-test)統(tǒng)計分析(圖4)發(fā)現(xiàn), 施鈣組與對照組樣品在苗期與飽果期時, 雖然部分微生物屬在相對豐度上存在差異, 但并不顯著(P＞0.05), 而花針期施鈣處理與對照之間, 假單胞菌屬(Pseudomonas:P=0.025)、賴氨酸芽孢桿菌屬(Lysinibacillus:P=0.037)及勞爾氏菌屬(Ralstonia:P=0.038)的相對豐度存在顯著差異(P≤0.05)。其中假單胞菌屬(Pseudomonas)與賴氨酸芽孢桿菌屬(Lysinibacillus)施鈣組中的相對豐度較不施鈣組明顯增加而勞爾氏菌屬(Ralstonia)的相對豐度則在施鈣組中顯著降低。前人研究發(fā)現(xiàn)假單胞菌屬(Pseudomonas)與賴氨酸芽孢桿菌屬(Lysinibacillus)的部分菌株具有抑菌活性, 降解有害物質(zhì)甚至抵御病害侵襲的作用, 而勞爾氏菌屬(Ralstonia)與花生青枯病病原菌在分類水平上為同一屬。施鈣對這些優(yōu)勢微生物屬相對豐度的顯著影響極有可能與這些菌屬的生物學(xué)功能息息相關(guān)。施鈣可能在一定程度上能抑制某些病原菌生長, 從而有利于花生抵御相關(guān)病害。

LEfSe 統(tǒng)計分析結(jié)果如圖5 (LEfSe 進(jìn)化分支圖)所示, 紅色節(jié)點(diǎn)表示在苗期不施鈣樣品組中起到重要作用的微生物類群, 綠色節(jié)點(diǎn)表示在苗期施鈣樣品組中起到重要作用的微生物類群, 藍(lán)色節(jié)點(diǎn)表示在花針期不施鈣樣品組中起到重要作用的微生物類群, 紫色節(jié)點(diǎn)表示在花針期施鈣樣品組中起到重要作用的微生物類群, 淺藍(lán)色節(jié)點(diǎn)表示在飽果期不施鈣樣品組中起到重要作用的微生物類群, 橙色節(jié)點(diǎn)表示在飽果期施鈣樣品組中起到重要作用的微生物類群。進(jìn)化分支圖結(jié)果顯示, 紫色扇形區(qū)域與橙色扇形區(qū)域較大且相關(guān)節(jié)點(diǎn)較多, 表明花針期與飽果期施鈣樣品組中能起到關(guān)鍵生物學(xué)作用的微生物類群較多。屬分類水平上: 施鈣樣品組中苗期的慢生根瘤菌屬(Bradyrhizobium), 花針期的希瓦氏菌屬(Shewanella)、假單胞菌屬(Pseudomonas)及寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas), 飽果期的類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)、賴氨酸芽孢桿菌屬(Lysinibacillus)與短波單胞菌屬(Brevundimonas)等優(yōu)勢物種分別在不同的生育期起關(guān)鍵性生物學(xué)作用。

2.2.4 Network 共發(fā)生網(wǎng)絡(luò)分析 網(wǎng)絡(luò)分析被廣

泛應(yīng)用于復(fù)雜微生物群落的探究中。為進(jìn)一步探究不同處理下花生根系內(nèi)生細(xì)菌間的相互作用, 本研究計算差異菌屬兩兩之間pearson 相關(guān)系數(shù)并構(gòu)建了共發(fā)生網(wǎng)絡(luò)(圖6)。在施鈣組微生物菌屬共發(fā)生網(wǎng)絡(luò)中, 核心菌屬類諾卡式菌屬(Nocardioides)與18 個菌屬顯著正相關(guān), 溶桿菌屬(Lysobacter)和中生根瘤菌屬(Mesorhizobium)均與17 個菌屬顯著正相關(guān), 細(xì)鏈孢菌屬(Catenulispora)與16 個菌屬顯著正相關(guān)。而相應(yīng)的在不施鈣處理下樣品組根系內(nèi)生菌關(guān)聯(lián)互作網(wǎng)絡(luò)中, 發(fā)現(xiàn)核心菌屬潘多拉菌屬(Pandoraea)與其他菌屬之間的總關(guān)聯(lián)系數(shù)最高, 而戴氏菌屬(Dyella)與 16 個菌屬顯著正相關(guān)。叢毛單胞菌屬(Comamonas)、羅河桿菌屬(Rhodanobacter)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、勞爾氏菌屬(Ralstonia)等優(yōu)勢菌屬也與其他菌屬之間存在不同程度的關(guān)聯(lián)互作。推測在施鈣處理的花生根系內(nèi)生細(xì)菌群落中, 類諾卡式菌屬(Nocardioides)、溶桿菌屬(Lysobacter)、中生根瘤菌屬(Mesorhizobium)以及細(xì)鏈孢菌屬(Catenulispora)作為核心菌屬具有重要調(diào)控作用, 且對網(wǎng)絡(luò)內(nèi)其他微生物種群影響較大。而在不施鈣處理的花生根系內(nèi)生細(xì)菌群落中, 潘多拉菌屬(Pandoraea)、戴氏菌屬(Dyella)、叢毛單胞菌屬(Comamonas)、羅河桿菌屬(Rhodanobacter)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、勞爾氏菌屬(Ralstonia)等可能為該微生物群落的核心調(diào)控菌屬, 對其他微生物種群具有較大的影響。同時可以明顯看出, 以類諾卡式菌屬(Nocardioides)為核心的施鈣組菌群之間互作聯(lián)系更為緊密, 有效關(guān)聯(lián)更多。表明施鈣能在一定程度上增強(qiáng)根系內(nèi)生菌群之間的互作聯(lián)系, 使相互關(guān)聯(lián)緊密。

3 討論

植物根系是植物-微生物互作的重要生境場所。在此微生態(tài)區(qū)域, 微生物更易受到植物種類、土壤類型、植物生長階段等多因素的影響。本研究采用高通量測序技術(shù), 摒棄了繁瑣復(fù)雜的分離純化菌株,以新的視角全面探究, 比較分析了施鈣處理與對照之間花生根系內(nèi)生菌群落結(jié)構(gòu)的顯著差異: 差異OTUs 分析發(fā)現(xiàn), 苗期與飽果期施鈣樣品組中所含根系內(nèi)生細(xì)菌差異OTUs 數(shù)顯著高于不施鈣樣品,即這2 個不同生育期施鈣花生樣品中根系內(nèi)生細(xì)菌多樣性較對照組更為豐富。優(yōu)勢菌屬差異分析發(fā)現(xiàn),假單胞菌屬(Pseudomonas)與賴氨酸芽孢桿菌屬(Lysinibacillus)的相對豐度在施鈣組中顯著增加, 而勞爾氏菌屬(Ralstonia)相對豐度顯著降低。克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、腸桿菌屬(Enterobacter)、類芽孢桿菌屬 (Paenibacillus) 、寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)等優(yōu)勢物種作為施鈣與對照組間顯著差異菌群分別在不同的生育期施鈣組樣品中起關(guān)鍵性生物學(xué)作用。同時, 共發(fā)生網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建展示出施鈣能在一定程度上使根系內(nèi)生細(xì)菌種群之間聯(lián)系更為緊密, 增強(qiáng)優(yōu)勢菌群之間的關(guān)聯(lián)互作; 同時分析結(jié)果還表明, 類諾卡式菌屬(Nocardioides)、溶桿菌屬(Lysobacter)、細(xì)鏈孢菌屬(Catenulispora)等是施鈣組根系內(nèi)生菌群落中的核心菌屬。

Ibanez 等[18]的研究發(fā)現(xiàn), 克雷伯氏菌屬(Klebsiella)能在花生根系結(jié)瘤固氮和促進(jìn)植株生長,Sharm 等[19]發(fā)現(xiàn), 克雷伯氏菌 MBE02 (KlebsiellaMBE02)能誘導(dǎo)花生產(chǎn)生ISR 同時抵御真菌病害。Gong 等[20]的研究論述了阿氏腸桿菌Vt-7 (Enterobacter asburiaeVt-7)對黃曲霉的抑菌活性及對黃曲霉毒素的減毒作用, 與此同時Yang 等[21]分離的熒光假單胞菌3JW1 (Pseudomonas fluorescens3JW1)、Wang 等[22]發(fā)現(xiàn)的青島假單胞菌新種(Pseudomonas qingdaonensissp. nov.)、Wang 等[23]首次報道的解木糖賴氨酸芽孢桿菌(Lysinibacillus xylanilyticus)等菌株同樣具有抑制黃曲霉菌活性, 降解黃曲霉毒素或者產(chǎn)生黃曲霉毒素抑制劑的作用。Haggag 等[24]研究證實, 多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)能有效生物防治花生冠腐病。魏蘭芳等[25]發(fā)現(xiàn), 抗生素溶桿菌13-1 (Lysobacter antibioticus13-1)菌株產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)能對水稻白葉枯病具有防治效果。類諾卡式菌屬(Nocardioides)大多能降解有毒物質(zhì), 對石油污染土壤進(jìn)行生物修復(fù), 雒曉芳等[26]卻分離鑒定并探究了白色類諾卡氏菌(Nocardioides albus)對部分病原菌的抑菌活性。云天艷等[27]還從木薯根際分離到能拮抗尖孢鐮刀菌的?；头啪€菌MS13, 鑒定后屬于細(xì)鏈孢菌屬(Catenulispora)。

結(jié)合這些以往的研究成果可以合理推測, 克雷伯氏菌屬(Klebsiella)作為所有樣品組中的優(yōu)勢物種在某種程度上具有結(jié)瘤固氮促進(jìn)植株生長以及提高花生產(chǎn)量的作用。施鈣能顯著增加假單胞菌屬(Pseudomonas)與賴氨酸芽孢桿菌屬(Lysinibacillus)在根系內(nèi)生菌群落中的相對豐度, 聯(lián)合腸桿菌屬(Enterobacter)、類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)、寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)等優(yōu)勢物種能在一定條件下抑制黃曲霉活性同時緩解黃曲霉毒素的毒性甚至降低花生冠腐病的發(fā)生概率。與對照組相比, 相對豐度顯著降低的勞爾氏菌屬(Ralstonia)則間接說明施鈣極有可能同時抑制花生青枯病的發(fā)生。而類諾卡式菌屬(Nocardioides)、溶桿菌屬(Lysobacter)、細(xì)鏈孢菌屬(Catenulispora)等作為施鈣組中的核心菌屬能對部分病原菌產(chǎn)生抑菌活性。

4 結(jié)論

施鈣能豐富根系內(nèi)生細(xì)菌群落的多樣性, 使群落間更為緊密的關(guān)聯(lián)互作; 也能使根系微生物組具有更好的促生作用, 使植株能更好地抵御病害侵襲;施鈣能增強(qiáng)特定物種的相對豐度從而促進(jìn)花生植株的生長發(fā)育, 提高產(chǎn)量與品質(zhì)同時可能抑制常見病害如花生冠腐病、花生青枯病的發(fā)生, 抑制黃曲霉菌活性甚至降解黃曲霉毒素; 這些研究結(jié)果在一定程度上為南方酸性紅壤條件下種植花生提供了施肥管理及病害防控等方面的合理模式, 同時為如何改良酸性土壤品質(zhì)及提高花生產(chǎn)量與品質(zhì)奠定了理論基礎(chǔ)。