一個新的水稻脆稈突變體bc17 的鑒定及基因定位

姜鴻瑞 葉亞峰 何 丹 任 艷 楊 陽 謝 建 程維民陶亮之 周利斌 吳躍進 劉斌美,*

1 中國科學(xué)院合肥物質(zhì)科學(xué)研究院, 安徽合肥 230031; 2 中國科學(xué)技術(shù)大學(xué), 安徽合肥 230026; 3 中國科學(xué)院近代物理研究所, 甘肅蘭州 730000

水稻莖稈的機械強度是重要的農(nóng)藝性狀之一,直接影響著植株的抗倒伏能力。水稻脆性突變體是一類比較常見的突變體[1], 是研究細(xì)胞壁合成機制的重要材料。脆性突變一般是指植株莖稈機械強度下降, 通常表現(xiàn)為纖維素和半纖維素含量下降, 木質(zhì)素含量升高[2], 在結(jié)構(gòu)上表現(xiàn)為厚壁組織次生細(xì)胞壁變薄[3]。由于莖稈機械強度下降, 存在倒伏發(fā)生的隱患, 生產(chǎn)上一般認(rèn)為是不利的性狀。然而脆性突變體秸稈脆嫩、纖維素含量下降, 有利于反芻動物采食, 消化更加容易, 具備成為糧飼兼用型水稻品種的應(yīng)用潛力[4]。另外, 脆稈突變體的莖稈易粉碎降解, 對于秸稈生態(tài)還田有著很好的應(yīng)用前景, 是一種重要的種質(zhì)資源[5]。

從第一個水稻脆稈基因bc1[6]被發(fā)現(xiàn)以來, 對水稻脆性突變體的研究已有50 多年的歷史了。截止目前, 報道的水稻脆性突變體僅有20 多個, 大多數(shù)基因都是涉及細(xì)胞壁纖維素合成酶OsCesA (cellulose synthase)的變異, 其中以bc (brittle culm)命名的水稻脆性突變體有16 個(bc1～bc16), 相對研究的比較系統(tǒng)和深入, 并且對細(xì)胞壁合成調(diào)控的機制做了詳細(xì)解析[7-8]。細(xì)胞壁化學(xué)成分的變化、合成和轉(zhuǎn)運的阻滯以及厚壁組織結(jié)構(gòu)發(fā)育異常等都可能引起水稻莖稈機械強度的改變[9-19]。近來發(fā)現(xiàn)水稻轉(zhuǎn)錄因子也參與細(xì)胞壁生物合成的過程[20-22]。水稻纖維素合酶基因是引起脆稈特性的關(guān)鍵基因, 其中最重要的是OsCesA4、OsCesA7、OsCesA9, 可能形成一個纖維素合成復(fù)合體參與次生細(xì)胞壁的合成[12]。水稻脆稈基因bc7和bc11基因[13-14]是OsCesA4的等位變異;bc6和bc13基因[15-16]是OsCesA9的等位變異。bc10、bc14、bc15可能參與細(xì)胞壁的修飾, 其中bc10基因編碼一個定位在高爾基體的Ⅱ型內(nèi)整合膜蛋白, 調(diào)節(jié)細(xì)胞壁纖維素合成和阿拉伯半乳聚糖蛋白含量[17],bc14基因編碼核苷酸糖轉(zhuǎn)運蛋白OsNST1, 定位于高爾基體, 轉(zhuǎn)運 UDPG, 可能為多糖生物合成提供底物[18]。bc15基因編碼一個膜相關(guān)的類幾丁質(zhì)酶蛋白[19]。轉(zhuǎn)錄因子MYB 家族和NAC 家族參與到細(xì)胞壁的合成途徑, 比如NAC29/31-MYB61-CESA 通路調(diào)控細(xì)胞壁生物合成和組裝來影響次生細(xì)胞壁纖維素合成[20-22]。bc12基因編碼一個雙靶向的驅(qū)動蛋白4, 控制水稻細(xì)胞周期進程, 揭示細(xì)胞生長和細(xì)胞壁修飾存在潛在的聯(lián)系[23]。細(xì)胞壁的合成主要由不同類型的糖基轉(zhuǎn)移酶來完成, 而且目前被揭示功能的酶還很少, 明確具體生化特征的更少[8]。由于水稻細(xì)胞壁的生物合成過程非常復(fù)雜, 涉及的調(diào)控途徑類型多樣, 新基因的發(fā)掘和研究有助于完善細(xì)胞壁合成機制, 為水稻細(xì)胞壁定向改良育種奠定理論基礎(chǔ)。

本實驗以重離子輻照誘變粳稻品種武運粳7 號(Wuyunjing 7, wyj7)獲得的一個脆稈突變體為研究對象, 根據(jù)水稻脆稈突變基因命名規(guī)則和順序, 將其稱為bc17突變體(brittle culm 17), 分析bc17突變體的脆性性狀對農(nóng)藝特征及機械強度的影響, 通過莖稈組織結(jié)構(gòu)的解剖學(xué)及細(xì)胞壁成分的測定來分析脆性形成的生物學(xué)機制, 利用遺傳學(xué)及圖位克隆技術(shù)將bc17突變位點進行染色體定位, 通過生物信息學(xué)分析鑒定可能的候選基因, 為進一步分離目標(biāo)基因奠定基礎(chǔ), 同時為育種應(yīng)用提供高效的篩選標(biāo)記。

1 材料與方法

1.1 材料

脆稈突變體bc17、野生型武運粳7 號以及用于遺傳分析和基因定位的群體材料, 均種植于中國科學(xué)院合肥物質(zhì)科學(xué)研究院水稻實驗基地(安徽合肥),種植方式為人工栽插, 常規(guī)田間管理。

1.2 農(nóng)藝性狀分析

在田間隨機取10 株成熟期供試水稻材料, 考察其主要農(nóng)藝特征和經(jīng)濟性狀, 包括株高、穗長、分蘗數(shù)、每穗粒數(shù)、千粒重、結(jié)實率等。

1.3 細(xì)胞壁組分含量分析

根據(jù)Van Soest 等[24]方法測定細(xì)胞壁纖維素、半纖維素和木質(zhì)素等主要組成組分含量。取成熟期的水稻材料, 將莖稈和葉片分開, 剪成適當(dāng)?shù)拈L度放入65℃烘箱中, 待完全烘干后取出, 用旋風(fēng)磨分別將莖稈和葉片粉碎, 粉末裝入干凈的封口袋中以備后續(xù)實驗使用。重復(fù)3 次。

1.4 bc17 莖稈機械強度測定

1.4.1 莖稈拉伸力的測定 在成熟期從田間選取新鮮水稻材料, 將莖鞘分離后截取第2 節(jié)間莖稈夾持在萬能力學(xué)試驗機(LD23.502, 力試(上海)科學(xué)儀器有限公司)上, 在莖稈斷裂失去載荷后自動停止拉伸, 記錄數(shù)據(jù)。

1.4.2 莖稈抗折力的測定 在成熟期從田間選取新鮮水稻材料, 將莖鞘分離后截取第2 節(jié)間莖稈, 放置在等間距的支架上, 用數(shù)顯式拉壓力計(HP-50, 樂清市艾德堡儀器有限公司)從莖稈中部向下施壓使水稻莖稈折斷, 記錄施加力的峰值, 即為莖稈抗折力。

1.4.3 倒伏指數(shù)的計算 根據(jù)章忠貴等[25]的方法略有修改, 在成熟期采集新鮮樣品, 測量相應(yīng)位置的長度和重量, 計算突變體和野生型第2 節(jié)間的彎曲力矩和倒伏指數(shù)。

彎曲力矩 = 節(jié)間基部至穗頂?shù)拈L度(cm) × 該節(jié)間基部至穗頂?shù)孽r重(g) × 0.001 × 9.8

倒伏指數(shù) = (彎曲力矩/抗折力) × 100

倒伏指數(shù)越大, 則莖稈越易倒伏, 以倒伏指數(shù)200 為抗倒伏臨界值。

1.5 莖稈結(jié)構(gòu)的電鏡觀察

取成熟期相同部位的脆稈突變體及其野生型莖稈切成2～4 mm 的小段, 投入含有2.5%戊二醛的PBS 緩沖液(4 mmol L–1sodium phosphate, pH 7.2;200 mmol L–1NaCl)中, 4℃固定48 h 后用1%鋨酸PBS (phosphate buffer saline)溶液固定。固定后的樣品經(jīng)過PBS 緩沖液充分漂洗后, 順序用10%、20%、40%、60%和80%的乙醇梯度各處理30 min 脫水,再用100%乙醇處理2 次各30 min, 100%丙酮處理2次各 5 min。脫水后的材料依次用 London Resin White (Sigma, USA)樹脂與乙醇順序以1∶3、1∶1和3∶1 的比例混合進行置換和浸透, 最后換入純樹脂繼續(xù)浸透 48 h, 并于模塊中包埋, 60℃聚合24 h。樣品修塊后以80 nm 超薄切片, 放置于銅網(wǎng)上, 觀察前用醋酸鈾和檸檬酸鉛復(fù)染。樣品放置在透射電鏡上觀察[26]。

1.6 脆稈突變體bc17 的遺傳學(xué)分析

利用bc17突變體分別與粳稻品種(武運粳7 號和當(dāng)粳8 號)和秈稻品種(特青、黃花占和9311)進行人工雜交, F1代經(jīng)自交獲得F2代種子。在成熟期對F2代植株進行莖稈脆性鑒定, 統(tǒng)計野生型和突變表型個體的數(shù)目, 并用統(tǒng)計學(xué)方法計算分離比例和卡方檢驗。

1.7 bc17 基因的染色體定位

利用對bc17/9311 雜交構(gòu)建的F2分離群體對bc17基因進行初定位, 采用BSA (bulked segregant analysis)法進行基因定位, 即混合分組分析, 也稱分離群體分組分析, 是一種通過在群體中挑選極端或代表性性狀的個體組成混池進行分析的方法。通過研究混池之間等位基因/分子標(biāo)記頻率的差異, 將與性狀相關(guān)的位點在基因組上進行定位。選擇在水稻12 條染色體上均勻分布的408 個SSR (simple sequence repeat)標(biāo)記進行親本多態(tài)性檢測, 利用篩選出的差異SSR 標(biāo)記對親本、F1植株以及混合池(20個脆稈單株等量DNA 混合)進行PCR 擴增, 對電泳產(chǎn)物的統(tǒng)計分析。在精細(xì)定位階段, 根據(jù)網(wǎng)上公布的Nipponbare 和9311 序列, 并選擇定位區(qū)間中存在差異的序列進行引物設(shè)計與合成。用這些引物分別對bc17和9311 基因組DNA 進行PCR 擴增。PCR程序按常規(guī)方法進行。如果PCR 產(chǎn)物在bc17突變體和9311 間產(chǎn)生多態(tài)性, 就直接用作新的SSR 或者InDel (insertion and deletion)分子標(biāo)記。

1.8 數(shù)據(jù)分析

采用Origin 2018 對本文實驗數(shù)據(jù)進行差異性分析和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 bc17 突變體的表型特征

通過對突變體bc17和野生型wyj7 在整個生育期中農(nóng)藝特征的觀察發(fā)現(xiàn): 該突變體從抽穗期開始,株高顯著低于野生型, 分蘗數(shù)明顯減少(圖1-A), 在拔節(jié)期時通過手工折斷實驗, 突變體bc17莖稈表現(xiàn)出韌性喪失, 能夠明顯折成兩截折斷且斷口清晰,而野生型莖稈則表現(xiàn)出韌性, 沒有斷口出現(xiàn)難以折斷(圖1-B)。突變體的葉片和野生型的類似, 均只能折出痕跡, 無明顯斷裂(圖1-C), 突變體的穗子比野生型變短, 穗粒數(shù)減少, 結(jié)實率顯著降低(圖1-D)。

2.2 bc17 突變體的農(nóng)藝性狀分析

與野生型相比, 突變體bc17的株高、穗長以及結(jié)實率極顯著降低, 降低程度分別為 26.61%、27.51%以及18.54%, 每穗粒數(shù)降低了13.18%, 達(dá)到顯著水平, 而分蘗數(shù)和千粒重雖然降低, 但是差異不顯著(表1)。農(nóng)藝性狀的變化表明,bc17脆稈性狀的突變對于植株的生長和發(fā)育也產(chǎn)生了較大的影響,可能存在一因多效。

2.3 細(xì)胞壁組分含量的分析

木質(zhì)素(lignin)、纖維素(cellulose)、半纖維素(hemi-cellulose)以及灰分(主要成分是二氧化硅)是構(gòu)成水稻細(xì)胞壁的主要成分。通過測定成熟期突變體bc17和野生型wyj7 莖稈、葉片的細(xì)胞壁組分含量, 結(jié)果表明, 突變體bc17葉片和莖稈的纖維素含量比野生型分別降低18.67%和22.70%, 半纖維素含量分別升高31.36%和45.76%; 野生型葉片中木質(zhì)素含量顯著低于突變體， 而灰分含量顯著高于野生型,但是在莖稈中差異不明顯(表2)。細(xì)胞壁成分在不同組織中比例的差異, 可能是引起脆性特征特異表達(dá)的主要因素。

表1 突變體bc17 與野生型wyj7 農(nóng)藝性狀分析Table 1 Agronomic traits of mutant bc17 and wild type wyj7

表2 野生型和突變體bc17 莖稈和葉片細(xì)胞壁成分分析Table 2 Cell wall components between wild type wyj7 and mutant type bc17 (%)

2.4 脆稈突變體bc17 莖稈的物理特征

機械強度是水稻莖稈重要的物理特征之一, 而脆稈突變是引起機械強度改變的。在成熟期時測定水稻莖稈的第2 節(jié)間和第3 節(jié)間的折斷力、拉伸力。野生型wyj7 與突變體bc17莖稈的第2 節(jié)間莖稈抗折力分別為6.38 和3.33, 第3 節(jié)間莖稈抗折力分別為7.30 和4.73。bc17莖稈第2 節(jié)間抗折力比野生型降低了47.80%, 第3 節(jié)間莖稈抗折力降低了35.20%(圖2), 這與田間觀察的莖稈脆性特征相符, 突變體所需要的莖稈折斷力明顯減少, 拉伸力的測定也驗證了這一點, 第2 節(jié)間突變體相對于野生型分別降低了63.65%。第3 節(jié)間突變體相對于野生型分別降低了60.34%。脆稈突變體莖稈抗折力比野生型顯著下降, 可能會引起倒伏的發(fā)生, 因此計算了第2 節(jié)間的倒伏指數(shù)。結(jié)果表明bc17突變體第2 節(jié)間彎曲力矩比野生型顯著下降, 引起倒伏指數(shù)比野生型升高, 但是二者差異不顯著, 說明bc17突變體抗倒伏能力較強, 可能是由于突變體株高下降, 植株重心下移產(chǎn)生的后果。

2.5 組織解剖學(xué)觀察

為了觀察莖稈性狀對細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的影響, 成熟期分別對野生型wyj7 和突變體bc17莖稈第2 節(jié)間橫切樣品進行電鏡觀察, 結(jié)果發(fā)現(xiàn), 突變體莖稈的厚壁組織明顯變薄, 細(xì)胞之間空隙變大, 相應(yīng)地細(xì)胞密度降低, 細(xì)胞數(shù)目減少, 從而造成支撐力下降,對外力響應(yīng)變得敏感(圖3)。

2.6 遺傳分析

將突變體bc17分別與野生型wyj7 正反交得到F1, 雜交后F1代表型正常。統(tǒng)計雜交組合F2代中的群體單株總數(shù)以及具有脆稈表型的單株數(shù), 計算分離比例并進行卡方檢驗, 結(jié)果表明, 突變體bc17與不同品種雜交的F2群體脆稈植株分離比例均符合3∶1 (P>0.05)的理論比值(表4), 這表明bc17的脆稈特征是由一對單隱性核基因控制的。

表3 野生型和突變體bc17 倒伏指數(shù)計算Table 3 Lodging index of wild type and mutant type bc17

2.7 基因定位

用bc17/9311 雜交組合F2分離群體中的97 株脆稈表型植株作為定位群體。選取均勻分布于12 條染色體上的408 對SSR 分子標(biāo)記對bc17和9311 兩親本進行多態(tài)性篩選, 將具有多態(tài)性的110 對引物檢測親本。F1基因組DNA 以及突變混池DNA (選取20 個脆性單株等量DNA 混合)進行連鎖分析, 其中7 號染色體上的SSR 引物RM500 和RM3743 與突變體具有良好的連鎖性。利用bc17/9311 雜交組合的682 株F2 脆稈表型植株擴大群體進行精細(xì)定位, 在RM500～RM3743 之間設(shè)計多個InDel 分子標(biāo)記, 最終將bc17定位在UP-81 至DN-25 之間, 物理距離約162 kb 的區(qū)間內(nèi)(表5 和圖4)。在水稻基因組注釋網(wǎng)站(http://rice.plantbiology.msu.edu/)上進行生物信息學(xué)分析, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)定位區(qū)間內(nèi)有25 個編碼蛋白, 查詢這25 個蛋白的RNA-Seq FPKM (fregments per kilobase per million) 表達(dá)量, 該區(qū)間內(nèi)蛋白表達(dá)量差異較大, 其中10 個蛋白FPKM 值很低, 幾乎檢測不到; 結(jié)合基于序列比對的生物信息學(xué)的預(yù)測發(fā)現(xiàn),其中 8 個蛋白預(yù)測結(jié)果為轉(zhuǎn)座相關(guān)蛋白, 成為bc17的候選基因可能性較低。通過對其中7 個功能基因測序, 在序列上沒有發(fā)現(xiàn)涉及功能改變的序列差異, 需要進一步進行啟動子測序或者表達(dá)分析來確定可能的候選基因。在bc17定位區(qū)間預(yù)測有功能的基因涉及到氨基轉(zhuǎn)移酶(LOC_Os07g27780)、O-甲基轉(zhuǎn)移酶(LOC_Os07g27880)、硫酯酶(LOC_Os07g 27870)等, 都有可能影響到細(xì)胞壁組分的改變, 而這些基因目前還沒有相關(guān)研究報道。除了O-甲基轉(zhuǎn)移酶在RNA-seq 數(shù)據(jù)庫中僅在葉片中表達(dá)外, 氨基轉(zhuǎn)移酶和硫酯酶全生育期表達(dá), 其中硫酯酶在萌發(fā)前的花序中FRKM 值為9.61, 萌發(fā)后花序中FRKM值為31.63, 表達(dá)量具有時空特異性, 很可能是bc17的候選基因。

表5 bc17 基因定位部分引物Table 5 Part of the primers for bc17 gene mapping

3 討論

目前報道的許多水稻脆性突變體都伴隨著明顯的表型變化, 如植株矮小, 分蘗數(shù)減少, 結(jié)實率降低以及產(chǎn)量下降等, 且脆性全生育期、全組織表達(dá), 類似的有bc3和bc12等[23,26]。bc3突變體出現(xiàn)輕微矮化,與野生型相比bc3突變體的莖、葉、根中纖維素含量降低了28%～36%, 而其他細(xì)胞壁組分含量沒有發(fā)生變化[26]。bc12突變體由于細(xì)胞數(shù)目的顯著減少導(dǎo)致植株矮化, 纖維素微纖維的方向和細(xì)胞壁組分改變致使出現(xiàn)脆稈表型[23]。bc17突變體雖然植株變矮,但是脆性特征比較獨特, 具有組織特異性和時間表達(dá)特異性, 與其他矮稈脆性突變體具有明顯的差異。莖稈和葉片細(xì)胞壁成分測定顯示, 與野生型相比,bc17莖稈和葉片都出現(xiàn)纖維素含量降低, 半纖維素含量升高。值得一提的是, 與野生型相比,bc17葉片木質(zhì)素含量降低, 灰分升高, 也可能是導(dǎo)致葉片沒有表現(xiàn)出脆性的原因。

水稻脆稈性狀發(fā)生的原因, 除了涉及經(jīng)典的纖維素合成途徑(纖維素合酶)、多糖生物合成轉(zhuǎn)運途徑外, 轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控途徑以及細(xì)胞壁多糖乙?；揎椀萚27]對細(xì)胞壁的功能也起到重要的調(diào)控作用。葉亞峰等[20]發(fā)現(xiàn)OsMYB103L是MYB 家族轉(zhuǎn)錄因子, C端具有較高的轉(zhuǎn)錄活性, 可直接與OsCesA4、OsCesA7、OsCesA9以及bc1啟動子區(qū)域結(jié)合調(diào)控他們的表達(dá), 此外,OsMYB103L還參與GA 介導(dǎo)的纖維素合成途徑的調(diào)控。周奕華等發(fā)現(xiàn)水稻BS1蛋白為木聚糖乙酰酯酶[28], 可從木糖吡喃糖基殘基的O-2和O-3 位置的木聚糖骨架上切割乙酰基部分。在維持木聚糖主鏈上適當(dāng)?shù)囊阴；街衅鹬匾饔?參與次生細(xì)胞壁的形態(tài)建成, 這表明水稻次生細(xì)胞壁的生物合成過程非常復(fù)雜。本研究將bc17定位在7 號染色體分子標(biāo)記UP-81 和DN-25 之間, 沒有發(fā)現(xiàn)相關(guān)報道的其他脆稈基因。在bc17定位區(qū)間預(yù)測有功能的基因涉及到氨基轉(zhuǎn)移酶、O-甲基轉(zhuǎn)移酶、硫酯酶等, 都有可能影響到細(xì)胞壁組分的改變, 而這些基因目前還沒有相關(guān)研究報道, 可能會為次生細(xì)胞壁合成的機制解析發(fā)現(xiàn)一條新的調(diào)控途徑。

農(nóng)作物傳統(tǒng)秸稈處理如棄置農(nóng)田或者直接焚燒, 由于自然狀態(tài)下降解速率緩慢, 容易造成環(huán)境污染和資源浪費[29]。水稻脆稈突變體, 由于其獨特的細(xì)胞壁組成和結(jié)構(gòu)的變化, 收獲時秸稈易破碎降解, 有利于水稻秸稈的生態(tài)還田[30]。同時, 還可以將脆性材料直接作為家畜飼料, 較低的纖維素含量更有利于反芻動物消化, 具有良好的飼料應(yīng)用前景[31]。水稻秸稈是可再生的生物質(zhì)原料, 可以經(jīng)過水解發(fā)酵產(chǎn)生生物乙醇[32-33]。黃峰等利用水稻脆性秸稈為原料, 利用酸預(yù)處理且酶促糖化發(fā)酵72 h 后,脆性秸稈發(fā)酵的乙醇產(chǎn)量可達(dá)為普通秸稈的1.1 倍[34]。bc17突變體細(xì)胞壁纖維素含量降低, 半纖維素含量升高, 有望通過優(yōu)異等位基因的發(fā)掘, 應(yīng)用到生產(chǎn)中, 從秸稈飼料化和能源化角度解決秸稈利用的難題。

4 結(jié)論

利用重離子輻照武運粳7 號(wyj7)獲得一個脆稈突變體bc17, 在抽穗后莖稈出現(xiàn)脆性特征, 且隨著生育期進程脆稈脆性程度增加, 葉片基本表現(xiàn)正常。較野生型,bc17葉片和莖稈纖維素含量顯著降低,半纖維素含量顯著升高, 厚壁組織變薄, 細(xì)胞之間空隙變大, 相應(yīng)地細(xì)胞密度降低, 細(xì)胞數(shù)目減少。該性狀受一對隱性核基因控制, 被定為在7 號染色體長臂上162 kb 區(qū)間內(nèi), 生物信息學(xué)分析表明bc17可能是一個新的脆稈基因, 為進一步揭示水稻細(xì)胞壁合成機制奠定材料基礎(chǔ)。