水稻矮化寬葉突變體osdwl1 的生理特性和基因定位

黃 妍 賀煥煥 謝之耀 李丹瑩 趙超越 吳 鑫黃福燈 程方民 潘 剛,*

1 浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院, 浙江杭州310058; 2 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物與核技術(shù)利用研究所, 浙江杭州310021

水稻是我國最重要的糧食作物之一, 對保障我國糧食安全起重要作用。然而, 隨著我國人口數(shù)量的持續(xù)增長、可耕種面積的逐年減少, 糧食安全形勢日益嚴(yán)峻[1-2]。因此, 培育高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)水稻新品種依舊是水稻育種工作者的重要目標(biāo)之一[3]。株高是水稻重要農(nóng)藝性狀之一, 直接影響水稻生物學(xué)產(chǎn)量,與水稻的抗倒伏及抗病蟲能力線性相關(guān), 最終影響水稻的豐產(chǎn)性和穩(wěn)產(chǎn)性[4-5]。傳統(tǒng)水稻品種一般表現(xiàn)為高稈, 矮稈則是突變性狀[4-5]。遺傳學(xué)研究顯示,矮稈性狀受主效基因或多個微效基因控制, 同時受內(nèi)源激素及外源光溫水氣肥的影響[4-6]。利用正向或反向遺傳學(xué)手段, 迄今已克隆調(diào)控水稻株高的基因超過70 個, 這些基因多數(shù)與赤霉素、油菜素內(nèi)酯、獨(dú)腳金內(nèi)酯、生長素等激素生物合成代謝或信號傳導(dǎo)有關(guān)[4-5]。研究表明, 現(xiàn)已克隆的多數(shù)矮稈或半矮稈基因表現(xiàn)出“一因多效”的遺傳效應(yīng), 即引起水稻植株矮化的同時其他農(nóng)藝性狀也發(fā)生改變, 如d3[7]、d10[8]、d14[9]、fc1[10]和htd1[11]具多分蘗特征;sgd2[12]和SRS5[13]與籽粒大小有關(guān); 而DNL1[14]則表現(xiàn)為窄葉;dlt[15]則引起少蘗寬葉。

當(dāng)然, 葉片是水稻進(jìn)行光合作用的主要場所,是最重要的源器官, 其形態(tài)直接影響植株形態(tài)并最終關(guān)系到稻谷產(chǎn)量與品質(zhì)。而葉片的長、寬、面積、厚、傾角、披垂度、卷曲度等是界定葉形態(tài)及空間姿態(tài)的重要因素[16], 因此增加葉寬將影響有效光合葉面積, 從而影響單個葉片的光合產(chǎn)物。研究認(rèn)為, 葉片是沿基-頂軸、近-遠(yuǎn)軸以及中-邊軸3 個軸向生長發(fā)育, 其中中-邊軸調(diào)控葉寬[17]。因此, 可以利用窄葉或?qū)捜~突變體研究水稻葉寬調(diào)控分子機(jī)理, 迄今已克隆諸如NAL1[18]和DNL3[19]等窄葉基因, 但有關(guān)寬葉突變體卻僅有Wl[20]和dlt[15]等少量報道。

本課題組前期利用60Co 輻射誘變中秈恢復(fù)系自選1 號, 獲得一個矮化寬葉突變體, 暫名為osdwl1(Oryza sativadwarf and wider-leaf 1,osdwl1)。該突變體在苗期(約3～4 片期)就表現(xiàn)為寬葉, 且除上部一片完整展開葉及心葉外, 其他葉片的中上部均表現(xiàn)為黃葉。之后隨著葉齡的增加, 除葉片形態(tài)發(fā)生變化外, 植株還明顯矮化。本文對突變體osdwl1的基本表型、生理細(xì)胞變化及基因定位等方面進(jìn)行了研究, 為進(jìn)一步克隆該基因并揭示其矮化寬葉的分子細(xì)胞生理機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

矮化寬葉突變體osdwl1來源于秈稻恢復(fù)系自選1 號(來源于湖北省恩施市農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所)的60Co 輻射誘變后代, 經(jīng)杭州和海南連續(xù)多代回交和自交, 突變性狀已穩(wěn)定遺傳。之后利用突變體osdwl1分別與原始對照自選1 號、秈稻恢復(fù)系93-11以及常規(guī)粳稻02428 雜交, 獲得osdwl1/自選1 號、osdwl1/93-11 和osdwl1/02428 三個F1并自交獲得相應(yīng)F2群體, 用于突變性狀的遺傳分析和基因定位。所有材料均種植于浙江大學(xué)紫金港農(nóng)業(yè)試驗站, 常規(guī)肥水管理。水稻幼苗期和抽穗開花期, 分別調(diào)查20 個單株的幼葉和劍葉寬度。水稻成熟后, 隨機(jī)選取osdwl1及自選1 號各20 株, 考查其株高、莖節(jié)長、穗長、有效穗數(shù)、每穗粒數(shù)、結(jié)實率和千粒重等主要農(nóng)藝性狀。

1.2 生理指標(biāo)測定

隨機(jī)選取osdwl1及自選1 號處于孕穗期(劍葉葉枕與倒二葉葉枕重合的分蘗)的劍葉、倒二葉和倒三葉的上部葉片, 根據(jù)Gong 等[21]的方法分別測定葉綠素、可溶性蛋白、H2O2、O2-和MDA 含量、以及CAT 和SOD 酶活。同時, 利用Li-6400XT 光合儀以及PAM-2000 葉綠素?zé)晒鈨x分別測定劍葉、倒二葉和倒三葉相應(yīng)部位的凈光合速率及Fv/Fm[22-23]。每個生理指標(biāo)測定5 個生物學(xué)重復(fù)。

1.3 葉片及莖節(jié)細(xì)胞學(xué)觀察

取抽穗當(dāng)天osdwl1及自選1 號劍葉的上部邊緣葉片, 用刀片切成1 mm × 2 mm 的樣品, 立即放入預(yù)冷的2.5%戊二醛固定液中并抽真空至樣品完全浸沒, 4℃固定過夜, 根據(jù)Yang 等[24]的方法制片, 于掃描電鏡(Hitachi TM-1000)和透射電鏡(JEM-1230)下分別觀察葉片表皮細(xì)胞和葉肉細(xì)胞顯微結(jié)構(gòu)并拍照。同時, 選取抽穗當(dāng)天osdwl1及自選1 號相同部位劍葉, 將葉片橫剪成2 mm 寬的小片段, 立即放入70% FAA 固定液并抽真空至樣品完全浸沒, 4℃固定3 d, 而后依次進(jìn)行乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、切片以及番紅固綠染色, 最后用1︰1 的二甲苯和中性樹膠封片, 置于42℃恒溫箱處理48 h, 后于NIKON E6000 顯微鏡下觀察并拍照。此外, 根據(jù)曹劍波等[25]的方法, 選取抽穗當(dāng)天osdwl1及自選1 號相同部位倒二節(jié)莖段進(jìn)行樹脂半薄切片, 于倒置顯微鏡(Nikon TE2000-U)下觀察細(xì)胞形態(tài)并照相。

1.4 基因遺傳分析與定位

大田栽培條件下, 首先觀察osdwl1/自選1 號及osdwl1/93-11 的雜種F1的株高及葉片表型, 確定控制osdwl1矮化寬葉的顯隱性; 其次, 根據(jù)osdwl1/自選1 號及osdwl1/93-11 的F2群體中具有野生型表型的單株數(shù)與具有突變體表型的單株數(shù)比例, 確定控制osdwl1矮化寬葉的基因數(shù)。同時, 剪取osdwl1/02428 的F2定位群體中具有突變體性狀和野生型性狀的各10 個單株、以及其親本osdwl1和02428 的葉片, 采用CTAB 法提取基因組總DNA。選取SSR (http://www.gramene.org/)及InDel 分子標(biāo)記, 利用BSA 法進(jìn)行基因定位。

2 結(jié)果與分析

2.1 突變體osdwl1 的表型及主要農(nóng)藝性狀

osdwl1的葉片從苗期(三至四葉期)開始, 除上部1 片完整展開葉及心葉外, 其他葉片在完整展開3～4 d 后, 葉尖開始變黃并逐步擴(kuò)展至葉片中上部(圖1-A～C)。之后隨著葉齡增長,osdwl1植株高度也逐漸矮于野生型對照, 到水稻成熟期(圖 1-D, E),osdwl1株高僅有野生型對照的64.18% (表1)。進(jìn)一步分析植株每一個莖節(jié)長度, 結(jié)果顯示osdwl1倒一節(jié)、倒二節(jié)、倒三節(jié)、倒四節(jié)和倒五節(jié)分別僅有野生型對照的62.86%、75.42%、79.24%、79.93%和77.03% (圖1-E, F)。倒二莖節(jié)縱切面的樹脂半薄切片結(jié)果顯示, 突變體的細(xì)胞長度明顯變短, 但細(xì)胞數(shù)目顯著增加(圖1-G, H)。由于葉片出現(xiàn)黃化癥狀,導(dǎo)致突變體osdwl1的主要農(nóng)藝性狀, 如穗長、每穗粒數(shù)和結(jié)實率分別比野生型對照下降 35.60%、37.35%和42.15%, 而突變體千粒重則極顯著高于對照(表1)。

2.2 突變體osdwl1 葉片表型特征

圖1-C 及圖2-A 顯示突變體osdwl1幼苗期葉片及抽穗開花早期劍葉極顯著寬于對照, 分別增寬16.17%和12.88%。劍葉石蠟切片(圖2-B)結(jié)果顯示,osdwl1與野生型對照之間的大維管束數(shù)無顯著性差異, 但突變體的小維管束數(shù)及小維管束之間距均極顯著增加, 分別增加10.98%和27.95% (圖2-C, D);而且, 與對照相比, 突變體小維管束間的表皮細(xì)胞數(shù)顯著增加(圖2-E), 而其寬度無明顯變化(圖2-F)。同時, 利用SEM 分析突變體劍葉表皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)特征,進(jìn)一步證實突變體小維管束之間的間距極顯著增加(圖2-G), 此外, 與對照相比,osdwl1劍葉下表皮的小刺毛數(shù)也極顯著增加, 達(dá)3384.85% (圖2-G, H);而其上表皮的大刺毛和小刺毛數(shù)則分別增加36.70%和211.08% (圖2-G, I)。

2.3 突變體osdwl1 的生理分析

2.3.1 葉綠素含量及其光合作用效率 圖3-A～D結(jié)果顯示, 孕穗期osdwl1除葉綠素a/b比值(圖3-D)及劍葉葉綠素含量(圖3-A～C)外, 其倒二葉、倒三葉的葉綠素a(圖3-A)、葉綠素b(圖3-B)及葉綠素總含量(圖3-C)依次極顯著下降且極顯著低于野生型對照。與野生型對照相比,osdwl1倒二葉和倒三葉的總?cè)~綠素含量分別下降 13.48%和 26.59%。盡管osdwl1劍葉葉綠素含量無顯著性變化, 但TEM 結(jié)果(圖3-E～H)顯示突變體劍葉葉肉細(xì)胞的部分葉綠體類囊體結(jié)構(gòu)松散(圖3-H), 部分已開始降解(圖3-G),這勢必影響突變體葉片的凈光合速率(圖3-I)及PSII光化學(xué)效率(Fv/Fm) (圖3-J)。結(jié)果顯示, 突變體劍葉、倒二葉和倒三葉的凈光合速率和Fv/Fm明顯低于野生型對照, 凈光合速率分別下降27.22%、28.31%和22.25% (圖3-I), 而其Fv/Fm的變化趨勢與凈光合速率基本一致, 分別下降13.34%、10.78%和20.40%(圖3-J)。含量無顯著性差異, 而osdwl1則依次升高且倒二葉和倒三葉顯著高于劍葉, 分別增加 11.44%和24.72%。為了平衡植物細(xì)胞內(nèi)的活性氧含量, 如H2O2和O2-, 防止其對細(xì)胞造成損傷, 植物細(xì)胞會表達(dá)多種保護(hù)酶, 如SOD 和CAT 等抗氧化酶。因此,進(jìn)一步測定了葉片的CAT (圖4-C)和SOD (圖4-D)酶活。結(jié)果顯示, 野生型劍葉、倒二葉和倒三葉間的SOD 和CAT 酶活無顯著性差異, 而突變體osdwl1則依次極顯著下降。與osdwl1劍葉相比, 其倒二葉和倒三葉的SOD 酶活分別下降8.00%和20.08%,CAT 酶活則分別減少39.84%和51.32%。

表1 突變體及其野生型的主要農(nóng)藝性狀Table 1 Main agronomic traits of osdwl1 and its wild-type plants

2.3.3 MDA和可溶性蛋白含量 圖5顯示, 野生型對照的劍葉、倒二葉和倒三葉間的MDA含量(圖5-A)和可溶性蛋白含量(圖5-B)均無顯著性差異。而osdwl1的劍葉、倒二葉和倒三葉間的MDA含量則依次顯著升高, 除劍葉外, 倒二葉和倒三葉含量顯著高于野生型對照(圖5-A); 與突變體osdwl1劍葉相比,其倒二葉和倒三葉的MDA含量分別增加50.29%和79.87% (圖5-A)。osdwl1的劍葉、倒二葉和倒三葉間的可溶性蛋白含量依次降低且均極顯著低于野生型對照, 尤其是其倒三葉的含量極顯著低于劍葉和倒二葉, 分別下降31.93%和28.53% (圖5-B)。

2.4 遺傳分析與基因定位

osdwl1/自選1 號和osdwl1/93-11 雜交F1植株形態(tài)均正常, 說明突變性狀是由隱性位點控制。而osdwl1/自選1 號的1105 個F2群體中, χ2檢驗正常植株數(shù)(836)與具矮化及寬黃葉的植株數(shù)(269)的分離比 符 合 3 ∶1 [χ2= 0.25 < 3.84 (χ2(0.05,1))]; 而osdwl1/93-11 的612 個F2定位群體中, 正常單株數(shù)(455)與矮化及寬黃葉單株數(shù)(157)的分離比亦符合3∶1 [χ2=0.46 < 3.84 (χ2(0.05,1))]的孟德爾遺傳定律。這些結(jié)果表明osdwl1的矮化及寬黃葉性狀由單隱性核基因控制。

利用osdwl1/02428 的F2群體中具有矮化及寬黃葉性狀的673 個單株作為基因定位群體。為了定位OsDWL1基因, 首先分別提取osdwl1/02428 F2群體中的10 株野生型表型和10 株具有矮化寬葉性狀的單株基因組DNA, 分別等量混合成正?；虺睾屯蛔兓虺?。合成水稻12 條染色體上的500 對SSR標(biāo)記及50 對InDel 標(biāo)記, 逐條對02428 和突變體osdwl1進(jìn)行多態(tài)性分析, 而后選用均勻分布于12 條染色體上的多態(tài)性分子標(biāo)記, 利用BSA 法分析其與OsDWL1基因間的連鎖性關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)水稻6 號染色體短臂上的SSR 標(biāo)記RM7399、RM19288、RM3805 和RM19549 與OsDWL1緊密連鎖。利用這4 個標(biāo)記對osdwl1/02428 的F2群體中的673 個矮化寬葉單株進(jìn)行基因型分析, 發(fā)現(xiàn) RM7399、RM19288、RM3805 和RM19549 的交換單株分別是80、23、19 和121 株, 初步將OsDWL1基因定位在RM19288 和 RM3805 之間。為進(jìn)一步精細(xì)定位OsDWL1基因, 繼續(xù)合成位于RM19288 和RM3805之間的10 對SSR 和InDel 標(biāo)記(附表1), 其中2 對標(biāo)記在02428 和突變體osdwl1間存在多態(tài)性, 利用這2 對標(biāo)記將OsDWL1基因限定在RM19297 與ID269-2 之間, 物理距離約333 kb, 橫跨AP001168、AP002838、AP000391 和AP000559 四個BAC (圖6), 其間有 EST 支持的 ORF 為 37 個(http://rapdb.dna.affrc.go.jp/viewer/gbrowse/irgsp1/) (表2)。

表2 定位區(qū)間內(nèi)的基因及功能注釋Table 2 Gene names and their functional annotations in the target interval

3 討論

株高是影響農(nóng)作物株型、生物量、抗倒性及機(jī)械收割的重要因素[4-5]。研究表明, 植株過高是引起水稻倒伏的最主要原因[4-5]; 而植株過矮, 會造成水稻生長量不足, 故適當(dāng)增加株高, 不僅可以降低葉面積密度(葉面積指數(shù)與株高的比值), 還有利于CO2擴(kuò)散及中下部葉片吸收利用太陽光能, 增加光合速率, 進(jìn)而提高植株生物量[26]。影響水稻株高的因素包括穗長、節(jié)間數(shù)和節(jié)間長度, 除少部分因穗長和節(jié)間數(shù)量發(fā)育缺陷的突變體外, 大多數(shù)矮稈水稻是由于節(jié)間長度變短造成的[4-5]。本研究中osdwl1的節(jié)間長度均極顯著比野生型對照縮短, 導(dǎo)致osdwl1株高顯著低于野生型對照(圖1-E, F), 莖節(jié)的樹脂半薄切片證實節(jié)間縮短的根本原因在于突變體細(xì)胞長度更小(圖1-H)。

植物株高既受諸如光溫水氣肥等外界環(huán)境的影響, 也受植物內(nèi)源激素及基因的調(diào)控, 但歸根結(jié)底受內(nèi)源基因網(wǎng)絡(luò)的精細(xì)調(diào)控[4-6]。大量研究結(jié)果證實,水稻株高一般受1～3對主效基因控制, 但也受微效基因調(diào)控[4-5]。迄今已證實, 調(diào)控株高的基因包括GA代謝途徑的DELLA蛋白基因、參與油菜素內(nèi)酯和獨(dú)腳金內(nèi)酯合成代謝的細(xì)胞色素P450基因與鈣調(diào)蛋白、RNA編輯相關(guān)的PPR (pentatricopeptide repeat)蛋白基因以及核糖體蛋白基因等[4-5]。如水稻編碼PPR蛋白的OGR1基因的功能缺失突變體ogr1表現(xiàn)為矮化及不育等特性[27]; 與油菜素內(nèi)酯合成代謝相關(guān)的水稻P450基因CYP90D2/D2的缺失突變[28]、擬南芥鈣調(diào)蛋白基因DWL1的部分缺失過表達(dá)轉(zhuǎn)基因后代均表現(xiàn)矮化癥狀[29]; 參與GA信號通路的水稻DELLA蛋白基因SLR1的功能缺失也導(dǎo)致水稻矮化[30]; 此外, 擬南芥編碼核糖體蛋白L10基因SAC52的突變可以恢復(fù)acl5-1突變體的矮化癥狀[31]。在本研究的OsDWL1基因的定位區(qū)間內(nèi)(圖6), 已克隆了一個矮化基因, 即LOC_Os06g03710, 該基因DLT/OsGRAS-32編碼一個GRAS蛋白(GAI-RGA-SCR), 其雙堿基缺失突變體d62表現(xiàn)為矮化少蘗、寬葉濃綠等特征[32]。本研究中的osdwl1則表現(xiàn)為矮化少蘗、寬葉黃化(圖1), 因此與d62性狀不完全一樣。進(jìn)一步通過測序分析osdwl1中的DLT基因, 證實其序列與野生型對照一致。而與報道相關(guān)的導(dǎo)致水稻矮化相關(guān)的基因分別為PPR蛋白基因(LOC_Os06g03530和LOC_Os06g03570) 、 細(xì) 胞 色 素P450基 因(LOC_Os06g03930)、鈣調(diào)蛋白基因(LOC_Os06g03676)、以及核糖體蛋白基因(LOC_Os06g03790) (表2)。當(dāng)然,候選基因的最終確定要依賴于這些基因的測序分析及遺傳互補(bǔ)驗證。

大量研究表明, 矮化基因一般具有“一因多效”的特點, 即矮化突變體除植株矮化外, 還伴隨分蘗、葉片和籽粒等組織器官的變化[4-5]。本研究中osdwl1除表現(xiàn)矮化少蘗外, 葉片從苗期開始就表現(xiàn)為黃化寬葉特性(圖1和圖2)。研究表明, 葉片黃化是葉片衰老的重要外在表現(xiàn), 而其內(nèi)在表現(xiàn)則為程序性細(xì)胞死亡(programmed cell death, PCD), 并由此帶來葉綠體降解、蛋白質(zhì)降解、ROS (reactive oxygen species)累積、膜脂過氧化以及光合速率下降等生理生化變化[32]。因此, 葉綠素含量和葉片凈光合速率是衡量葉片衰老的重要生理指標(biāo)[33]。本研究結(jié)果顯示, 突變體osdwl1的倒二葉和倒三葉的總?cè)~綠素含量及其光合速率均極顯著低于其野生型自選1號(圖3), 預(yù)示其葉片已開始衰老(圖1)。伴隨葉片衰老, 突變體葉綠體也開始降解(圖3), 進(jìn)而造成葉綠體中的電子傳遞鏈?zhǔn)艿揭种? 致使H2O2和O2-等ROS急劇增加[34-35](圖4-A, B)。同時, 過量ROS將作用于細(xì)胞膜脂質(zhì), 使其過氧化而產(chǎn)生大量MDA[34-35](圖5-A)。與此同時, 為了清除細(xì)胞內(nèi)的過多ROS并保護(hù)細(xì)胞膜系統(tǒng), 正常植物細(xì)胞會及時啟動屬于可溶性蛋白的抗氧化酶, 如SOD和CAT的表達(dá)[36-37]。其中, SOD是的專一作用酶[36-37], 突變體osdwl1的劍葉、倒二葉和倒三葉的SOD酶活極顯著低于野生型自選1號(圖4-D), 從而導(dǎo)致突變體葉片中的O2-含量顯著增加(圖4-A)。而CAT是作用于H2O2的保護(hù)酶[36-37], 突變體osdwl1的倒二葉和倒三葉之間的CAT酶活顯著低于野生型(圖4-C), 致使其倒二葉和倒三葉中的H2O2顯著增加(圖4-B)。

4 結(jié)論

osdwl1是一個新鑒定到的矮化少蘗、寬葉黃化的突變體, 其寬葉黃化癥狀始于三至四葉期幼苗。與野生型對照相比,osdwl1的劍葉、倒二葉和倒三葉的葉綠素含量極顯著降低, 從而導(dǎo)致其凈光合速率極顯著下降。osdwl1倒二葉和倒三葉CAT、SOD 活性極顯著下降, 降低其清除H2O2的能力, 導(dǎo)致ROS明顯增加并促使細(xì)胞膜脂過氧化, 致使MDA 含量極顯著升高。遺傳分析表明,osdwl1的矮化寬葉性狀由一對隱性核基因控制, 進(jìn)一步利用圖位克隆技術(shù)將OsDWL1定位于6 號染色體短臂的RM19297 與ID269-2 之間, 其間物理距離約333 kb, 這為進(jìn)一步克隆該基因并揭示其矮化寬黃葉分子生理機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

附表1 用于OsDWL1 基因定位的分子標(biāo)記Table S1 Molecular markers used for OsDWL1 gene mapping