棉花GbSTK 基因調(diào)控開(kāi)花和黃萎病抗性的功能研究

崔 靜 王志城 張新雨 柯會(huì)鋒 吳立強(qiáng) 王省芬 張桂寅 馬峙英 張 艷

華北作物改良與調(diào)控國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 / 河北省棉花產(chǎn)業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心 / 河北農(nóng)業(yè)大學(xué), 河北保定 071001

棉花(Gossypiumspp.)是世界上重要的經(jīng)濟(jì)作物,我國(guó)是棉花生產(chǎn)、消費(fèi)、紡織品出口大國(guó), 然而我國(guó)棉花生產(chǎn)面臨黃萎病危害依然嚴(yán)重, 近年來(lái)新疆棉區(qū)發(fā)病面積迅速擴(kuò)大, 危害日益加重, 因此對(duì)抗病品種的需求是生產(chǎn)上解決棉花抗黃萎病的根本。為了提升我國(guó)棉花在國(guó)際市場(chǎng)的競(jìng)爭(zhēng)力, 棉花機(jī)械化的不斷推進(jìn)以促進(jìn)植棉節(jié)本增效, 然而棉花播種覆蓋的地膜成為機(jī)采過(guò)程中的嚴(yán)重白色污染, 造成棉花品質(zhì)大幅下降, 為了從根本上緩解這一矛盾,早熟棉的培育與應(yīng)用顯得尤為重要。因此, 抗病、早熟性研究是棉花要解決的重大生產(chǎn)和科學(xué)問(wèn)題。

早熟性是作物重要的優(yōu)良性狀之一, 棉花的生育期包括營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)(播種到現(xiàn)蕾)和生殖生長(zhǎng)(開(kāi)花到吐絮) 2 個(gè)階段?，F(xiàn)有的棉花資源中發(fā)現(xiàn)早熟品種多抗性差、抗病品種多貪青晚熟; 并且植物本身也存在抗病–發(fā)育的調(diào)節(jié)平衡, 逆境條件下, 多數(shù)植株也會(huì)以暫停或減緩生長(zhǎng)發(fā)育為代價(jià)而抵御逆境。建立抗病與早熟之間的聯(lián)系、打破早熟與抗病的負(fù)相關(guān)、發(fā)掘同時(shí)控制開(kāi)花與抗病的遺傳因子對(duì)培育早熟抗病的品種具有重要意義。

蛋白磷酸化是真核生物中普遍存在的細(xì)胞調(diào)節(jié)機(jī)制[1]。絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(serine/threonine protein kinase, STK)是蛋白磷酸化過(guò)程中一類(lèi)重要的蛋白因子[2], 在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)中起著重要作用[3-4]。目前, STK 在番茄[5-6]、水稻[7-8]、番木瓜[9]、擬南芥[10]、小麥[11-12]、煙草[13]、百合[14]等植物中均有發(fā)現(xiàn), 研究表明STK 參與植物抗病、干旱、光照等多個(gè)信號(hào)傳導(dǎo)途徑。本課題組前期鑒定了一個(gè)棉花絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶基因(GbSTK), 該基因受黃萎病菌和多種信號(hào)分子誘導(dǎo), 轉(zhuǎn)GbSTK基因的擬南芥顯著提高了植株黃萎病抗性, 有趣的是發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因擬南芥與對(duì)照相比, 開(kāi)花期明顯提前, 因此, 本研究進(jìn)一步研究STK基因在棉花抗黃萎病和調(diào)控植株開(kāi)花的功能, 以期為深入揭示棉花STK基因的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

轉(zhuǎn)GbSTK基因擬南芥純合株系[15]、黃萎病不同抗性棉花品種均由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)棉花遺傳育種創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)提供。強(qiáng)致病力黃萎病菌系LX2-1[16]由本實(shí)驗(yàn)室分離保存。EASYspin Plus 植物RNA 提取試劑盒購(gòu)自北京艾德萊生物科技有限公司; PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit 反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real-time)反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自寶生物工程有限公司;2×Phanta Master Mix 購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司; 限制性?xún)?nèi)切酶購(gòu)自賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司; T4 DNA 連接酶購(gòu)自普洛麥格公司;pMD19-T 載體、大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞、質(zhì)粒小提試劑盒、膠回收試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司; Matchmaker Gold Yeast Two-Hybrid System、誘餌表達(dá)載體pGBKT7、Aureobasidin A (AbA)、X-α-Gal 購(gòu)自Clontech 公司; Y2HGold 感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自上海唯地生物技術(shù)有限公司。引物合成和測(cè)序由生工生物工程股份有限公司完成。

1.2 黃萎病菌誘導(dǎo)下不同抗、感棉花品種STK 基因的表達(dá)

采用水培法種植棉花不同抗、感品種, 每2 d 更換1 次Hoagland 營(yíng)養(yǎng)液。待棉苗二葉一心時(shí), 將棉苗輕輕拿出, 將根部浸泡在黃萎病菌孢子懸浮液(1×107spores mL-1)中3 min, 然后再將棉苗小心栽入上口直徑6 cm 的營(yíng)養(yǎng)缽, 并從營(yíng)養(yǎng)缽的底部再次注射10 mL 的黃萎病菌孢子懸浮液, 以保證每棵棉苗成功接菌(附圖1)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的全長(zhǎng)黃萎病菌誘導(dǎo)下cDNA 文庫(kù)中篩選的抗病相關(guān)基因的表達(dá)中發(fā)現(xiàn), 參與防衛(wèi)反應(yīng)的基因一般在抗/耐病品種較感病品種的表達(dá)高峰出現(xiàn)早或表達(dá)水平高, 而前期我們對(duì)棉花STK受黃萎病菌誘導(dǎo)的熒光定量PCR 顯示, 在接菌后8～12 h, 其表達(dá)顯著升高[15],考慮到STK基因主要在參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)方面起作用,其發(fā)揮作用一般在接菌后的早期階段, 因此本研究取接菌后12 h 的根并提取其RNA, 用于研究多個(gè)抗感品種中STK基因的表達(dá)。根據(jù)GbSTK基因序列設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)定量引物STK-F2 和STK-R2 (表1), 片段大小為200 bp 左右。根據(jù)PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real-time)反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。以棉花GhUBQ14[17]為內(nèi)參基因(表 1),qRT-PCR 反應(yīng)體系為10.0 μL, 包含1.0 μL cDNA、5.0 μL 2×SYBR、0.5 μLSTK-F2 primer、0.5 μLSTK-R2 primer、2.8 μL RNase-Free H2O、0.2 μL ROX校正液。反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性30 s; 95℃變性5 s,57℃退火5 s, 72℃延伸34 s, 40 個(gè)循環(huán)。試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù), 采用2–ΔΔCt方法[18]計(jì)算STK基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 棉花中病毒誘導(dǎo)的STK 基因的沉默

根據(jù)GbSTK基因的序列信息, 設(shè)計(jì)病毒誘導(dǎo)的基因沉默載體(VIGS)引物VF/VR (表1), 并克隆目的片段。將目的基因片段和pTRV2 載體分別用SpeI和AscI 進(jìn)行雙酶切, 分別膠回收基因條帶和pTRV2載體, 用T4 連接酶在16℃過(guò)夜連接, 構(gòu)建成沉默載體pTRV2-GbSTK(TRV::GbSTK)。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞, 通過(guò)PCR 檢測(cè)和陽(yáng)性克隆測(cè)序鑒定得到序列正確的克隆。

將構(gòu)建好的pTRV2-GbSTK質(zhì)粒和pTRV1 分別轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101, 保存?zhèn)溆?。種植抗病農(nóng)大棉601, 待棉苗2 片子葉平展但第1 片真葉未長(zhǎng)出時(shí),分別沉默TRV::GbSTK(試驗(yàn)組)、TRV::00(空載體對(duì)照組)和TRV::CLA1(環(huán)境對(duì)照組), 具體操作參照Z(yǔ)hang 等[19]方法。待沉默TRV::CLA1的植株新生葉片出現(xiàn)白化, 說(shuō)明目的基因被有效沉默, 此時(shí), 進(jìn)一步通過(guò)qPCR 確定試驗(yàn)組植株的沉默效率。分別選取沉默效果好、長(zhǎng)勢(shì)整齊一致的植株, 按照Z(yǔ)hang等[20]的方法對(duì)GbSTK沉默植株和對(duì)照植株接種黃萎病菌孢子懸浮液(×107spores mL-1), 在接菌20 d和25 d 后觀察植株發(fā)病情況并計(jì)算病情指數(shù)。

1.4 轉(zhuǎn)STK 基因擬南芥早花性狀的鑒定

分別種植轉(zhuǎn)STK基因擬南芥純合株系和空載體對(duì)照擬南芥, 定期觀察擬南芥的長(zhǎng)勢(shì), 記錄擬南芥蓮座葉的數(shù)目和開(kāi)花時(shí)間。用EASYspin Plus 植物RNA 提取試劑盒提取轉(zhuǎn)基因株系和空載體對(duì)照擬南芥的總 RNA, 以TUB2為內(nèi)參基因(表 1), 利用qRT-PCR 檢測(cè)擬南芥中開(kāi)花相關(guān)標(biāo)志基因FT和SOC1的表達(dá)量, 比較轉(zhuǎn)基因植株和對(duì)照擬南芥開(kāi)花途徑標(biāo)志基因的表達(dá)量。

1.5 STK 酵母雙雜交載體的構(gòu)建與轉(zhuǎn)化

將含有正確GbSTK序列信息的質(zhì)粒和pGBKT7載體分別用NdeI 和PstI 進(jìn)行雙酶切, 膠回收GbSTK基因條帶和pGBKT7 空載體條帶, 借助于T4連接酶在16℃過(guò)夜連接, 將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞。利用pGBKT7 載體的通用引物BD-F/BD-R (表1)檢測(cè)陽(yáng)性克隆, 并對(duì)PCR 陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒DNA 進(jìn)一步測(cè)序驗(yàn)證。挑選測(cè)序正確的克隆, pGBKT7-GbSTK提取質(zhì)粒DNA, 按照說(shuō)明書(shū)轉(zhuǎn)化Y2HGold 感受態(tài)細(xì)胞。

1.6 誘餌蛋白毒性和自激活檢測(cè)

參照Matchmaker Gold Yeast Two-Hybrid System操作手冊(cè), 以共轉(zhuǎn)pGBKT7-53+pGADT7-T 酵母菌作為陽(yáng)性對(duì)照, 共轉(zhuǎn)化pGBKT7-Lam+pGADT7-T 酵母菌作為陰性對(duì)照。將空載體 pGBKT7 和pGBKT7-GbSTK分別轉(zhuǎn)入Y2HGold 酵母菌株中, 涂于SD/-Trp 平板上, 置于30℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)3～5 d,檢測(cè)誘餌載體pGBKT7-GbSTK有無(wú)毒性[21]。

挑取平板上生長(zhǎng)狀態(tài)良好的pGBKT7-GbSTK單克隆, 在 SD/-Trp 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng), 涂布于SD/-Trp、SD/-Trp/X-α-Gal、SD/-Trp/X-α-Gal/AbA 平板上, 置于30℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)3～5 d, 檢測(cè)誘餌載體pGBKT7-GbSTK有無(wú)自激活活性[21]。

參照Clontech 公司酵母雙雜交操作指南, 將攜帶pGBKT7-GbSTK誘餌載體的Y2HGold 與黃萎病菌誘導(dǎo)海島棉酵母雙雜交cDNA 文庫(kù)進(jìn)行雜交, 依次涂布于DDO (SD/-Leu/-Trp)、TDO (SD/-His-/Leu/-Trp or SD/-Ade/-Leu/-Trp)、QDO/X/A (SD/-His-/Ade/-Leu/-Trp/X-α-Gal/AbA)平板上, 置于30℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)3～5 d, 觀察菌落生長(zhǎng)情況和菌落顏色變化。

利用pGADT7 通用載體引物T7/3′AD (表1)對(duì)所篩選到的單克隆進(jìn)行PCR 鑒定, 對(duì)獲得的PCR 陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序, 測(cè)序結(jié)果在Cotton FGD (https://cottonfgd.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST比對(duì), 初步確定互作蛋白的基因及蛋白信息。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同抗性棉花品種中STK 基因的表達(dá)

選取不同抗性棉花品種, 根據(jù)STK在接菌后12 h 出現(xiàn)表達(dá)峰值[15], 對(duì)根中STK基因的表達(dá)檢測(cè)結(jié)果表明,STK基因在不同抗性品種中均有表達(dá), 在感病品種邯208 中表達(dá)量最低, 不同抗性的棉花品種中STK基因表達(dá)量不同程度的明顯高于邯208,其中抗病品種農(nóng)大棉8 號(hào)表達(dá)量最高, 其次是抗病品種農(nóng)大601 (ND601), 在農(nóng)大棉7 號(hào)(NDM7)、農(nóng)大棉10 號(hào)(NDM10)、農(nóng)大棉13 號(hào)(NDM13)、國(guó)欣棉9 號(hào)(GXM9)、寧棉9 號(hào)(NM9)、冀棉169 (JM169)共6 個(gè)耐病品種中的表達(dá)也呈現(xiàn)較高的表達(dá)水平(圖1)。黃萎病菌誘導(dǎo)下,STK基因的表達(dá)水平在抗性好的棉花品種顯著高于感病品種, 說(shuō)明STK基因的轉(zhuǎn)錄水平與棉花抗黃萎病反應(yīng)呈正相關(guān)關(guān)系。

表1 試驗(yàn)中所用引物Table 1 Primers used in the study

2.2 沉默棉花內(nèi)源STK 基因顯著增強(qiáng)了植株感病性

以抗病農(nóng)大601 為材料, 待兩片子葉完全展平且第1 片真葉未長(zhǎng)出時(shí)進(jìn)行VIGS 處理, 以沉默CLA1為可視化對(duì)照。VIGS 處理7 d 后, 注射CLA1的棉苗第1 片真葉出現(xiàn)網(wǎng)格狀的白化現(xiàn)象(圖2-a),說(shuō)明基因被VIGS 體系有效沉默。此時(shí)取沉默棉株及對(duì)照棉株的第1 片真葉提取RNA, qRT-PCR 檢測(cè)結(jié)果表明, 沉默棉株中GbSTK基因的表達(dá)量明顯低于對(duì)照(圖2-b), 說(shuō)明GbSTK在棉株中被沉默。對(duì)沉默棉株及對(duì)照棉株進(jìn)行黃萎病菌脅迫處理。在接菌處理25 d 的病情指數(shù)調(diào)查結(jié)果表明, 沉默棉株比對(duì)照植株表現(xiàn)出明顯的葉片黃化、植株萎蔫的典型黃萎病癥狀(圖2-c), 2 次獨(dú)立的基因沉默試驗(yàn)中對(duì)照棉株的病情指數(shù)分別為25.7 和29.3 (平均27.5), 而沉默STK基因的棉株的病情指數(shù)分別65.3 和61.1 (平均63.2) (圖2-d～e)。表明棉花STK正向調(diào)控了棉花對(duì)黃萎病的抗性。

2.3 GbSTK 促進(jìn)轉(zhuǎn)基因擬南芥提早開(kāi)花

相同生長(zhǎng)條件下, 定期觀察STK基因擬南芥純合株系和空載體對(duì)照擬南芥的長(zhǎng)勢(shì), 記錄擬南芥蓮座葉的數(shù)目和開(kāi)花時(shí)間。結(jié)果顯示, 轉(zhuǎn)基因擬南芥比對(duì)照提早開(kāi)花5～7 d (圖3-a～c)。開(kāi)花時(shí)統(tǒng)計(jì)轉(zhuǎn)基因株系和野生型擬南芥的蓮座葉數(shù)目發(fā)現(xiàn), 轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片數(shù)平均為7.5 片, 明顯少于野生型的蓮座葉片數(shù)(11.9 片) (圖3-d), 表明轉(zhuǎn)GbSTK基因可顯著提早擬南芥的開(kāi)花時(shí)間。進(jìn)一步利用qRT-PCR 檢測(cè)擬南芥開(kāi)花標(biāo)志基因FT、SOC1和LFY基因的表達(dá)量發(fā)現(xiàn), 轉(zhuǎn)基因不同株系中FT和SOC1基因的表達(dá)水平顯著高于對(duì)照植株, 而LFY基因的表達(dá)受影響較小(圖3-e～g), 表明STK基因可以影響開(kāi)花關(guān)鍵基因FT和SOC1的表達(dá)水平, 進(jìn)而在調(diào)控植株開(kāi)花時(shí)間中發(fā)揮作用。

2.4 pGBKT7-GbSTK 毒性和自激活檢測(cè)

利用pGBKT7 載體的通用引物BD-F/BD-R (表1)檢測(cè)獲得誘餌載體陽(yáng)性克隆(圖4-a～c), 提取陽(yáng)性克隆質(zhì)粒DNA 測(cè)序驗(yàn)證, 測(cè)序結(jié)果與預(yù)期結(jié)果大小一致。將空載體對(duì)照pGBKT7 與誘餌載體pGBKT7-GbSTK分別轉(zhuǎn)化Y2HGold 感受態(tài), 涂布于SD/-Trp平板上。在30℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)3～5 d 后發(fā)現(xiàn), 誘餌載體的平板與空載體的平板菌落生長(zhǎng)狀態(tài)基本一致(圖4-d), 表明誘餌載體pGBKT7-GbSTK沒(méi)有毒性。

自激活試驗(yàn)表明, 陽(yáng)性對(duì)照 p G B K T 7-5 3/pGADT7-T 在SD/-Leu/-Trp 平板上可以長(zhǎng)出白色菌落(圖5-a), 在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal 長(zhǎng)出藍(lán)色菌落( 圖 5-b), 陰性對(duì)照 pGBKT7-Lam/pGADT7-T 只能在 SD/-Leu/-Trp 平板上生長(zhǎng),pGBKT7-GbSTK與陰性對(duì)照一致。而且誘餌載體pGBKT7-GbSTK在SD/-Trp/X-α-Gal 上正常生長(zhǎng)且不顯示藍(lán)色, 在SD/-Trp/X-α-Gal/AbA 上不能生長(zhǎng)(圖5-c), 表明pGBKT7-GbSTK沒(méi)有自激活活性。

2.5 pGBKT7-GbSTK 互作蛋白篩選與分析

將攜帶誘餌載體pGBKT7-GbSTK的酵母菌液和黃萎病菌誘導(dǎo)的海島棉Pima90-53 cDNA 文庫(kù)雜交,將菌液依次涂布于DDO、TDO、QDO/X/A 平板上,在30℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)3～5 d, 最終挑選生長(zhǎng)良好的藍(lán)色菌落(圖6: 部分篩選結(jié)果), 進(jìn)行菌落PCR 鑒定, 獲得105 個(gè)陽(yáng)性克隆, 對(duì)105 個(gè)克隆進(jìn)行測(cè)序,序列信息通過(guò)棉花Cotton FGD (https://cottonfgd.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)分析, 篩選到30 個(gè)可能與GbSTK 互作的蛋白(表2)。通過(guò)NCBI 比對(duì), 根據(jù)同源蛋白功能類(lèi)似的特點(diǎn)發(fā)現(xiàn), 這30 個(gè)蛋白可以大體上分為6 類(lèi):第1 類(lèi)包括細(xì)胞色素氧化酶(cytochrome C oxidase)和蘋(píng)果酸脫氫酶(malate dehydrogenase), 它們?cè)赗OS 的產(chǎn)生中具有明確的功能報(bào)道; 第2 類(lèi)主要是參與防衛(wèi)反應(yīng)或應(yīng)對(duì)生物/非生物脅迫的成員; 第3類(lèi)主要為參與此生代謝合成的基因; 第4 類(lèi)蛋白在調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育和脅迫相應(yīng)均具有功能; 第5 類(lèi)蛋白在調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育中有功能報(bào)道; 第6 類(lèi)是目前沒(méi)有明確的功能報(bào)道的一類(lèi)。這些蛋白為深入揭示GbSTK 的蛋白調(diào)控網(wǎng)絡(luò)奠定了基礎(chǔ)。

3 討論

自然條件下, 植物生長(zhǎng)發(fā)育面臨生物和非生物脅迫等復(fù)雜的環(huán)境, 植株為了增強(qiáng)生存能力, 在長(zhǎng)期的植物進(jìn)化過(guò)程中形成了一套成熟的適應(yīng)機(jī)制,即通過(guò)能量和物質(zhì)的重新分配來(lái)有效調(diào)控生長(zhǎng)與發(fā)育的平衡。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為, 植株抗病性與品種早熟性存在此消彼長(zhǎng)的關(guān)系, 認(rèn)為抗病植株易貪青晚熟,早熟性好的品種抗性比較差, 猶如魚(yú)和熊掌不可兼得[47]。隨著人們對(duì)基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的不斷建立和深入,一些突破性研究進(jìn)展正在沖擊人們的傳統(tǒng)認(rèn)識(shí), 正如普遍認(rèn)為植物抗病與產(chǎn)量之間呈現(xiàn)難以打破的負(fù)相關(guān), 最新發(fā)表在Science的研究報(bào)道表明[48], 水稻IPA1基因既能提高水稻產(chǎn)量又能增強(qiáng)對(duì)稻瘟病的抗性, 打破了不可能同時(shí)實(shí)現(xiàn)增產(chǎn)和抗病的傳統(tǒng)觀點(diǎn), 這也為育種家突破傳統(tǒng)認(rèn)識(shí), 將之前多年來(lái)育種上的不可能逐漸變?yōu)榭赡芴峁┝藛l(fā)。本研究發(fā)現(xiàn), 棉花絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶(GbSTK)具有調(diào)節(jié)黃萎病抗性和植株早花的雙重功能, 為從理論上打破抗病性與品種早熟性負(fù)相關(guān)提供了有潛力的基因資源。

本課題組前期基于SSH 文庫(kù)篩選到GbSTK基因, 該基因可以顯著提高擬南芥的黃萎病抗性[15]。本研究在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn), 抗性較好的多個(gè)棉花品種中STK基因表達(dá)水平均不同程度高于感病對(duì)照, VIGS 試驗(yàn)進(jìn)一步證明, 沉默棉花內(nèi)源STK基因顯著降低了植株的抗病性, 表明GbSTK正調(diào)控棉花黃萎病抗性。酵母雙雜交互作蛋白篩選試驗(yàn)初步篩選到30 個(gè)與GbSTK 存在互作關(guān)系的蛋白, 大多數(shù)蛋白的功能尚未報(bào)道。其中, 我們篩選到的S-腺苷甲硫氨酸合成酶(S-adenosylmethionine synthase,SAMS)目前已有研究。SAMS 是植物代謝中的關(guān)鍵酶, 催化甲硫氨酸和 ATP 合成S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine, SAM)[49]。SAM 不僅為DNA、RNA、蛋白質(zhì)提供了甲基, 而且還是多胺、乙烯、生物素等物質(zhì)合成的前體物質(zhì)[50-51]。表明SAMS基因參與植物響應(yīng)生物與非生物脅迫。在擬南芥中,FER 通過(guò)與SAM1 和SAM2 酶相互作用, 抑制了SAM 的合成, 降低了乙烯水平, 從而控制了植物的發(fā)育[52]。大豆在水分和干旱脅迫下,SAMS參與應(yīng)激反應(yīng)調(diào)控, 3 種S-腺苷甲硫氨酸合成酶蛋白在水分和干旱脅迫下表達(dá)分別下降、增加[53]。張悅等[54]研究表明, 剛毛檉柳S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因ThSAMS參與了對(duì)鹽和干旱的脅迫應(yīng)答。董先娟等[55]發(fā)現(xiàn), 鹽、干旱、低溫以及重金屬脅迫均能夠提高AsSAMS1的表達(dá)和SAM 的積累; 茉莉酸甲酯、水楊酸、脫落酸、赤霉素信號(hào)均可誘導(dǎo)白木香愈傷組織中AsSAMS1基因的表達(dá)。本課題組也發(fā)現(xiàn), 陸地棉GhSAMS基因在棉花抗黃萎病反應(yīng)中起著重要作用[35]。本研究基于酵母雙雜交篩選的與 GbSTK 互作的SAMS 蛋白和GhSAMS 蛋白的同源性為99.28%推測(cè)(附圖2), GbSTK 蛋白可能通過(guò)與SAMS 蛋白互作,從而起到抗黃萎病作用, 也為深入研究GbSTK 蛋白的抗病機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

表2 與GbSTK 互作的候選蛋白Table 2 Candidate proteins interacting with GbSTK

FLOWERING LOCUS T(FT)基因在植物中廣泛存在, 作用于多種調(diào)控途徑的下游, 包括CONSTANS(CO)光周期誘導(dǎo)途徑, 是促進(jìn)開(kāi)花的所必需的信號(hào)整合因子[56]。CO 蛋白在長(zhǎng)日光條件下激活FT基因表達(dá), FT 蛋白被運(yùn)送到篩管中, 最終通過(guò)韌皮部運(yùn)輸?shù)角o尖分生組織和FD 蛋白結(jié)合, 共同作用調(diào)控下游花器官相關(guān)基因AP1、SOC1等基因的表達(dá), 從而促進(jìn)擬南芥開(kāi)花[57]。本研究發(fā)現(xiàn), 轉(zhuǎn)GbSTK基因的擬南芥比對(duì)照提早開(kāi)花5～7 d, qRT-PCR 分析擬南芥開(kāi)花關(guān)鍵基因的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn),GbSTK基因可以顯著提高擬南芥FT和SOC1基因的轉(zhuǎn)錄水平, 促使植株提早開(kāi)花, 這也首次揭示了一個(gè)具有抗病功能的棉花基因具有提早植株開(kāi)花的功能。

本研究初步證明了棉花GbSTK基因具有同時(shí)提高抗性和提早開(kāi)花的功能, 并為進(jìn)一步研究該基因的分子機(jī)制提供了初步線(xiàn)索, 深入研究GbSTK基因的功能和分子機(jī)制, 將為抗病早熟育種提供重要理論基礎(chǔ)和實(shí)際應(yīng)用新途徑。

4 結(jié)論

GbSTK基因正向調(diào)控棉花黃萎病抗性, 沉默棉花內(nèi)源STK基因可顯著降低植株抗病性; 超表達(dá)GbSTK可以增強(qiáng)開(kāi)花關(guān)鍵基因FT和SOC1的表達(dá),進(jìn)而調(diào)控植株提早開(kāi)花。酵母雙雜交初步篩選出30個(gè)與GbSTK 互作的候選蛋白, 主要涉及參與ROS合成、生物非生物脅迫、次生代謝、生長(zhǎng)發(fā)育等幾類(lèi)功能蛋白。