過表達(dá)TaJRL53 基因提高了小麥赤霉病抗性

陳同睿 羅艷君 趙潘婷 賈海燕 馬正強(qiáng)

南京農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院 / 作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 / 江蘇省現(xiàn)代作物生產(chǎn)協(xié)同創(chuàng)新中心, 江蘇南京210095

植物在自然界生長過程中不斷受到各種病原物的侵襲。在長期的進(jìn)化過程中, 植物與病原物之間互相適應(yīng)、協(xié)同進(jìn)化。植物通過一系列信號傳遞激發(fā)自身的防御體系, 從而產(chǎn)生抗病反應(yīng), 例如水楊酸、茉莉酸、乙烯、鈣離子等在抗病信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中扮演著至關(guān)重要的作用[1-2]。小麥, 作為世界三大糧食作物之一, 產(chǎn)量僅次于玉米和水稻。在過去的幾十年間, 在小麥種植面積沒有增加的前提下, 截至2017 年全球小麥總產(chǎn)量增長超過50%[3]。然而,它的生長過程受各種病原菌的侵害, 包括銹病、白粉病、赤霉病、紋枯病等。近年來, 隨著全球氣候變化、小麥耕作制度及農(nóng)業(yè)生產(chǎn)技術(shù)變化的影響,小麥赤霉病的發(fā)生頻率越來越高, 病害發(fā)生的面積逐漸增加。在我國, 赤霉病主要發(fā)生在長江中下游麥區(qū)、華南冬麥區(qū)和川滇冬麥區(qū)等。小麥赤霉病的發(fā)生不僅僅降低小麥的產(chǎn)量和品質(zhì), 更為嚴(yán)重的是感赤霉病的籽粒含有赤霉菌分泌的多種毒素如脫氧雪腐鐮刀菌烯醇, 嚴(yán)重影響人畜健康[4-5]。鑒于赤霉病對小麥生產(chǎn)和糧食安全造成的嚴(yán)重威脅, 該病害引起了人們越來越多的關(guān)注。

凝集素是一類廣泛存在于生物體內(nèi)的糖蛋白或糖特異結(jié)合蛋白, 與機(jī)體的多種生理功能密切相關(guān)[6]。植物凝集素按照同源性、種屬來源及進(jìn)化關(guān)系的差異可分為12 個不同家族[7-8], Jacalin-related lectins (JRLs)是植物凝集素超家族中的一個新家族,因被發(fā)現(xiàn)于木菠蘿而被命名[9]。根據(jù)其糖結(jié)合特性被劃分為半乳糖特異性JRL (gJRLs)和甘露糖或葡萄糖特異性JRL (mJRLs), 前者是桑科植物特異的, 主要儲存于液泡中[10]; 后者廣泛分布于單子葉植物、雙子葉植物、蘇鐵植物和蕨類植物, 大多數(shù)定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中。JRLs 蛋白結(jié)構(gòu)具有多樣性, 可包含一個或多個Jacalin 結(jié)構(gòu)域[8,11], 也可與其他結(jié)構(gòu)域嵌合。其中與疾病響應(yīng)元件Dirigent 嵌合的JRL是單子葉植物特有的類型, 在單子葉植物中廣泛存在, 又稱為單子葉嵌合凝集素[12]。

迄今為止, 在植物中已有功能研究報(bào)道的JRLs超過26 個[13], 它們大多數(shù)都與抗病、抗逆及脅迫壓力的響應(yīng)相關(guān), 但是它們抗病/逆的機(jī)制卻各不相同。比如, 從紅蕓豆中提取的一種同源二聚凝集素,通過其自身的有毒肽對真菌Fusarium oxysporum、Coprinus comatus和Rhizoctonia solani的生長產(chǎn)生抑制作用[14]。LecRK-V.5 通過負(fù)調(diào)控?cái)M南芥的氣孔免疫, 從而對丁香假單胞菌和胡蘿卜軟腐菌的生長產(chǎn)生影響[15-16]。JAX1介導(dǎo)的免疫抗性不同于其他病毒抗性機(jī)制, 它獨(dú)立于傳統(tǒng)抗性(R)蛋白介導(dǎo)的抗性和植物防御激素信號傳導(dǎo)[17-18]。辣椒中的甘露糖結(jié)合凝集素基因CaMBL1 通過識別高甘露糖型N-聚糖調(diào)控PCD, 進(jìn)而對微生物病原體的防御反應(yīng)[19]。凝集素受體激酶ERK1 在LysM 區(qū)域抗真菌MAMP 信號感知中發(fā)揮重要作用[20-21]。RTM1 通過與自身或RTM3 相互作用來限制植物病毒的長距離移動[22-24]。PYK10 通過與不同的JRLs (JAL31 和JAL23)互作,控制PYK10 聚合物的尺寸, 從而在防御反應(yīng)中發(fā)揮作用[25]。OsJAC1 具有對多種病原菌的廣譜抗性, 這種抗性是由自身的Jacalin 和Dirigent 兩個結(jié)構(gòu)域相互作用提供[26],OsMBL1可增強(qiáng)對稻瘟病菌的抗性,其抗性的產(chǎn)生是由于與稻瘟病基因MoChi1競爭幾丁質(zhì), 從而觸發(fā)水稻細(xì)胞中的ROS 反應(yīng), 并且通過積極調(diào)控SA 和ABA 響應(yīng)基因, 進(jìn)而通過參與PTI途徑防御稻瘟病菌的侵染[27];LEM2參與了大麥系統(tǒng)獲得性抗性[20]。

在小麥中, 目前為止僅有以下4 個JRL 基因被克隆并進(jìn)行了功能及機(jī)制方面的探索:TaJRLL1與小麥白粉菌和赤霉菌抗性有關(guān), 被認(rèn)為是水楊酸和茉莉酸植物防御信號機(jī)制的組成部分[28];TaWC1-1基因響應(yīng)白粉菌的侵染[29],TaHfr-1對黑森麥稈蟲幼蟲的發(fā)育有抑制作用[30];TaJA1是OsJAC1在小麥中的同源基因, 過量表達(dá)該基因可提高煙草對多種病害的抗性[31]。此外, 也有研究者在大麥、水稻、高粱、小麥和一些草屬的NBS-LRR 區(qū)域發(fā)現(xiàn)了整合的Jacalin 結(jié)構(gòu)域, 這類整合結(jié)構(gòu)域, 有些可以誘捕入侵的病原體, 啟動相應(yīng)的防御響應(yīng)[32-33]。我們前期研究從小麥基因組中鑒定獲得了67 個JRL 基因, 其中TaJRL53是一個單拷貝基因, 位于小麥4A 染色體長臂上, 屬于與Dirigent 結(jié)構(gòu)域嵌合的mJRLs, 通過電子表達(dá)及RT-PCR 檢測到TaJRL53可對赤霉菌的侵染產(chǎn)生響應(yīng), 并在MeJA 和SA 激素處理后上調(diào)表達(dá)[6]。本研究擬通過VIGS 技術(shù)和基因槍介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)進(jìn)一步探究TaJRL53的生物學(xué)功能以及抗性機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 植物材料

普通小麥中國春和望水白用于該基因的克隆,地方品種望水白用于基因的組織特異性表達(dá)分析;中抗赤霉病材料SSD006 用于VIGS 實(shí)驗(yàn); 感赤霉病材料Bobwhite 和PH691 用于穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化。組織特異性表達(dá)分析的材料: 取望水白正常生長季節(jié)苗期根、莖、葉和開花后5 d 的根、莖、葉、穗于液氮凍存。轉(zhuǎn)基因植株中TaJRL53的表達(dá)所用的材料: T0代轉(zhuǎn)基因植株成株期的葉片。亞細(xì)胞定位材料用新鮮的洋蔥。

1.2 基因的克隆

參照文獻(xiàn)[31]獲得的TaJRL53基因序列設(shè)計(jì)特異引物(F 引物: 5'-ATGGCCACAACCACCG-3'; R 引物: 5'-GATGGTATAAACACCAATCGAAG-3'), 從中國春的cDNA 中擴(kuò)增TaJRL53的開放讀碼框。

1.3 總RNA 的提取、cDNA 的合成、半定量PCR和實(shí)時(shí)定量PCR

利用TRIzol 試劑(Invotrogen, Carlsbad, CA)按照操作說明提取總 RNA, 所有的 RNA 材料均用DNaseI (Fermentas, Canada)消化以確保完全去除DNA 污染。隨后用M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶(Promega, USA)按照操作說明合成cDNA。

半定量RT-PCR擴(kuò)增體系為25 μL, 反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性3 min, 94℃變性30 s, 退火30 s (退火溫度視具體引物而定), 72oC延伸(延伸時(shí)間視擴(kuò)增片段長度而定), 25～30 個循環(huán)(因基因的表達(dá)豐度不同而異), 最后72oC延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物在2%的瓊脂糖凝膠中電泳檢測。以小麥組成型表達(dá)基因TaActin作為內(nèi)參。

參照THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix (Toyoba,Japan)使用說明, 實(shí)時(shí)定量 RT-PCR 反應(yīng)體系為20 μL, 包括約5 ng 模板、10 μL SYBR-Green PCR Mastermix (Toyoba, Japan)和各8 pmol 的正反向引物。以TaActin作為參照, 每個目標(biāo)基因3 個重復(fù), 相對表達(dá)量2?ΔΔCT方法計(jì)算[32], 用StepOnePlus Realtime PCR Systems (Applied Biosystems)進(jìn)行反應(yīng)。按[33]中所用引物對信號通路中的標(biāo)志基因的表達(dá)進(jìn)行檢測, 檢測TaJRL53表達(dá)的正向引物為5'-GTTGC CAAAACGCACGGTA-3', 反向引物為5'-CCCAGTC ATTATCTGCTTCATCCTC-3'。

1.4 載體構(gòu)建

1.4.1 瞬時(shí)表達(dá)載體的構(gòu)建 用KOD FX DNA聚合酶從望水白穗部cDNA 中擴(kuò)增TaJRL53的編碼區(qū)(不含終止子), 正向引物為5'-CTAGTCTAGA AT GGCCACAACCAC-3' (下畫線表示XbaI 酶切位點(diǎn)),反向引物為5'-CGCGGATCC GATGGTATAAACA-3'(下畫線表示BamHI 酶切位點(diǎn))。擴(kuò)增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上電泳分離檢測后, 用DNA 凝膠回收試劑盒回收, 將回收到的擴(kuò)增產(chǎn)物用XbaI 和BamHI 酶切, 回收定量后與經(jīng)過XbaI 和BamHI 酶切過的pEGFP 表達(dá)載體按3∶1 摩爾比混合, 在4°C 條件下用T4-DNA 連接酶(Promega, USA)連接過夜, 連接產(chǎn)物用熱擊法轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α。陽性克隆送上海華大公司測序驗(yàn)證。

1.4.2 BSMV 沉默載體的構(gòu)建 本實(shí)驗(yàn)室內(nèi)野生型BSMV ND18 α、β 及γ 載體引自美國堪薩斯州立大學(xué)Scofield 實(shí)驗(yàn)室。利用DNA 聚合酶從中國春的cDNA中擴(kuò)增TaJRL53, 上游引物 5'-CCCGTTAATTAA GCCACAACCACCGAAGAACC-3' (下畫線表示PacI 酶切位點(diǎn)), 下游引物為5'-TATAGCGGCCGC CAG CACCGTCATAGACACCCC-3' (下畫線表示NotI 的酶切位點(diǎn)), 將PCR 產(chǎn)物和野生型BSMV ND18 γ 用PacI 和NotI (Promega, USA)雙酶切, 將載體去磷酸化, 分別回收酶切后的PCR 產(chǎn)物和質(zhì)粒, 并按3∶1的摩爾比混合, 在4°C 條件下用T4-DNA 連接酶(Promega, USA)連接過夜。用熱擊轉(zhuǎn)化法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α。挑取陽性克隆送上海華大基因科技股份有限公司測序, 測序結(jié)果正確,獲得可用于VIGS 轉(zhuǎn)化的載體。

1.4.3 穩(wěn)定表達(dá)載體的構(gòu)建 用TaJRL53的特異引物從中國春的cDNA 中擴(kuò)增TaJRL53的開放讀碼框, 正向引物為5'-TACGCTGCAG ATGGCCACAAC CACCG-3', 反向引物為5'-ATGCCTGCAG GATGGTA TAAACACCAATCGAAG-3' (下畫線為PstI 的酶切位點(diǎn))。將擴(kuò)增片段插入到中間載體pUT (pTA2-Ubi-Ter)中構(gòu)建Ubi驅(qū)動的表達(dá)盒, 然后將Ubi::TaJRL53-Ter表達(dá)盒用HindIII 切下, 再插入到表達(dá)載體pUCBS 中, 構(gòu)成用于基因槍轉(zhuǎn)化的TaJRL53穩(wěn)定表達(dá)載體(圖1)。

1.5 亞細(xì)胞定位

剝?nèi)バ迈r洋蔥最外的兩層鱗莖, 用尖嘴鑷子小心撕取完好鱗莖的內(nèi)表皮, 平鋪于1/2 MS 固體培養(yǎng)基上, 注意要將內(nèi)表面朝上, 且要平鋪于培養(yǎng)皿中心位置。蓋上培養(yǎng)皿, 黑暗中 25oC 恒溫預(yù)培養(yǎng)2～4 h。參照文獻(xiàn)[34]進(jìn)行質(zhì)粒包裹和基因槍轟擊。將洋蔥表皮細(xì)胞置于 25°C 恒溫培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)16～18 h, 在激光共聚焦顯微鏡下觀察熒光并照相記錄。

1.6 VIGS

1.6.1 體外轉(zhuǎn)錄物的合成 提取野生型 BSMV ND18 α、β、γ 及BSMV:TaJRL53的質(zhì)粒, 分別用MluI 線性化BSMV ND18 α、γ 及BSMV:TaJRL53質(zhì)粒DNA,SpeI 線性化BSMV ND18 β 質(zhì)粒DNA,用1%的凝膠電泳檢測線性化水平。待線性化完全后用酚、氯仿抽提、純化, 用RNase-free 水溶解, 調(diào)整濃度為0.2～1.0 μg μL–1。以抽提純化的質(zhì)粒為模板,用 T7-DNA 依賴的 RNA 聚合酶(mMessage mMachine T7 Kit; Ambion) 進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用1% RNA-free 的凝膠電泳跑膠, EB 染色后在紫外燈下拍照檢測RNA 質(zhì)量。

野生型BSMV ND18 α、β 及γ 為模板的體外轉(zhuǎn)錄物與FES 按1∶1∶1∶25 的比例混合為空BMSV病毒對照, 同樣以野生型 BSMV ND18 α、β 及BSMV:TaJRL53為模板的體外轉(zhuǎn)錄物與FES 也按1∶1∶1∶25 的比例混合, 取8 μL 上述兩種混合液均勻液涂于穗部, 同時(shí)單獨(dú)涂抹FES 緩沖液做空白對照。

1.6.2 體外涂抹 在抽穗期選取長勢良好且大小一致的穗子, 分別涂抹FES 緩沖液、FES 緩沖液和BSMV 病毒混合液, FES 緩沖液和BSMV:TaJRL53病毒混合液, 以只涂抹FES 緩沖液和涂抹FES 緩沖液、BSMV 病毒混合液的植株作為對照組, 涂抹FES緩沖液和BSMV:TaJRL53病毒混合液的植株作為實(shí)驗(yàn)組, 每種病毒混合液至少接種10 株, 3 次重復(fù)。

1.7 小麥的遺傳轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株的檢測

取開花后14 d 左右的小麥種子脫粒。在無菌條件下將脫粒的種子置于滅菌小罐中, 用70%乙醇浸泡5 min, 無菌水沖洗2～3 次; 2%的NaClO 浸泡8 min, 無菌水沖洗3～4 次。于2 mg L–12,4-D 的MS培養(yǎng)基上, 25℃暗培養(yǎng)3～5 d 后, 幼胚經(jīng)過脫分化形成愈傷組織。參照文獻(xiàn)[34]的方法基因槍轟擊, 轟擊后的小麥愈傷繼續(xù)在25oC 黑暗培養(yǎng)箱培養(yǎng)16～18 h,然后轉(zhuǎn)移至誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行暗培養(yǎng)14 d。將愈傷組織轉(zhuǎn)移到1 mg L–1KT 和20 mg L–1篩選劑G418的分化篩選培養(yǎng)基上, 在25oC、12 h 光照條件下培養(yǎng), 待愈傷分化出綠點(diǎn)后進(jìn)行繼代培養(yǎng), 篩選4 周后將綠苗進(jìn)行生根培養(yǎng), 2 周后移栽到土壤中。

采用SDS 法提取受體材料和小麥再生植株的DNA[35], DNA 稀釋后跑電泳檢測質(zhì)量和濃度, 用Ubiquitin 的正向引物 5'-ATCTCCCCCAAATCC ACCCG-3'和TaJRL53基因的反向引物5'-ATGCCTG CAGGATGGTATAAACACCAATCGAAG-3' 進(jìn) 行PCR 檢測, 同時(shí)以含有TaJRL53ORF 的載體質(zhì)粒為陽性對照, 未轉(zhuǎn)化的野生型植株DNA 為非轉(zhuǎn)基因?qū)φ? 水為空白對照。PCR 總體積為25 μL, 包含模板、正反引物、r-TaqDNA 聚合酶和10×PCR 緩沖液。PCR 程序包括: 94oC 預(yù)變性5 min, 94oC 變性40 s, 60oC 退火30 s, 72oC 延伸2 min, 36 個循環(huán), 最后72oC 延伸5 min。PCR 產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠電泳分離檢測, 用EB 染色后在紫外燈下觀察結(jié)果并照相。

1.8 赤霉病抗性鑒定

1.8.1 小麥葉片的赤霉病抗性鑒定 取T1代轉(zhuǎn)基因株系返青至拔節(jié)期的小麥葉片接種赤霉菌孢子液, 孢子液為F15、F609、F7136 及F. grminearumtri5-GFP 菌株的分生孢子混合液, 接種時(shí)在葉片表面用槍頭輕輕劃傷, 懸空放置在培養(yǎng)基中間, 然后接種6 μL 濃度為1×106個 mL–1赤霉菌分生孢子的菌液。接種36 h 后觀察赤霉菌菌絲的侵染情況。實(shí)驗(yàn)設(shè)置3 個重復(fù), 每個重復(fù)中各接種5 個葉片, 差異顯著性用t-test 進(jìn)行檢驗(yàn)。

1.8.2 小麥穗部的赤霉病抗性鑒定 采用單花滴注法對實(shí)驗(yàn)組和對照組長勢一致的穗子接種赤霉菌,具體方法參照文獻(xiàn)[36], 每個處理至少接種15 個穗子, 接種后7 d 和14 d 調(diào)查并記錄病小穗數(shù)和病軸長, 每個轉(zhuǎn)基因株系至少接種10 個穗子, 差異顯著性用t-test 進(jìn)行檢驗(yàn)。21 d 時(shí)對接種的穗子進(jìn)行拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 TaJRL53 的克隆和組織表達(dá)特異性

利用TaJRL53特異引物從普通小麥中國春穗部cDNA 中克隆獲得了1056 bp 的全長序列,該序列與抗赤霉病種質(zhì)望水白中的序列信息一致, 說明該基因序列在抗感材料中沒有差異。對TaJRL53基因在苗期和開花期各組織中的表達(dá)進(jìn)行分析, 以TaActin作為參照, 結(jié)果如圖2 所示, 苗期主要在莖和葉片中表達(dá)(圖2-A), 開花期的根莖葉穗4 個組織中, 穗部表達(dá)量最高(圖2-B)。

2.2 TaJRL53 的亞細(xì)胞定位

為了研究TaJRL53蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)部位,以PMD19-EGFP (35S::GFP)作為對照, 將TaJRL53的GFP 瞬時(shí)表達(dá)載體(35S::TaJRL53-GFP)轉(zhuǎn)入洋蔥表皮細(xì)胞后, 在激光共聚焦顯微鏡下觀察,TaJRL53與GFP 均在整個細(xì)胞中發(fā)出綠色熒光, 尤其在細(xì)胞核上的熒光更為明顯, 表明TaJRL53 分布于細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核上(圖3), 是一個核-質(zhì)蛋白, 與mJRLs 的亞細(xì)胞定位特點(diǎn)一致。

2.3 VIGS 介導(dǎo)TaJRL53 沉默后降低了植株赤霉病的抗性

接種 10 d 后, 涂抹 BSMV 病毒和 BSMV:TaJRL53病毒的麥穗出現(xiàn)病毒侵染后的表型。采用RT-PCR 法檢測TaJRL53在籽粒中的表達(dá)水平, 與接種FES 緩沖液和BSMV 病毒的對照植株相比, 接種BSMV:TaJRL53病毒的植株中的TaJRL53的表達(dá)量顯著降低, 表明TaJRL53的表達(dá)被成功抑制(圖4-A)。各挑選長勢一致的15 個植株用單花滴注法接種赤霉菌。接種3 d 后, 所有接種小穗可見明顯的接種點(diǎn)。第7 d, 涂抹BSMV:TaJRL53病毒的植株, 其接種小穗上的赤霉菌由接種點(diǎn)擴(kuò)展到鄰近小穗, 穗軸呈褐色。至接種15 d, 只涂抹FES 緩沖液、涂抹FES 緩沖液和BSMV 空載病毒混合液及FES 緩沖液和BSMV:TaJRL53病毒混合液的植株病小穗數(shù)的平均值分別為1.3 個、1.3 個、2.4 個(圖4-B), 差異達(dá)顯著水平(P< 0.05); 病軸長分別為0.2、0.3、1.3 cm(圖4-C), 差異達(dá)極顯著水平。接種21 d 后, 涂抹FES緩沖液、FES 緩沖液和BSMV 病毒的混合液及FES緩沖液和BSMV:TaJRL53病毒混合液的植株病小穗數(shù)和病軸長差異最為顯著(圖4-D), 平均病小穗數(shù)分別為1.6 個、1.5 個和4.6 個(圖4-B); 平均病軸長分別為0.3、0.3 和2.1 cm (圖4-C)。

綜上所述, VIGS 介導(dǎo)中抗赤霉病小麥SSD006中的TaJRL53沉默后, 小麥植株對赤霉病的抗性明顯降低, 認(rèn)為TaJRL53對小麥赤霉病抗性有重要影響。

2.4 小麥穩(wěn)定轉(zhuǎn)化及陽性植株的基因型和表型鑒定

采用基因槍法將TaJRL53過量表達(dá)載體導(dǎo)入到感赤霉病小麥品種Bobwhite 和PH691 中, 經(jīng)愈傷誘導(dǎo)和連續(xù)的G418 篩選后, 對T0代抗性植株進(jìn)行分子檢測, 結(jié)果共獲得6 株以Bobwhite 為受體的轉(zhuǎn)基因植株, 1 株以PH691 為受體的轉(zhuǎn)基因植株(圖5-A)。利用RT-PCR 分析TaJRL53在各轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)水平, 結(jié)果表明7 個轉(zhuǎn)基因植株的表達(dá)都明顯高于受體, 以Bobwhite 為受體的轉(zhuǎn)基因植株中編號為1 和2 的轉(zhuǎn)基因植株表達(dá)量最高, 6 最低, 以PH691 為受體的轉(zhuǎn)基因植株7 中的表達(dá)水平低于以Bobwhite 為受體的1～5 號植株), 略高于6 號植株(圖5-B)。

為探究TaJRL53過量表達(dá)植株對赤霉病的抗性,取純合轉(zhuǎn)基因T1代株系六葉一心期的葉片在離體條件下接種含GFP 基因的赤霉菌, 36 h 后在熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn), 非轉(zhuǎn)基因?qū)φ誃obwhite 與以其為受體的轉(zhuǎn)基因植株葉片均能觀察到綠色熒光, 但轉(zhuǎn)基因植株葉片上的熒光與對照相比明顯弱(圖6-A)。與對照菌絲完全遮蓋接種點(diǎn)相比, 轉(zhuǎn)基因株系僅能看見接種點(diǎn), 其中Bobwhite 為受體的1、2 和4 號株系病斑面積顯著減小, 差異在P<0.01 水平顯著; 編號為3和5 的株系病斑面積在P<0.05 水平顯著(圖6-B)。陰性對照PH691 和以其為受體的7 號轉(zhuǎn)基因植株在接菌之后菌絲均沿接種點(diǎn)向四周擴(kuò)散, 但轉(zhuǎn)基因植株菌絲擴(kuò)散程度與對照相比較輕, 其病斑面積的平均值與對照相比小20%, 差異在P< 0.01 水平顯著(圖6-A, B)。

對純合T1代轉(zhuǎn)基因株系穗部采用單花滴注法接種赤霉菌, 接種10 d 后, 未轉(zhuǎn)基因?qū)φ账氩康某嗝咕山臃N點(diǎn)開始向臨近小穗蔓延, 但轉(zhuǎn)基因株系并未出現(xiàn)明顯的赤霉菌擴(kuò)展現(xiàn)象。接種14 d 后, 轉(zhuǎn)基因株系與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ盏牟⌒∷霐?shù)和病軸長差異顯著(圖6-C, D, E), 其中非轉(zhuǎn)基因的Bobwhite 病小穗數(shù)平均為4.2 個, 病軸長平均為3.0 cm, 轉(zhuǎn)基因株系的病小穗數(shù)平均值在1.7～2.0 個之間, 病軸長在1.4～2.5 cm 之間; 對照PH691 的病小穗數(shù)與病軸長的平均值分別為5.9 個和4.7 cm, 但以PH691 為受體的轉(zhuǎn)基因植株的病小穗數(shù)和病軸長的平均值分別為1.0 個和1.6 cm, 與對照相比, 轉(zhuǎn)基因植株的病小穗數(shù)與病軸長差異均在P< 0.001 水平極顯著(圖6-D, E)。

2.5 TaJRL53 過量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株中抗病信號途徑相關(guān)基因的表達(dá)

為探究TaJRL53過量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株提高赤霉病抗性的分子機(jī)制, 對主要抗病信號途徑SA、JA、ROS、Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)信號通路和木質(zhì)素合成途徑的標(biāo)志基因進(jìn)行了赤霉菌誘導(dǎo)后的表達(dá)分析。如圖7所示, 當(dāng)赤霉菌侵染TaJRL53過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株24 h 時(shí), JA 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的基因12-OPR3、ACO以及效應(yīng)基因ERF1、病程相關(guān)蛋白基因PR-3的表達(dá)均顯著提高(圖7-A～D)。對ROS 生成途徑中的兩個關(guān)鍵酶SAMDC、PAO 及與活性氧運(yùn)輸相關(guān)的Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)信號通路相關(guān)基因calcium-transporting ase1的表達(dá)進(jìn)行檢測, 發(fā)現(xiàn)這3 個基因在轉(zhuǎn)基因株系中的表達(dá)量都顯著高于非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓?圖7-E～G)。在SA 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中除了病程相關(guān)蛋白基因PR1、PR2表達(dá)量顯著提高外(圖7-H, I), 效應(yīng)基因Glu2、NPR1、EDS1(圖7-J～L),SA合成相關(guān)基因ICS1和PAL等的表達(dá)都無顯著差異(圖7-M, N); 轉(zhuǎn)基因植株與非轉(zhuǎn)基因植株的木質(zhì)素合成基因CCOMT表達(dá)水平無顯著差異(圖7-O)。由此初步推測TaJRL53提高小麥赤霉病抗性與JA 和ROS 信號途徑以及病程相關(guān)蛋白有關(guān)。

3 討論

盡管目前發(fā)現(xiàn)的JRL 凝集素存在于植物的多種組織, 但對于某一個特定的JRL 凝集素而言, 其在植物體內(nèi)的表達(dá)往往僅限于某一個或少數(shù)幾個組織,具有一定的組織特異性。Song 等[6]和Jiang 等[7]對JRL 基因在不同組織中的表達(dá)譜進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析后發(fā)現(xiàn), 21.4%的JRL 基因都具有組織表達(dá)特異性。例如Lem2在內(nèi)外稃及胚芽中表達(dá)[40],MRL-1和MRL-2都在根中表達(dá)[41],TaJA1在葉鞘中表達(dá)[31]。本研究對TaJRL53的組織特異性表達(dá)進(jìn)行分析, 發(fā)現(xiàn)TaJRL53苗期主要在莖和葉片中表達(dá), 開花期在莖、葉、穗部都有表達(dá), 但主要在穗部表達(dá)。

根據(jù)糖基結(jié)合的特異性可以將JRLs 劃分為兩類: 一類是半乳糖特異的jacalin 凝集素(galactosespecific jacalin-related lectins, gJRLs), 另一類是甘露糖或葡萄糖特異的jacalin 凝集素(mannose-specific jacalinrelated lectins, mJRLs)?，F(xiàn)階段所鑒定的JRLs 大多數(shù)屬于mJRLs, 少數(shù)屬于gJRLs。對水稻、擬南芥和小麥中的mJRLs 亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示大多數(shù)位于核/質(zhì)間[39-41]。本研究通過洋蔥表皮細(xì)胞亞細(xì)胞定位, 發(fā)現(xiàn)TaJRL53蛋白分布在細(xì)胞核/質(zhì)中, 表明TaJRL53具有mJRLs 亞家族成員典型的蛋白定位特征, 初步推測TaJRL53屬于mJRLs 亞家族成員。特異糖基結(jié)合試驗(yàn)有助于進(jìn)一步確定該凝集素本身的性質(zhì)。

Dirigent 蛋白通常被認(rèn)為在木質(zhì)素和木脂素的生物合成中起重要作用, 與Dirigent 結(jié)構(gòu)域嵌合的JRLs 基因在植物的應(yīng)激反應(yīng)和發(fā)育中扮演著重要角色[12], 例如TaJA1, 及其在水稻和大麥中的同源基因OsJAC1、HvJAC1均具有廣譜抗性[31,45]。TaJRL53的蛋白編碼結(jié)構(gòu)與TaJA1相似, 都具有 N 端的Dirigent 結(jié)構(gòu)域和C 端的Jacalin 結(jié)構(gòu)域[6]。本研究對TaJRL53的功能進(jìn)行探究, 認(rèn)為該基因參與對赤霉菌的防御過程, 對赤霉菌的侵染具有抗性。本研究首先采用BSMV 的方法降低TaJRL53在中抗赤霉病品種SSD006 中的表達(dá), 發(fā)現(xiàn)植株對赤霉病的抗性降低。然后采用基因槍介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù), 將TaJRL53過量表達(dá)載體轉(zhuǎn)入感赤霉病品種Bobwhite和PH691 中, 分別獲得6 株和1 株TaJRL53的過量表達(dá)植株。對T1代轉(zhuǎn)基因植株采用離體葉片法和穗部單花滴注法接種赤霉菌鑒定轉(zhuǎn)基因株系對赤霉菌的抗性, 離體葉片法接菌結(jié)果顯示: 以Bobwhite 為受體的轉(zhuǎn)基因株系其葉片上的熒光與對照相比明顯減弱, 菌斑面積顯著減小。陰性對照PH691 和以其為受體的轉(zhuǎn)基因植株在接菌之后菌絲均沿接種點(diǎn)向四周擴(kuò)散, 但轉(zhuǎn)基因植株菌絲擴(kuò)散程度與對照相比較輕。單花滴注法接種T1代小穗后, 結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因株系與對照均出現(xiàn)赤霉病的典型癥狀, 但轉(zhuǎn)基因株系與受體親本相比病害較輕。對T2代轉(zhuǎn)基因株系的穗部接菌進(jìn)行抗性鑒定, 各轉(zhuǎn)基因株系與T1代的抗病趨勢一致, 表明TaJRL53的轉(zhuǎn)基因株系可以減輕由禾谷鐮刀菌引起的病害。同時(shí), 本研究發(fā)現(xiàn)兩個不同背景的轉(zhuǎn)基因株系抗病性存在差異, 這可能是因?yàn)閮蓚€受體材料對赤霉病的抗性和自身的組培性能存在差異, 轉(zhuǎn)基因植株中TaJRL53的拷貝數(shù)不同造成的。

SA 和JA 介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)途徑是植物在應(yīng)對病原菌侵染時(shí)被激活的防衛(wèi)途徑, JA 在死體寄生和兼性寄生型病原菌侵染過程中起重要作用, SA 在活體寄生型病原菌的侵染過程中起重要作用, SA 和JA 途徑均參與兼性寄生型真菌赤霉菌的侵染反應(yīng)[46-47]。TaJRLL1是mJRLs 亞家族中的一員, 該基因通過參與SA 和JA 的植物防御信號機(jī)制的組成部分, 實(shí)現(xiàn)小麥植株對死體寄生的灰霉菌, 活體寄生的白粉菌以及兼性寄生的赤霉菌的抗性[28]。本研究對接種赤霉菌后的TaJRL53轉(zhuǎn)基因植株的SA 和JA 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)行檢測, 發(fā)現(xiàn)JA 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑主要標(biāo)志基因的表達(dá)量與對照相比有所提高, 但SA 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)基因的表達(dá)并無明顯變化。ROS 的產(chǎn)生是植物最早期的防御反應(yīng)途徑, ROS 的積累一方面可誘導(dǎo)防御基因的表達(dá), 另一方面通過胼胝質(zhì)沉積增加植物細(xì)胞壁的厚度[48]。在TaJRL53過量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株中ROS 生成途徑的關(guān)鍵基因SAMDC和PAO的表達(dá)上調(diào), 但是細(xì)胞壁合成相關(guān)的酶基因CCOMT并無表達(dá)變化, 說明TaJRL53過量表達(dá)只是改變了植株體內(nèi)ROS 的產(chǎn)生水平, 并不影響細(xì)胞壁的合成。

綜上所述,TaJRL53可能通過調(diào)控植物體內(nèi)活性氧產(chǎn)生、JA 信號途徑、誘導(dǎo)病程相關(guān)蛋白基因的表達(dá)水平, 從而提高植株對赤霉菌的抗性。但該基因的赤霉病抗病機(jī)制還不清楚, 其發(fā)揮作用的結(jié)構(gòu)域是Dirigent 還是Jacalin 或是共同作用還不得而知,碳水化合物結(jié)合蛋白作為mJRLs 細(xì)胞活動中的關(guān)鍵物質(zhì), 其結(jié)合特異性在植物防御機(jī)制中的作用今后還有待闡明。

4 結(jié)論

通過VIGS 技術(shù)和基因槍介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)證明TaJRL53與赤霉病的抗性呈正相關(guān), 赤霉菌侵染轉(zhuǎn)基因株系后, ROS 和JA 信號途徑相關(guān)基因表現(xiàn)出上調(diào)趨勢, 說明TaJRL53可能是通過參與ROS 合成途徑和JA 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來提高轉(zhuǎn)基因植株對赤霉病的抗性。