柱前衍生-高效液相色譜法測定嬰幼兒配方 乳粉中3 種伏馬毒素

陳同強(qiáng)，郭錦材，李 燦，王亮亮，向 俊，鄒子爵，徐文泱，李凱龍

（1.食品安全監(jiān)測與預(yù)警湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410111；2.湖南省食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，湖南 長沙 410000；3.長沙市口腔醫(yī)院，湖南 長沙 410006；4.湖南省植物保護(hù)研究所，湖南 長沙 410125）

乳粉因其高營養(yǎng)價(jià)值受到消費(fèi)者歡迎，嬰幼兒配方乳粉作為很多嬰幼兒的主食，其質(zhì)量安全倍受關(guān)注。為了模仿母乳，嬰幼兒配方乳粉中往往會添加一些其他營養(yǎng)成分，如脂肪酸、維生素等。

伏馬毒素是鐮孢菌種產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，其本身具有一定毒性，攝入人體會危害健康[1-3]。伏馬毒素廣泛存在于食品中，尤其對玉米及其制品等的污染最為嚴(yán)重[4]。 玉米油等植物油常被添加到嬰幼兒配方乳粉中，以達(dá)到接近母乳成分，這樣伏馬毒素污染隨之轉(zhuǎn)移。目前，國內(nèi)尚未針對食品中伏馬毒素的限量做出相關(guān)規(guī)定，歐盟對伏馬毒素B1（fumonisin B1，F(xiàn)B1）和FB2的總量已有部分規(guī)定，其中嬰幼兒食品中的限量為200 μg/kg[5]。

伏馬毒素常用檢測方法主要包括酶聯(lián)免疫法、高效液相色譜-熒光檢測器（high performance liquid chromatography-fluorescence detector，HPLC-FLD）法和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等[6-7]。目前關(guān)于伏馬毒素檢測方法的建立主要集中在飼料[8-9]、糧食及其加工品[10-18]等相對簡單的樣品基質(zhì)，而對嬰幼兒配方乳粉這類復(fù)雜基質(zhì)中伏馬毒素檢測方法的報(bào)道較少見。本研究對現(xiàn)有的檢測條件及前處理進(jìn)行優(yōu)化改進(jìn)，建立HPLC法測定嬰幼兒配方乳粉中3 種伏馬毒素含量的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

網(wǎng)購嬰幼兒配方乳粉45 份，其中國產(chǎn)品牌20 份，國外品牌25 份，其中0～6、6～12、12～36 月齡各15 份。

FB1、FB2、FB3標(biāo)準(zhǔn)品 美國Sigma公司；伏馬毒素免疫親和柱（柱容量≥2 500 ng，3 mL） 上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；所用試劑均為色譜純。

1.2 設(shè)備與儀器

LC-20A HPLC儀（配備FLD） 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液、試劑及衍生溶液配制

FB1、FB2、FB3標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液（100 μg/mL）：準(zhǔn)確稱取FB1、FB2、FB3標(biāo)準(zhǔn)品各1.0 mg于10 mL容量瓶中，乙腈溶解并定容，搖勻，-20 ℃下避光保存。

FB1、FB2、FB3混合標(biāo)準(zhǔn)工作液：分別準(zhǔn)確移取FB1、FB2、FB3標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液1.0、0.5、0.5 mL于10 mL容量瓶中，空白樣品提取液溶解并定容，得到FB1、FB2、FB3質(zhì)量濃度分別為10.0、5.0、5.0 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，-20 ℃下避光保存。

磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）：準(zhǔn)確稱取氯化鈉7.8 g、磷酸氫二鈉1.0 g、磷酸二氫鉀0.3 g，加水1 L，玻璃棒攪拌，待固體完全溶解后用鹽酸調(diào)節(jié)pH值為7.4左右。

體積分?jǐn)?shù)0.1%吐溫-20-PBS：準(zhǔn)確移取1.0 mL吐溫-20，加入PBS定容至1 L，攪拌混勻。

甲醇-乙酸溶液（98∶2，V/V）：吸取2 mL乙酸，加入到98 mL甲醇中，混合均勻。

硼砂溶液（0.1 mol/L）：稱取3.8 g（精確到0.01 g）硼砂于100 mL容量瓶中，加水溶解并定容，搖勻。

衍生溶液：準(zhǔn)確稱取鄰苯二甲醛40 mg，加1 mL甲醇溶解后，先后依次加入5 mL 0.1 mol/L硼砂溶液、50 μL 2-巰基乙醇，搖勻，將溶液轉(zhuǎn)移至棕色瓶中，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3.2 樣品前處理

稱取乳粉樣品4.0 g于50 mL塑料離心管中，加入20 mL體積分?jǐn)?shù)50%乙腈-水溶液，振搖提取20 min，4 000 r/min離心5 min，重復(fù)提取1 次，合并上清液；取5 mL上清液，加入20 mL PBS，混勻，過濾，移取10 mL注入免疫親和柱，待樣品全部通過免疫親和柱，棄去流出液，加入10 mL體積分?jǐn)?shù)0.1%吐溫-20-PBS洗柱1 次，再取10 mL水洗柱2 次，棄去流出液，加入3 mL甲醇-乙酸 溶液，收集洗脫液，移取1 mL洗脫液氮吹至近干，加入1 mL體積分?jǐn)?shù)50%乙腈-水溶液復(fù)溶，過濾后待衍生。

1.3.3 衍生化反應(yīng)

移取100 μL標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣品溶液于2.0 mL塑料離心管中，加入100 μL衍生溶液，渦旋混勻1 min， 5 000 r/min離心5 min，取上清液于裝有內(nèi)插管的樣品瓶中，HPLC分析。

1.3.4 色譜條件

色譜柱：反相C18柱（25 cm×4.6 mm，5.0 μm）；激發(fā)/發(fā)射波長：335 nm/440 nm；流動相A為0.10 mol/L 甲酸銨-甲酸緩沖液（pH 3.4），流動相B為甲醇；梯度洗脫條件：0.0～4.0 min，70%流動相B；6.0 min，80%流動相B；8.0 min，70%流動相B；流速1 mL/min；進(jìn)樣量20 μL；柱溫35 ℃。

1.3.5 結(jié)果計(jì)算

待測樣品中FB1、FB2、FB3含量按下式計(jì)算。

式中：X為待測樣品中FB1、FB2、FB3的含量/（μg/kg）；ρ為待測液中FB1、FB2、FB3的質(zhì)量濃度/（μg/L）；V為定容體積/mL；m為樣品質(zhì)量/g。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理及繪圖采用Excel 2010軟件完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溶劑的選擇

食品中伏馬毒素的提取常采用乙腈-水溶液（50∶50，V/V）、甲醇-水溶液（75∶25，V/V）、甲醇-乙腈-水溶液（25∶25∶50，V/V）和pH 9.2的甲醇-硼酸鹽緩沖液（75∶25，V/V）等作為提取溶劑[19]。采用樣品加標(biāo)回收的方式對上述幾種提取溶劑的提取效果進(jìn)行比較。由圖1可知，采用乙腈-水溶液（50∶50，V/V）提取的3 種伏馬毒素加標(biāo)回收率均較高，優(yōu)于其他幾種提取溶劑，且出峰未存在明顯的雜質(zhì)干擾。因此，選擇乙腈-水溶液（50∶50，V/V）作為提取溶劑。

圖1 不同提取溶劑對3 種伏馬毒素加標(biāo)回收率的影響Fig. 1 Effect of different extraction solvents on recovery of added fumonisins

2.2 流動相的選擇

鄰苯二甲醛溶液作為柱前衍生溶液時(shí)，常見的流動相為磷酸鹽緩沖液-甲醇，但實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)甲醇比例較高時(shí)會出現(xiàn)鹽析現(xiàn)象，只能配制一定比例的流動相進(jìn)行等度洗脫，從而導(dǎo)致目標(biāo)峰分離效果不好，F(xiàn)B1和FB3出峰時(shí)間較長。為縮短分析時(shí)間，使得FB1和FB3快速出峰，同時(shí)增強(qiáng)FB2和FB3的檢測靈敏度，采用甲酸銨-甲酸緩沖體系替代磷酸鹽緩沖體系作為流動相進(jìn)行梯度洗脫。本研究比較不同濃度（0.01、0.02、0.05、0.10 mol/L）的甲酸銨緩沖液（pH 3.5）對3 種伏馬毒素分離效果的影響，結(jié)果顯示：當(dāng)甲酸銨濃度達(dá)到 0.10 mol/L左右時(shí)，3 種伏馬毒素的分離效果佳且峰型較好；隨著甲酸銨濃度的降低，F(xiàn)B1出峰處有雜質(zhì)峰干擾，且峰型較差，F(xiàn)B2和FB3不能實(shí)現(xiàn)完全分離，因此，采用含0.10 mol/L甲酸銨的緩沖鹽體系作為流動相中的水相部分。

2.3 流動相pH值的選擇

流動相的pH值會對FB1與FB2的出峰狀況及靈敏度有影響[19]。本研究比較pH值為3.0、3.2、3.4、3.6、3.8、4.0的甲酸銨-甲酸緩沖體系對FB1、FB2、FB3色譜峰分離效果的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：隨著流動相pH值的降低，3 種伏馬毒素出峰時(shí)間向后移動，導(dǎo)致分析時(shí)間過長；當(dāng)pH值為3.4左右時(shí)，F(xiàn)B1、FB2、FB3達(dá)到分離要求，且峰型相對較好；隨著pH值的繼續(xù)降低，雖然分離效果更好，但加入到流動相中的甲酸含量將大幅增加，長期使用會嚴(yán)重縮短色譜柱的使用壽命，同時(shí)當(dāng)pH值降至3.4以下時(shí)，會出現(xiàn)雜峰，對FB1的檢測產(chǎn)生干擾。因此選擇pH 3.4左右的甲酸銨-甲酸緩沖體系作為流動相的水相部分。

2.4 柱溫的選擇

一般來說，隨著色譜柱溫的升高，出峰時(shí)間將會縮短?？疾觳煌鶞兀?5、30、35、40 ℃）時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)柱溫較低時(shí)，對FB1的檢測有干擾；柱溫較高時(shí)，出峰過快，分離效果不佳，且容易被雜質(zhì)峰干擾。因此綜合考慮，柱溫選擇35 ℃。

2.5 基質(zhì)效應(yīng)

分別用流動相和空白樣品提取液配制標(biāo)準(zhǔn)溶液，比較伏馬毒素在不同溶劑介質(zhì)中的基質(zhì)效應(yīng)，結(jié)果顯示，伏馬毒素在乳粉提取凈化液中均表現(xiàn)出較強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)，因此本研究采用空白樣品提取液作為溶劑配制標(biāo)準(zhǔn)溶液能較好地消除伏馬毒素基質(zhì)效應(yīng)的影響。

2.6 方法學(xué)考察

2.6.1 標(biāo)準(zhǔn)譜圖和線性關(guān)系

準(zhǔn)確移取FB1質(zhì)量濃度分別為20.0、50.0、100.0、200.0、500.0 μg/L，F(xiàn)B2、FB3質(zhì)量濃度分別為10.0、25.0、50.0、100.0、250.0 μg/L的伏馬毒素標(biāo)準(zhǔn)工作溶液100 μL，加入100 μL鄰苯二甲醛衍生劑反應(yīng)。在設(shè)定的色譜條件下采用HPLC-FLD分析，由圖2可知，3 種伏馬毒素峰型良好，分離度高，且雜峰干擾少。以峰面積為y軸，3 種伏馬毒素質(zhì)量濃度為x軸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明，F(xiàn)B1在20.0～500.0 μg/L，F(xiàn)B2、FB3在10.0～250.0 μg/L 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)均具有良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（r）均大于0.999。

2.6.2 檢出限和定量限

通過將低質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液加入到陰性乳粉樣品中，制備3 種伏馬毒素低質(zhì)量濃度的模擬陽性樣品，以3 倍信噪比作為檢出限，10 倍信噪比作為定量限，得出FB1、FB2、FB3檢出限分別為10、5、5 μg/kg，定量限分別為30、15、15 μg/kg。

2.6.3 加標(biāo)回收率及精密度

稱取9 份空白乳粉樣品，分別加入低、中、高（定量限、2 倍定量限、10 倍定量限）質(zhì)量濃度的FB1、FB2、FB3標(biāo)準(zhǔn)溶液，加標(biāo)樣品圖譜如圖3所示。

圖3 加標(biāo)樣品（加標(biāo)量40 μg/kg）HPLC圖Fig. 3 HPLC chromatogram of spiked sample (40 μg/kg)

外標(biāo)法定量并計(jì)算加標(biāo)回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，由表1可知，3 種伏馬毒素加標(biāo)回收率較高，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10.0%，方法重復(fù)性好，均滿足檢測要求，該法適用于嬰幼兒配方乳粉中3 種伏馬毒素的同時(shí)測定。

表1 3 種伏馬毒素的加標(biāo)回收率（n=6）Table 1 Recoveries of three fumonisins (n = 6)

2.7 實(shí)際樣品測定

對隨機(jī)網(wǎng)購45 份乳粉按照實(shí)驗(yàn)方法檢測，結(jié)果顯示，所有乳粉中3 種伏馬毒素均未檢出，這在一定程度上表明目前市面上嬰幼兒配方乳粉中伏馬毒素的污染情況控制較好。

3 結(jié) 論

通過對鄰苯二甲醛柱前衍生-HPLC法檢測條件進(jìn)行優(yōu)化，選用甲酸銨-甲酸緩沖體系作為水相流動相，甲醇作為有機(jī)相流動相，采用梯度洗脫程序進(jìn)行檢測，不但提高了檢測效率而且增強(qiáng)了3 種伏馬毒素的檢測靈敏度。通過優(yōu)化水相流動相的pH值及柱溫，改善了3 種伏馬毒素的分離效果。通過比較常用提取溶劑的提取效率，最終選擇乙腈-水（50∶50，V/V）作為提取溶劑。本研究建立的方法具有靈敏度高、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，適用于嬰幼兒配方乳粉中3 種伏馬毒素的快速檢測。