Ca2＋對(duì)植物乳桿菌LIP-1冷凍干燥抗性的影響及其在熱飲中的應(yīng)用

滿都呼，薛舒苑，劉嘉媛，修玉鳳，馬思楠，劉澤西，王俊國

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018）

益生菌是一類通過改善宿主體內(nèi)微生態(tài)平衡，進(jìn)而促進(jìn)宿主健康的微生物[1]。現(xiàn)在市面上的益生菌制劑多采用真空冷凍干燥法制備，因?yàn)檎婵绽鋬龈稍锓ㄖ苽涞囊嫔哂谢罹鷶?shù)較高、保質(zhì)期較長和運(yùn)輸成本較低的特點(diǎn)，所以該技術(shù)常應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)中[2]。凍干過程中不可避免會(huì)造成菌體損傷，導(dǎo)致菌株失活，影響產(chǎn)品 性能[3]。目前的研究表明，改變培養(yǎng)基成分能夠有效提高菌株的冷凍干燥存活率。Li Chun等[4]的研究發(fā)現(xiàn)，改變培養(yǎng)基中碳源成分能夠提高保加利亞乳桿菌的冷凍干燥存活率。楊弋[5]的研究發(fā)現(xiàn)，將鎂離子加入培養(yǎng)基能夠增強(qiáng)菌株的耐熱能力。Schindler等[6]的研究證明，加入鈣離子能夠提高保加利亞乳桿菌的冷凍干燥抗性。

益生菌制劑的使用溫度有嚴(yán)格限制，目前市場上80%的益生菌制劑需用40 ℃以下的溫水沖泡，超過45 ℃，產(chǎn)品活菌數(shù)大幅度降低，最終影響產(chǎn)品的益生特性[7]。因此如何提高益生菌制劑在熱飲中的活菌數(shù)成為科研人員開發(fā)益生菌及其相關(guān)制品時(shí)的重點(diǎn)研究內(nèi)容。

目前關(guān)于提高凍干菌粉在熱飲中存活率的研究近乎空白，因此，為提高菌株的冷凍干燥抗性和耐熱性，本研究以1 株具有降血脂益生功能的植物乳桿菌LIP-1為研究對(duì)象，通過在培養(yǎng)基中添加不同濃度的CaCl2，探究 Ca2+對(duì)菌株冷凍干燥抗性和耐熱性的影響，最后比較未加鈣菌粉、加鈣菌粉和未加鈣市售菌粉在不同熱飲中的活菌數(shù)，并探究內(nèi)在機(jī)制，為提高益生菌制劑在熱飲中的存活率提供理論基礎(chǔ)與數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選取分離自新疆自然發(fā)酵酸馬乳、擁有良好耐酸耐膽鹽特性和較強(qiáng)降膽固醇活性的植物乳桿菌LIP-1（Lactobacillus plantarumLIP-1）為研究對(duì)象，該菌株由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供[8]。

熱飲選擇市面常見的6 類飲品：阿薩姆奶茶 統(tǒng)一企業(yè)中國控股有限公司；礦泉水、東方樹葉茶飲料 農(nóng)夫山 泉股份有限公司；原味咖啡 雀巢公司；美汁源橙汁 可口可樂（中國）投資有限公司；利樂無菌包純牛乳 伊利集團(tuán)；菌粉（配料：食用玉米淀粉、白砂糖、低聚果糖、脫脂乳粉、植物乳桿菌，活菌數(shù)1010CFU/g） 市售。

無水CaCl2（分析純） 天津永晟精細(xì)化工有限 公司；青霉素G（色譜純） 北京索萊寶科技有限公司； 正己烷（色譜純） 天津福晨化學(xué)試劑有限公司；甲醇（色譜純） 天津光復(fù)科技發(fā)展有限公司；質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%甲醇鈉溶液（色譜純）、氯仿（色譜純） 上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DF-101S磁力攪拌水浴鍋 鄭州予華儀器制造有限公司；移液槍、Centrifuge-5810R高速離心機(jī) 德國Eppendorf公司；MLS-3750滅菌鍋、STAC-S45F恒溫培養(yǎng)箱 日本三洋公司；ZHJH-1214B超凈工作臺(tái) 南京依貝儀器設(shè)備有限公司；FD-1A-50真空冷凍干燥機(jī) 北京 博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；DW-86L388J醫(yī)用低溫保 存箱 青島海爾特種電器有限公司；MOV-212S干熱滅菌箱 日本松下公司；ND100-1干式氮吹儀 南京肯凡電子科技有限公司；Technologies 6850氣相色譜儀 安捷倫科技（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化

將植物乳桿菌LIP-1以體積分?jǐn)?shù)2%接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基，于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h，連續(xù)培養(yǎng)3 代，將活化的菌株置于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

MRS培養(yǎng)基配制：大豆蛋白胨10.0 g、牛肉浸膏10.0 g、酵母粉5.0 g、葡萄糖20.0 g、無水乙酸鈉10.0 g、無水磷酸氫二鉀2.0 g、五水硫酸錳0.05 g、七水硫酸鎂0.2 g、吐溫-80 1.0 g、檸檬酸鈉2.0 g、蒸餾水1 000 mL，將上述試劑充分混勻，121 ℃滅菌15 min；MRS固體培養(yǎng)基在MRS的基礎(chǔ)上添加1%瓊脂，121 ℃滅菌15 min。

1.3.2 Ca2+對(duì)植物乳桿菌LIP-1生長的影響

分別將0.0、0.5、1.0、1.5、2.0 mmol/L CaCl2加入到MRS液體培養(yǎng)基中，配制成不同Ca2+濃度的培養(yǎng)基。將活化好的菌株以4%接種量接入Ca2+培養(yǎng)基中，于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h，將培養(yǎng)好的菌株采用稀釋平板計(jì)數(shù)法計(jì)算活菌數(shù)。

1.3.3 真空冷凍干燥

將Ca2+培養(yǎng)基中收集的0.1 g菌泥中加入2 mL滅菌脫脂乳，充分混勻后置于-80 ℃超低溫冰箱中預(yù)凍24 h。預(yù)凍后的樣品置于真空冷凍干燥機(jī)中凍干，凍干條件：冷阱溫度-45 ℃，真空度20 Pa，凍干時(shí)間24 h。采用稀釋平板計(jì)數(shù)法計(jì)算凍干菌粉活菌數(shù)。冷凍干燥存活率按式（1）計(jì)算。

式中：A1為經(jīng)真空冷凍干燥后活菌數(shù)/（108CFU/mL）；A2為真空冷凍干燥前活菌數(shù)/（108CFU/mL）。

以凍干菌粉活菌數(shù)與冷凍干燥存活率為指標(biāo)篩選 Ca2+最佳添加濃度。

1.3.4 最佳濃度Ca2+對(duì)凍干菌粉耐熱性的影響

菌株熱致死處理指的是在一定溫度、時(shí)間條件下處理后菌株存活率低于10%的處理[9]。植物乳桿菌LIP-1的熱致死溫度為75 ℃，熱致死時(shí)間為30 s[10]。首先對(duì)菌株進(jìn)行熱致死處理，評(píng)價(jià)最佳濃度Ca2+對(duì)凍干菌粉耐熱性的影響。以篩選出的最佳濃度Ca2+組為實(shí)驗(yàn)組，以未添加Ca2+組為對(duì)照組，將2 組凍干菌粉用生理鹽水等體積復(fù)溶，置于75 ℃水浴鍋中30 s熱致死處理后，進(jìn)行平板計(jì)數(shù)。

1.3.5 菌粉在不同熱飲中耐熱存活率的測定

以最佳濃度Ca2+培養(yǎng)的植物乳桿菌LIP-1制備的加鈣凍干菌粉（實(shí)驗(yàn)組）、未加鈣菌粉（對(duì)照組）和市售菌粉為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，每組取0.1 g菌粉，分別添加到5 mL 55 ℃礦泉水、咖啡、果汁、牛乳、奶茶和茶飲料中，在熱飲適口溫度（55 ℃）下水浴加熱5 min，通過平板計(jì)數(shù)法測定各組菌粉的活菌數(shù)，并計(jì)算實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組菌粉的耐熱存活率。耐熱存活率按式（2）計(jì)算。

1.3.6 細(xì)胞損傷評(píng)價(jià)

采用青霉素G和NaCl敏感性實(shí)驗(yàn)對(duì)3 組菌粉進(jìn)行細(xì)胞壁和細(xì)胞膜損傷評(píng)價(jià)[11]。所有敏感性實(shí)驗(yàn)均采用植物乳桿菌LIP-1的NaCl及青霉素G最低抑菌濃度。NaCl-MRS選擇性固體培養(yǎng)基即MRS培養(yǎng)基中添加0.5 mol/L NaCl，121 ℃滅菌15 min；青霉素G-MRS選擇性固體培養(yǎng)基即MRS培養(yǎng)基121 ℃滅菌15 min后，添加7.5 μg/L青霉素G（已過濾滅菌）。

1.3.7 細(xì)胞膜脂肪酸的測定

參考Bligh等[12]的方法。用5 mL無菌去離子水對(duì)3 組菌粉進(jìn)行復(fù)溶，然后使用5 mL生理鹽水洗菌3 次（4 000 r/min、4 ℃、5 min）；稱取洗后的菌泥0.5 g，加入1.9 mL氯仿-甲醇（體積比1∶2）溶液，連續(xù)振蕩15 min，再加入氯仿及去離子水各0.625 mL，再次振蕩15 min，將混合均勻的樣品在4 ℃、8 000 r/min條件下離心10 min；吸取下層液相，轉(zhuǎn)移至無菌離心管中，氮吹至干，再加入1 mL 1 mol/L甲醇鈉-甲醇溶液，冰浴后振蕩5 min；最后加入0.625 mL正己烷振蕩混勻，在4 ℃、8 000 r/min條件下離心5 min，吸取上清液，使用有機(jī)濾膜將液體移入氣相色譜進(jìn)樣瓶中。

氣相色譜條件：DB-WAX毛細(xì)管色譜柱（60 m×0.25 μm，0.25 mm）；進(jìn)樣口溫度250 ℃；檢測口溫度260 ℃；氮?dú)夥至鞅?∶1，流速1 mL/min；柱溫程序：初始溫度80 ℃，升溫速率6.5 ℃/min，升至170 ℃，升溫速率轉(zhuǎn)為27.5 ℃/min，升至215 ℃保持2 min，升溫速率再轉(zhuǎn)為40 ℃/min，升至230 ℃保持2 min；進(jìn)樣量3 μL。采用峰面積歸一法計(jì)算脂肪酸相對(duì)含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)均平行測定3 次，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。應(yīng)用SPSS軟件進(jìn)行顯著性分析，并使用Origin 2018與Excel軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度Ca2+對(duì)植物乳桿菌LIP-1活菌數(shù)及冷凍干燥存活率的影響

由圖1可知，不同濃度Ca2+對(duì)植物乳桿菌LIP-1的活菌數(shù)與冷凍干燥存活率有不同影響。未添加Ca2+的對(duì)照組活菌數(shù)為（9.53±0.03）（lg（CFU/mL）），當(dāng)Ca2+濃度達(dá)到0.5 mmol/L時(shí)，菌株的活菌數(shù)最高，達(dá)到（9.61±0.03）（lg（CFU/mL）），顯著高于對(duì)照組 （P＜0.05）。隨著Ca2+濃度高于0.5 mmol/L，菌株的活菌數(shù)逐漸降低。冷凍干燥存活率方面，與對(duì)照組相比，添加Ca2+組冷凍干燥存活率均顯著提高（P＜0.05），且隨Ca2+濃度的增加呈先升高后降低的趨勢，Ca2+濃度為1.0 mmol/L時(shí)達(dá)到最高。但與菌株活菌數(shù)結(jié)合考慮，Ca2+濃度為0.5 mmol/L時(shí)，冷凍干燥后具有更高的活菌數(shù)，故將Ca2+濃度0.5 mmol/L組作為最優(yōu)組別。

圖1 不同濃度Ca2＋對(duì)植物乳桿菌LIP-1活菌數(shù)與冷凍干燥存活率的影響Fig. 1 Effect of different concentrations of Ca2+ on the viability and freeze-drying survival of Lactobacillus plantarum LIP-1

2.2 最佳濃度Ca2+對(duì)凍干菌粉耐熱性的影響

為進(jìn)一步探究Ca2+對(duì)菌株耐熱性的影響，本研究選取活菌數(shù)與冷凍干燥存活率均為最高的0.5 mmol/L Ca2+組為實(shí)驗(yàn)組，以未添加Ca2+為對(duì)照組。首先通過熱致死實(shí)驗(yàn)來判斷對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組菌株是否具有耐熱性。

由圖2可知，未添加Ca2+的對(duì)照組熱致死處理后的活菌數(shù)為（8.26±0.12）（lg（CFU/mL）），而添加Ca2+的實(shí)驗(yàn)組經(jīng)過熱致死處理后活菌數(shù)為 （8.95±0.18）（lg（CFU/mL）），顯著高于對(duì)照組 （P＜0.05），證明培養(yǎng)基中添加Ca2+能夠提高植物乳桿菌LIP-1的耐熱性。

圖2 最佳濃度Ca2＋菌粉熱致死前后的活菌數(shù)Fig. 2 Viable counts of freeze-dried cells of LIP-1 with added Ca2＋ at optimized concentration before and after thermal treatment

2.3 菌粉在不同熱飲中的耐熱性評(píng)價(jià)

盡管現(xiàn)階段實(shí)驗(yàn)證明，加入Ca2+培養(yǎng)的植物乳桿菌LIP-1具有一定的耐熱性，但其能否在各類熱飲中維持較好的耐熱性和存活率，仍需要通過實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證。

由于飲用水溫過高會(huì)燙傷食道黏膜[13]，同時(shí)本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，大眾對(duì)55 ℃左右熱飲的接受程度最高，因此將實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組和市售菌粉分別添加到55 ℃的礦泉水、茶飲料、咖啡、果汁、奶茶和牛乳中保持5 min，得出各組菌粉在不同熱飲中的活菌數(shù)。由圖3可知，在上述6 類熱飲中，3 組菌粉活菌數(shù)出現(xiàn)了同樣的變化趨勢，實(shí)驗(yàn)組的活菌數(shù)均顯著高于對(duì)照組和市售菌粉組（P＜0.05），說明0.5 mmol/L Ca2+的加入能夠有效提高菌粉在各類熱飲中的存活率。

3 組菌粉在礦泉水中的活菌數(shù)最低，這是由于礦泉水中缺乏保護(hù)物質(zhì)，不能在熱處理時(shí)為菌株提供更好的環(huán)境，導(dǎo)致菌體大量死亡[14]；茶飲料中3 組菌粉的活菌數(shù)顯著高于礦泉水（P＜0.05），這可能是因?yàn)椴栾嬃现械牟瓒喾釉谝欢ǔ潭壬蠝p輕了菌株受到的熱損傷[15]；3 組菌粉在咖啡和果汁中的活菌數(shù)顯著高于礦泉水和茶飲料（P＜0.05），這可能是因?yàn)榭Х群凸泻写罅刻穷愇镔|(zhì)，能夠在一定程度上對(duì)菌株起到保護(hù)作用[16]； 3 組菌粉在奶茶和牛乳中活菌數(shù)顯著高于其他組別 （P＜0.05），這可能是由于這2 種熱飲中富含蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和糖類，能夠?qū)昶鸬捷^好的保護(hù)作用[17]。

上述實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，3 組菌粉在礦泉水中的活菌數(shù)顯著低于其他組（P＜0.05），因此選擇礦泉水進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，可以排除糖類、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)類等物質(zhì)對(duì)菌株的保護(hù)。接下來將進(jìn)一步探究實(shí)驗(yàn)組耐熱性提高的內(nèi)在機(jī)制。首先對(duì)在礦泉水中55 ℃處理5 min的3 組菌粉進(jìn)行細(xì)胞損傷評(píng)價(jià)。

2.4 3 種菌粉植物乳桿菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的損傷評(píng)價(jià)

當(dāng)菌株的細(xì)胞壁發(fā)生損傷時(shí)，青霉素G能夠進(jìn)入細(xì)胞，導(dǎo)致菌株死亡；當(dāng)細(xì)胞膜發(fā)生損傷時(shí)，NaCl能夠進(jìn)入細(xì)胞，導(dǎo)致菌株死亡，因此采用敏感性實(shí)驗(yàn)來判斷菌株細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的損傷程度[18]。

由圖4可知，青霉素G敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，熱處理后實(shí)驗(yàn)組菌粉的活菌數(shù)為（8.43±0.04）（lg（CFU/mL））， 對(duì)照組菌粉的活菌數(shù)為（8.01±0.03）（lg（CFU/mL））， 市售菌粉活菌數(shù)為（7.89±0.05）（lg（CFU/mL）），實(shí)驗(yàn)組菌粉顯著高于其他2 組菌粉（P＜0.05），表明實(shí)驗(yàn)組菌粉的植物乳桿菌細(xì)胞壁損傷程度較輕。NaCl敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，熱處理后實(shí)驗(yàn)組菌粉活菌數(shù)為（8.22±0.06）（lg（CFU/mL）），對(duì)照組菌粉和市售菌粉分別為（7.67±0.05）、（7.41±0.04）（lg（CFU/mL））， 實(shí)驗(yàn)組菌粉顯著高于其他2 組菌粉（P＜0.05），表明實(shí)驗(yàn)組菌粉的植物乳桿菌細(xì)胞膜損傷程度較輕。由于菌粉在熱致死后對(duì)NaCl更加敏感，表明植物乳桿菌細(xì)胞膜在熱致死過程中受到的損傷更大。

圖4 3 種菌粉植物乳桿菌細(xì)胞壁與細(xì)胞膜的損傷評(píng)價(jià)Fig. 4 Evaluation of cell wall and cell membrane damage of three freeze-dried bacterial cultures

2.5 3 種菌粉植物乳桿菌細(xì)胞膜脂肪酸組成

相關(guān)研究表明，細(xì)胞膜脂肪酸是影響細(xì)胞膜完整性的關(guān)鍵因素，因此本研究對(duì)3 種菌粉植物乳桿菌細(xì)胞膜脂肪酸進(jìn)行測定[19]。

當(dāng)乳酸菌處于不利環(huán)境時(shí)，菌株為了維持細(xì)胞膜的完整性會(huì)改變細(xì)胞膜脂肪酸的成分及含量。乳酸菌細(xì)胞膜脂肪酸的碳鏈長短、飽和度及環(huán)丙烷脂肪酸的含量均對(duì)乳酸菌的抗逆性有影響[20]。對(duì)于3 種菌粉經(jīng)熱處理后的植物乳桿菌細(xì)胞膜脂肪酸成分及相對(duì)含量，由表1 可知，實(shí)驗(yàn)組菌粉月桂酸（C12:0）、棕櫚酸（C16:0）、順-9-十六碳烯酸（C16:1n-7）、硬脂酸（C18:0）、γ-亞麻酸（C18:3n-6）、反-亞油酸（C18:2n-6t）相對(duì)含量較其他2 組菌粉降低，亞油酸（C18:2n-6c）、環(huán)丙烷脂肪酸（C19cyc11）、花生酸（C20:0）、順-11,14-二十碳二烯酸（C20:2n-6）、順-5,8,11,14,17-二十碳五烯酸（C20:5n-3）和順-4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯酸（C22:6n-3）相對(duì)含量與對(duì)照組相比升高。此外，在實(shí)驗(yàn)組中檢測出2 組長鏈不飽和脂肪酸C20:5n-3和C22:6n-3。

表1 3 種菌粉的植物乳桿菌細(xì)胞膜脂肪酸組成Table 1 Fatty acid composition of cell membranes of three freeze-dried bacterial cultures

實(shí)驗(yàn)組菌粉的植物乳桿菌細(xì)胞膜脂肪酸不飽和度顯著高于其他2 組，表明Ca2+能夠提高菌株熱處理后的細(xì)胞膜脂肪酸不飽和度。實(shí)驗(yàn)組菌粉的植物乳桿菌細(xì)胞膜環(huán)丙烷脂肪酸相對(duì)含量為（9.72±0.71）%，顯著高于其他2 組 （P＜0.05）。上述結(jié)果表明，加入適宜濃度Ca2+能夠幫助植物乳桿菌菌株調(diào)整細(xì)胞膜不飽和脂肪酸和環(huán)丙烷脂肪酸相對(duì)含量，進(jìn)而提高凍干菌粉的植物乳桿菌耐熱性。

3 結(jié) 論

為提高菌株植物乳桿菌LIP-1的冷凍干燥抗性和在熱飲中的存活率，向培養(yǎng)基中添加不同濃度的CaCl2。結(jié)果表明：培養(yǎng)基中添加0.5 mmol/L Ca2+能夠提高植物乳桿菌LIP-1的冷凍干燥抗性和耐熱性；將加鈣菌粉、未加鈣菌粉和市售菌粉加入不同熱飲中進(jìn)行耐熱性評(píng)價(jià)，證明Ca2+能夠提高菌株在不同熱飲中的耐熱性；對(duì)菌株進(jìn)行損傷評(píng)價(jià)后發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞膜損傷是菌株在熱飲中死亡的主要原因，探究內(nèi)在機(jī)制發(fā)現(xiàn)，Ca2+能夠提高細(xì)胞膜不飽和脂肪酸及環(huán)丙烷脂肪酸的相對(duì)含量，減小細(xì)胞膜損傷，提高菌株的冷熱抗性。本研究為植物乳桿菌LIP-1凍干菌粉在熱飲中的應(yīng)用提供了理論參考與數(shù)據(jù)支持。