單寧酸／醇溶性殼聚糖復(fù)合材料的制備及其生物性能

孔維悅，汪國慶，萬逸，申媛媛，馬燕平

（海南大學(xué)南海海洋資源國家重點實驗室，?？?570228）

海洋污損生物附著于船舶和各種水下人工設(shè)施后，會加速金屬的腐蝕，不僅影響海洋資源的開發(fā)與利用［1-3］，還會造成巨大的經(jīng)濟損失和安全隱患。面對海洋設(shè)備的生物污損問題，應(yīng)當從本質(zhì)上對其進行防護。大量生物學(xué)研究結(jié)果［4］表明，抑制微生物膜的形成對于阻斷后續(xù)大型生物的附著有重要意義。近年來，人類對海洋污損生物的防護研究主要集中在高效的防污劑上［5-8］。但是，一些對海洋環(huán)境有害的防污劑已逐漸被限量或禁止使用［9-11］。那么，如何在保護海洋環(huán)境及海洋生物的同時，對防污損材料進行有效保護呢？

殼聚糖作為一種豐富易得、無毒無害、自然環(huán)保的生物材料，由于其優(yōu)異的抑菌性［12-15］和生物相容性能［16-18］，該材料被廣泛用于食品［19-22］、生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域［23-25］。但由于殼聚糖大分子中具有穩(wěn)定的環(huán)狀結(jié)構(gòu)及分子間強的氫鍵作用，其溶解性較差，不溶于水和一般有機溶劑，需對其進行修飾改性［26-27］，才能達到理想的應(yīng)用效果。

本工作對殼聚糖進行改性，以期在解決海洋防污材料高效殺菌的同時，不危害其他海洋生物。試驗采用兩步法，利用2，3-環(huán)氧丙基三甲基氯化銨（ETA）對殼聚糖進行接枝，再加入鋰鹽進行陽離子交換，得到醇溶性殼聚糖（QCS），加入單寧酸（TA）與六亞甲基二異氰酸酯（HDI），篩選最佳的單寧酸／醇溶性殼聚糖復(fù)合材料反應(yīng)液比例，并對該復(fù)合材料的抑菌性和生物相容性進行研究。

1 試驗

1.1 試驗材料

試驗所用主要試劑與儀器分別如表1、2所示。

表2 試驗儀器Tab.2 Experimental equipment

1.2 試驗方法

1.2.1 醇溶性殼聚糖的制備與表征

本試驗改進ZHAO 等［28］的方法，分兩步進行醇溶性殼聚糖的制備。（1）殼聚糖的季銨鹽化及其后續(xù)的陽離子交換。首先，由于2，3-環(huán)氧丙基三甲基氯化銨分子中有季銨基和環(huán)氧基，它們與活潑氫化合物易發(fā)生反應(yīng)，且一般在中性條件下反應(yīng)，副反應(yīng)少，因此本試驗用其接枝殼聚糖。將1 g殼聚糖與40 m L異丙醇放置在100 m L圓底燒瓶中，取4 g ETA 溶于10 m L 去離子水中，85 ℃下用恒溫磁力攪拌器將兩種溶液進行攪拌反應(yīng)，冷凝回流24 h；用異丙醇將過濾出的沉淀物清洗后，再置于95%無水乙醇中攪拌，將過濾后的沉淀物置于70 ℃烘箱中干燥24 h，得到第一步產(chǎn)物。（2）取1.5 g雙三氟甲烷磺酰亞胺鋰溶于25 m L 去離子水中，取1 g第一步產(chǎn)物溶于100 m L 純水中，將兩種溶液置于250 m L燒杯中，加入轉(zhuǎn)子后在磁力攪拌器上劇烈攪拌，過濾收集白色沉淀物，用純水沖洗沉淀后，置于60℃烘箱干燥24 h，得到白色固體即為醇溶性殼聚糖。

取少量產(chǎn)物溶于氘代二甲基亞砜（DMSO）中，用于核磁表征。

1.2.2 單寧酸／醇溶性殼聚糖復(fù)合材料的制備與表征

為確定復(fù)合材料反應(yīng)液的最佳比例，配置不同比例的樣品，取不同質(zhì)量的單寧酸和醇溶性殼聚糖分別溶于DMSO 后，并加入適量交聯(lián)劑（HDI），攪拌進行反應(yīng)，反應(yīng)液的成分如表3所示。取200μL反應(yīng)液于載玻片上，室溫下靜置約18 h后，將產(chǎn)物在去離子水中浸泡24 h，期間每2～3 h 換一次純水，以除去多余的DMSO。

表3 幾種反應(yīng)液的成分Tab.3 Composition of several reaction liquids

分別取反應(yīng)液1～5的部分產(chǎn)物于超低溫冷凍儲存箱內(nèi)放置30 min后，置于冷凍干燥機里進行干燥，所得的復(fù)合材料依次命名為TQ1、TQ2、TQ3、TQ4、TQ5，在50 m A 電流條件下，噴金20 s，在15 k V 電壓下利用掃描電鏡觀察其形貌。

1.2.3 單寧酸／醇溶性殼聚糖復(fù)合材料的抑菌性能測試

本試驗采用平板計數(shù)法評估單寧酸／醇溶性殼聚糖復(fù)合材料的抑菌性能。

（1）細菌的培養(yǎng)與收集

以革蘭氏陽性金黃色葡萄球菌和革蘭氏陰性大腸桿菌為病原菌，研究了單寧酸／醇溶性殼聚糖復(fù)合材料的抑菌性能，分別配制500 m L LB 液體培養(yǎng)基，將0.5 g酵母、1 g氯化鈉和1 g胰蛋白胨置于250 m L 燒杯中，加水搖動容器直至溶質(zhì)溶解，用2 mol／L NaOH 溶液將其p H 調(diào)至7.2～7.4，并加水定容至500 m L。從－80 ℃環(huán)境中取出所需的凍存菌種（大腸桿菌和金黃葡萄球菌）置于LB 液體培養(yǎng)基并在37 ℃恒溫震蕩培養(yǎng)箱中復(fù)蘇2～3 h，按3∶100（質(zhì)量比）將細菌轉(zhuǎn)接入新的LB 培養(yǎng)基，繼續(xù)在37 ℃震蕩培養(yǎng)2～3 h。試驗中使用的所有耗材和培養(yǎng)基都需要于121 ℃下高壓滅菌20 min。

（2）復(fù)合材料的抑菌性測試

取等量凍干后的復(fù)合材料粉末，將其與上述兩種菌液混合后，置于37℃光照培養(yǎng)箱中孵育2 h，取出后用離心機將沉淀離心至底部，取上清液，加入預(yù)先配制好的平板，置于37 ℃內(nèi)倒置培養(yǎng)24 h，觀察細菌生長情況。

1.2.4 復(fù)合材料的溶血性能測試

將雞血紅細胞（質(zhì)量分數(shù)為6%）離心10 min（1 000 r／min），分離紅細胞。然后將五份不同成分的50μL反應(yīng)液和50μL紅細胞添加到96孔板中，再在37 ℃恒溫震蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h。之后將96孔板內(nèi)的反應(yīng)液離心10 min后，將上清液注入新的96孔板中，并用等量的Tris（三羥甲基氨基甲烷）緩沖液稀釋。使用美國BIO-RAD 公司生產(chǎn)的微板分光光度計測定溶液在540 nm 處的吸光度。0.1%Triton x-100為陽性對照，Tris buffer為陰性對照。根據(jù)式（1）計算溶血率（Hr）：

式中：Ap為反應(yīng)液吸光度；At為Triton x-100陽性對照的吸光度；Ab為DMSO 陰性對照的吸光度。

1.2.5 復(fù)合材料的熱穩(wěn)定性測試

將冷凍干燥后的復(fù)合材料在TGA／DSC 1型熱重分析儀上進行熱失重試驗。熱重分析儀以高純度氮氣（99.99%）為載氣，流量為60 m L／min。待測試樣的質(zhì)量為5～10 mg，將其置于鉑金坩堝中，在連續(xù)通氮的情況下，采用10 ℃／min的升溫速率從室溫加熱至800℃。系統(tǒng)自動采集試樣的質(zhì)量損失數(shù)據(jù)，記錄質(zhì)量損失變化曲線。

2 結(jié)果與討論

2.1 醇溶性殼聚糖的核磁共振氫譜

如圖1所示，核磁共振氫譜（1H NMR）數(shù)據(jù)如下：1H NMR （400 MHz DMSO-d6）；δ（mg／L）5.29～5.57（m，1H）；5.02～5.00（m，1H）；4.12～4.09（m，1H）；3.36（s，8H）；3.13（s，10H）；2.64（s，1 H）。此外，對于改性后的殼聚糖，每一個修飾過的糖上H、CH3應(yīng)該有9個質(zhì)子信號。而從核磁氫譜圖中可以看出，CH3的積分值在10 左右。因此殼聚糖已得到充分改性。

圖1 醇溶性殼聚糖的1 H NMRFig.1 1 H NMR of alcohol-soluble chitosan

2.2 單寧酸／醇溶性殼聚糖復(fù)合材料的微觀形貌

由圖2 可知，TQ1 因其反應(yīng)單體僅有殼聚糖，殼聚糖與交聯(lián)劑反應(yīng)完全后，得到的產(chǎn)物表面結(jié)構(gòu)較致密。當反應(yīng)體系中單寧酸與醇溶性殼聚糖的質(zhì)量比為1∶3時，合成了具有特殊納米孔洞結(jié)構(gòu)的產(chǎn)物TQ2，所引入的單寧酸作為生物大分子含有大量的苯環(huán)結(jié)構(gòu)會產(chǎn)生空間位阻，妨礙其與HDI的反應(yīng)以及醇溶性殼聚糖與HDI的反應(yīng)；其次，由于單寧酸苯環(huán)上相鄰的酚羥基極為接近且數(shù)量較大，易產(chǎn)生重疊的電子云，同時酚羥基所帶O－的數(shù)量逐漸多于－NH3＋，O－的凈負電荷產(chǎn)生的排斥作用，這都可能導(dǎo)致TQ2出現(xiàn)孔洞結(jié)構(gòu)，進而影響材料的生物性能，如抑菌性。由于孔洞結(jié)構(gòu)可大大增加材料的比表面積，因此能夠極大地促進材料中抑菌成分發(fā)揮作用。TQ3孔洞結(jié)構(gòu)消失，殼聚糖含量繼續(xù)減小，形貌主要為片狀堆疊。隨著單寧酸含量的繼續(xù)增加，TQ4整體為片狀結(jié)構(gòu)，TQ5的反應(yīng)液中僅有單寧酸與交聯(lián)劑，產(chǎn)物結(jié)構(gòu)為比較均勻的顆粒堆積。

圖2 不同單寧酸／醇溶性殼聚糖復(fù)合材料的SEM 圖Fig.2 SEM morphology of different tannic acid／alcohol-soluble chitosan compounds

2.3 單寧酸／醇溶性殼聚糖復(fù)合材料的抑菌性能

目前大多數(shù)的研究結(jié)果都認為殼聚糖的有效基團－NH3＋可以與細菌細胞膜上的類脂-蛋白質(zhì)復(fù)合物發(fā)生反應(yīng)，使蛋白質(zhì)變性，改變細胞膜的通透性或者與細菌細胞壁形成負電荷環(huán)境，尤其是革蘭氏陽性菌，細胞壁較厚，結(jié)構(gòu)緊密，含有豐富的磷壁酸，殼聚糖損壞細胞壁的完整性或使細胞壁趨于溶解，直至細胞死亡［29］。由圖3 可以看出，單寧酸／醇溶性殼聚糖復(fù)合材料對金黃葡萄球菌的生長表現(xiàn)出明顯的抑制性，隨著醇溶性殼聚糖質(zhì)量的不斷減小，抑菌有效基團（－NH3＋）的濃度不斷下降，因此其抑菌性逐漸下降，當單寧酸與醇溶性殼聚糖質(zhì)量比為1∶3 時，TQ2 表面為孔洞結(jié)構(gòu)，大大增加了－NH3

圖3 不同單寧酸與醇溶性殼聚糖質(zhì)量比所得的單寧酸／醇溶性殼聚糖復(fù)合材料的抑菌率Fig.3 Antibacterial rate of tannic acid／alcohol-soluble chitosan compounds with different mass ratios of tannic acid to alcohol-soluble chitosan

＋與細菌細胞膜的接觸面積，使其抑菌率最高達到75%，表明殼聚糖在單獨使用時，抑菌效果并非最佳，加入適量單寧酸后，可明顯提高材料的抑菌率。該類材料對大腸桿菌幾乎沒有抑菌效果，原因可能是不同菌種的抑菌性差別較大。目前人們對殼聚糖的抑菌機理尚未完全明確統(tǒng)一，但可以肯定的是不同的菌種被抑制的效果不同，并且殼聚糖對革蘭氏陽性菌的抑制效果比對革蘭氏陰性菌的強。

2.4 單寧酸／醇溶性殼聚糖復(fù)合材料的溶血性能

由圖4可以看出，隨著醇溶性殼聚糖含量的降低，復(fù)合材料材料的溶血率不斷升高。由于殼聚糖表面所帶－NH3＋可以有效促進血小板、血紅細胞快速聚集成血凝塊，其自身也會發(fā)生一定的聚合效應(yīng)，生成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，聚集游離的紅細胞［30-31］。在溶血性試驗中，取復(fù)合材料與紅細胞反應(yīng)離心后的上清液作為檢測液，所測得的溶血率隨著凝血作用的增強而降低。因此，隨著醇溶性殼聚糖中－NH3＋含量的降低，溶血率逐漸升高，但所有復(fù)合材料的溶血率均小于5%，說明該類復(fù)合材料對紅細胞沒有損傷，均具有良好的生物相容性。

圖4 不同單寧酸與醇溶性殼聚糖質(zhì)量比所得的單寧酸／醇溶性殼聚糖復(fù)合材料的溶血率Fig.4 Hemolysis rate of tannic acid／alcohol-soluble chitosan compounds with different mass ratios of tannic acid to alcohol-soluble chitosan

目前廣泛使用氧化亞銅防污劑，盡管有學(xué)者提出采用碳包覆抑制氧化亞銅的析出，降低其毒性和延長防污期限，或通過模板法制備空心氧化亞銅作為防污涂層，以減少氧化亞銅的使用量及其在環(huán)境中的釋放量，但從長遠的角度來看，氧化亞銅或其他有機防污劑始終會對海洋生態(tài)環(huán)境帶來一定的損害，影響海洋生物的生長甚至打破海洋生態(tài)平衡，與之相比，適量的單寧酸與殼聚糖反應(yīng)所得的復(fù)合材料擁有極低的溶血性，也意味著該復(fù)合材料對細胞膜沒有傷害，不會導(dǎo)致細胞破裂，兼具較高抑菌性和優(yōu)異的生物相容性。

2.5 單寧酸／醇溶性殼聚糖復(fù)合材料的熱穩(wěn)定性

由圖5和圖6分析得出表4數(shù)據(jù)，在同一升溫速率（10 ℃／min）下，五組單寧酸／醇溶性殼聚糖復(fù)合材料質(zhì)量損失10%的溫度（Td，10%）存在一定的差異，TQ1質(zhì)量損失10%的溫度最高，其耐熱性最好，TQ2的次之。TQ1 的殘渣率最低，TQ2 的次之。另外，由圖5和圖6還可以看出，由于單寧酸與醇溶性殼聚糖比例的不同，所得復(fù)合材料的分步分解峰也有所區(qū)別?？傮w來說，單寧酸的加入降低了復(fù)合材料的熱穩(wěn)定性。

表4 不同單寧酸／醇溶性殼聚糖復(fù)合材料的熱重分析數(shù)據(jù)Tab.4 TG analysis data of different TA／QCS compounds

圖5 不同單寧酸／醇溶性殼聚糖復(fù)合材料的熱重曲線Fig.5 TG curves of different TA／QCS compounds

圖6 不同單寧酸／醇溶性殼聚糖復(fù)合材料的微商熱重曲線Fig.6 DTG curves of different TA／QCS compounds

以抑菌率最高的TQ2復(fù)合材料為例，分析其熱重數(shù)據(jù)。由圖7可知，在氮氣氛圍內(nèi)，該復(fù)合材料的熱解過程可分為3個階段。

圖7 TQ2復(fù)合材料的熱重-微商熱重曲線Fig.7 TG and DTG curves of TQ2 compound

第一階段從初始溫度到340 ℃。其中，從室溫至200℃的質(zhì)量損失率低于200～310℃的，這是因為溫度低于200 ℃時，復(fù)合材料吸熱，溫度升高，TQ2復(fù)合材料中主要發(fā)生少量吸附水和低聚物的揮發(fā)，質(zhì)量損失率為5.2%。在200～310 ℃溫度區(qū)間，微商熱重（DTG）曲線主峰旁邊出現(xiàn)肩峰，主要是由于復(fù)合材料中未反應(yīng)的單寧酸和醇溶性殼聚糖以及少量交聯(lián)劑等裂解，三種成分熱解溫度不同。310～510 ℃為熱解第二階段，樣品熱裂解反應(yīng)劇烈，主要為HDI的異氰酸根與羥基反應(yīng)得到的酯鍵斷裂引起，質(zhì)量損失率為52.33%，復(fù)合材料最大質(zhì)量損失率對應(yīng)的溫度為448℃。溫度在520℃之后為質(zhì)量損失第三階段，復(fù)合材料的質(zhì)量損失逐漸趨于平緩，為殘余物碳化過程，產(chǎn)生13.72%殘渣主要為復(fù)合材料中單寧酸的苯環(huán)骨架片段縮聚形成碳以及醇溶性殼聚糖所帶的無機金屬離子（Li＋）形成無機鹽。

3 結(jié)論

（1）采用兩步法成功合成出醇溶性殼聚糖，添加單寧酸，調(diào)整二者配比制備兼具良好抑菌性和生物相容性的復(fù)合材料。

（2）引入適量單寧酸，復(fù)合材料的結(jié)構(gòu)與形貌會明顯改變，復(fù)合材料對革蘭氏陽性菌的抑菌性大幅度提高，單寧酸所占質(zhì)量分數(shù)為25%時，抑菌率最高達75%。

（3）不同配比反應(yīng)液所得的復(fù)合材料均有較低的溶血性，但隨著單寧酸含量的增加，復(fù)合材料的溶血率增高。

（4）隨著醇溶性殼聚糖含量的降低，復(fù)合材料的熱穩(wěn)定性逐漸減小。

綜合復(fù)合材料的總體性能，得出較優(yōu)的反應(yīng)液配比為醇溶性殼聚糖與單寧酸質(zhì)量比為3∶1，所得復(fù)合材料的抑菌性較高，同時具有較好的生物相容性。