金絲桃苷對(duì)小鼠的抗疲勞作用及機(jī)制研究

鄭傳癡，楊 艷，韋 余，周旭美，高健美,

（1.遵義醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥劑科，貴州遵義 563000；2.遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科，貴州遵義 563000；3.遵義醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，貴州遵義 563000）

疲勞是指機(jī)體在生理過(guò)程中不能持續(xù)其機(jī)能在特定水平和（或）不能維持預(yù)定的運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度[1]。若不及時(shí)消除疲勞可導(dǎo)致人體的內(nèi)分泌功能紊亂，免疫力下降，進(jìn)而引發(fā)一系列生理問(wèn)題，例如失眠、抑郁等。運(yùn)動(dòng)性疲勞嚴(yán)重影響人類的健康[2?3]，但其病因復(fù)雜，目前尚不明確。關(guān)于運(yùn)動(dòng)性疲勞的產(chǎn)生機(jī)制主要包括能源衰竭學(xué)說(shuō)、自由基學(xué)說(shuō)等。其中，氧化應(yīng)激損傷即體內(nèi)活性氧（reactive oxygen species, ROS）產(chǎn)生與抗氧化能力之間失衡的狀態(tài)被認(rèn)為是運(yùn)動(dòng)性疲勞產(chǎn)生的主要原因之一[4?5]。最近研究發(fā)現(xiàn)，核因子 E2相關(guān)因子（nuclear factor erythroid 2-related factor 2, Nrf2）作為內(nèi)源性抗氧化途徑的中樞轉(zhuǎn)錄因子在運(yùn)動(dòng)性疲勞中發(fā)揮重要作用[6?7]。因此，以Nrf2為作用靶點(diǎn)研究延緩疲勞的產(chǎn)生和促進(jìn)疲勞的消除具有重大意義。

金絲桃苷是廣泛存在于金絲桃科、薔薇科等植物全草及果實(shí)（例如山楂、葡萄、蘋果等）中的黃酮類活性成分[8]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，金絲桃苷具有抗心肌缺血再灌注損傷[9]、抗腫瘤[10]、降壓等作用[11]。本團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)，金絲桃苷能夠改善D-半乳糖導(dǎo)致的衰老模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶功能，其作用與抑制氧化應(yīng)激損傷有關(guān)[12]。但是，金絲桃苷能否通過(guò)調(diào)控Nrf2信號(hào)途徑發(fā)揮抗小鼠運(yùn)動(dòng)性疲勞的作用尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究采用運(yùn)動(dòng)性疲勞小鼠模型研究金絲桃苷的抗疲勞作用及其可能的作用機(jī)制，旨在為后續(xù)金絲桃苷臨床用于抗運(yùn)動(dòng)性疲勞提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

金絲桃苷（批號(hào)SH8310，經(jīng)HPLC檢測(cè)純度≥98%） 北京索萊寶科技有限公司；SPF級(jí)雄性C57BL/6 小鼠（6~8 周齡，18~22 g） 湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司（合格證號(hào)：SYXK（湘）2019-0004）。將所有 C57BL/6 小鼠分籠（n=5~6 只/籠）飼養(yǎng)，所有動(dòng)物在通風(fēng)良好、恒溫（(23±1)℃）、恒濕（55%±5%）12 h晝夜交替的房間適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，實(shí)驗(yàn)期間小鼠能夠自由進(jìn)食及飲水；乳酸（lactic acid,LA）、血清尿素氮（blood urea nitrogen, BUN）、肝糖元（liver glycogen, LG）、肌糖元（muscle glycogen,MG）、活性氧簇（reactive oxygen species, ROS）、丙二醛（malonaldehyde, MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）試劑盒、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase, GSH-Px）試劑盒 上海仁捷生物科技有限公司；Nrf2、HO-1、NQO-1抗體 Abcam公司。

51119670 全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀 ThermoFisher Scientific；LE8505自動(dòng)疲勞轉(zhuǎn)棒儀 瑞沃德生命科技有限公司；1645050電泳儀、GelDoc EZ全自動(dòng)電泳凝膠成像分析系統(tǒng) Bio-Rad。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組及給藥 采用簡(jiǎn)單隨機(jī)法將SPF級(jí)雄性C57BL/6小鼠40只隨機(jī)分為4組：空白組、金絲桃苷低劑量組、金絲桃苷中劑量組和金絲桃苷高劑量組。低、中、高劑量組每天灌胃5、10、20 mg/kg的金絲桃苷，連續(xù)給藥28 d?？瞻捉M灌胃等體積生理鹽水。

1.2.2 小鼠疲勞轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn) 在末次給藥30 min后，進(jìn)行疲勞轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)。將各組小鼠置于轉(zhuǎn)棒疲勞儀（轉(zhuǎn)速 30 r/min）上，先進(jìn)行小鼠疲勞轉(zhuǎn)棒訓(xùn)練 3次（1 次/d）后，末次給藥第4 d進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)，記錄小鼠運(yùn)動(dòng)性疲勞后，從轉(zhuǎn)棒上跌落的時(shí)間。

1.2.3 小鼠負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn) 在末次給藥30 min后，通過(guò)力竭負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)觀察小鼠的耐力。在小鼠尾部固定5%體重的鉛線，將各組小鼠置于水深40 cm、水溫（25±1）℃的游泳箱中。小鼠從自由游泳開(kāi)始至沉入水中10 s后不能浮出水面的時(shí)間作為小鼠力竭游泳時(shí)間。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，采用2%戊巴比妥鈉麻醉小鼠后，眼球取血后，在4 ℃條件下3000 r/min離心10 min取上清；采血后，立即取小鼠肝臟和腓腸肌組織，于?80 ℃冰箱中保存、備用。

1.2.4 生化指標(biāo)檢測(cè) 通過(guò)ELISA法檢測(cè)小鼠血清中BUN、LA的含量，肝組織中LG、ROS、MDA、SOD、GSH-Px，肌肉組織中MG的含量，實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書方法進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.5 分子對(duì)接技術(shù) 通過(guò)分子對(duì)接技術(shù)觀察金絲桃苷與Nrf2蛋白結(jié)合情況。首先從RSCB數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.rcsb.org/）中下載Nrf2蛋白的晶體結(jié)構(gòu)（PDB ID：3WN7），然后，從 PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中下載金絲桃苷化合物 2D及 3D結(jié)構(gòu)的 SDF格式文件。運(yùn)用AutoDock vina軟件進(jìn)行分子對(duì)接，利用Pymol軟件進(jìn)行對(duì)接復(fù)合物的可視化分析。

1.2.6 Western blot檢測(cè) 通過(guò)Western blot法檢測(cè)小鼠肝組織中Nrf2、HO-1、NQO-1的蛋白表達(dá)。取小鼠肝組織，加入蛋白裂解液后，離心提取總蛋白并通過(guò)BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度，加熱使其變性后，蛋白上樣量30 μg，經(jīng)12%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，采用半干法將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上。將PVDF膜封閉于含5%脫脂奶粉的三乙醇胺緩沖鹽（tris buffered saline/tween, TBST）封閉液中 1 h 后，加入相應(yīng)的一抗：Nrf2（1:1000）、HO-1（1:1000）、NQO-1（1:1000），在 4 ℃ 條件下孵育一抗過(guò)夜，采用TBST洗膜3次后，以辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的二抗室溫條件下孵育1 h后，采用ECL發(fā)光法經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)曝光顯影，采用Image J軟件分析內(nèi)參蛋白和目的蛋白條帶的灰度值。

1.3 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS 18.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。多組間比較采用單因素方差分析，方差齊用Bonferroni檢驗(yàn)，方差不齊用Dunnett’s T3檢驗(yàn)，P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 金絲桃苷對(duì)小鼠轉(zhuǎn)棒時(shí)間的影響

通過(guò)轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)觀察金絲桃苷對(duì)運(yùn)動(dòng)性疲勞小鼠耐力和平衡性的影響。研究結(jié)果表明：與空白組比較，給藥組小鼠在轉(zhuǎn)棒儀上停留的時(shí)間顯著（P<0.05）延長(zhǎng)且呈劑量依賴性（表1）。

表1 金絲桃苷對(duì)小鼠轉(zhuǎn)棒停留時(shí)間的影響（n=10, ±s）Table 1 Effects of hyperoside on the rotating rod lasting time of mice（n=10, ±s）

表1 金絲桃苷對(duì)小鼠轉(zhuǎn)棒停留時(shí)間的影響（n=10, ±s）Table 1 Effects of hyperoside on the rotating rod lasting time of mice（n=10, ±s）

注：與空白組比較，*代表差異顯著，P<0.05；**代表差異極顯著，P<0.01；表2~表4同。

組別 劑量（mg/kg） 停留時(shí)間（s）空白組 109.6±1.5金絲桃苷低劑量組 5 141.4±3.9*金絲桃苷中劑量組 10 188.6±6.8**金絲桃苷高劑量組 20 239.4±6.3**

2.2 金絲桃苷對(duì)小鼠力竭游泳時(shí)間的影響

通過(guò)小鼠力竭游泳實(shí)驗(yàn)觀察金絲桃苷對(duì)運(yùn)動(dòng)耐力的影響評(píng)價(jià)其抗疲勞活性。研究結(jié)果顯示：與空白組比較，給藥組小鼠力竭游泳時(shí)間顯著（P<0.05）延長(zhǎng)并呈劑量依賴性（表2）。

表2 金絲桃苷對(duì)小鼠力竭游泳時(shí)間的影響（n=10, ）Table 2 Effects of hyperoside on the exhaustive swimming time of mice（n=10, ）

表2 金絲桃苷對(duì)小鼠力竭游泳時(shí)間的影響（n=10, ）Table 2 Effects of hyperoside on the exhaustive swimming time of mice（n=10, ）

組別 劑量（mg/kg） 停留時(shí)間（s）空白組 649.2±16.3金絲桃苷低劑量組 5 796.8±14.1*金絲桃苷中劑量組 10 887.3±11.5**金絲桃苷高劑量組 20 966.2±13.1**

2.3 金絲桃苷對(duì)小鼠抗疲勞相關(guān)生化指標(biāo)的影響

通過(guò)ELISA法觀察金絲桃苷對(duì)運(yùn)動(dòng)性疲勞小鼠血清中LA、BUN的含量、肝組織中LG和腓腸肌組織中MG的含量。研究結(jié)果顯示：與空白組比較，金絲桃苷顯著降低小鼠LA、BUN的含量，升高小鼠肝糖原含量和肌糖原含量（表3）（P<0.05）。

表3 金絲桃苷對(duì)小鼠抗疲勞相關(guān)生化指標(biāo)的影響（n=10, ±s）Table 3 Effects of hyperoside on anti-fatigue related indexes of mice（n=10, ±s）

表3 金絲桃苷對(duì)小鼠抗疲勞相關(guān)生化指標(biāo)的影響（n=10, ±s）Table 3 Effects of hyperoside on anti-fatigue related indexes of mice（n=10, ±s）

組別 劑量（mg/kg）血清指標(biāo) 肝臟 腓腸肌LA（mmol/L）BUN（mmol/L）LG（mg/g）MG（mg/g）空白組 9.5±0.4 15.3±0.5 4.2±0.1 2.2±0.1金絲桃苷低劑量組 5 7.4±0.2* 10.4±0.3* 6.4±0.3* 3.8±0.1*金絲桃苷中劑量組 10 6.1±0.2** 8.2±0.2** 8.4±0.1**5.5±0.2**金絲桃苷高劑量組 20 4.2±0.1** 6.2±0.4**11.5±0.9**6.3±0.1**

2.4 金絲桃苷對(duì)疲勞小鼠肝組織氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的影響

通過(guò)ELISA法觀察金絲桃苷對(duì)疲勞小鼠肝組織ROS和MDA的含量、SOD和GSH-Px活力的影響。研究結(jié)果表明：與空白組比較，金絲桃苷顯著降低小鼠肝組織中ROS和MDA的含量，升高SOD和 GSH-Px 的活力（表4）（P<0.05）。

表4 金絲桃苷對(duì)疲勞小鼠肝組織氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的影響（n=10, ）Table 4 Effects of hyperoside on oxidative-related indexes of liver of fatigue mice（n=10, ）

表4 金絲桃苷對(duì)疲勞小鼠肝組織氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的影響（n=10, ）Table 4 Effects of hyperoside on oxidative-related indexes of liver of fatigue mice（n=10, ）

組別 劑量（mg/kg）ROS（U/L）MDA（nmol/L）SOD（U/mg prot）GSH-Px（U/mg prot）空白組 76.4±3.1 7.2±0.1 8.5±0.3 5.4±0.3金絲桃苷低劑量組 5 55.4±2.6*5.1±0.2* 12.3±0.6* 10.5±0.5*金絲桃苷中劑量組 10 27.8±4.5**3.5±0.2**17.9±0.7** 18.5±0.7**金絲桃苷高劑量組 20 19.1±3.4**2.9±0.2**25.6±0.8** 23.9±0.2**

2.5 金絲桃苷與Nrf2蛋白結(jié)合情況

通過(guò)分子對(duì)接技術(shù)觀察金絲桃苷與Nrf2蛋白結(jié)合情況。研究結(jié)果顯示：金絲桃苷與Nrf2的對(duì)接能量為?11.21 kcal/mol，由于其對(duì)接能量≤?5 kcal/mol，表明金絲桃苷能夠與Nrf2蛋白直接結(jié)合。兩者的氨基酸結(jié)合位點(diǎn)主要包括纈氨酸（Val608）、蘇氨酸（Thr560）、丙氨酸（Ala369）、異亮氨酸（Ile559）等（圖1）。

圖1 金絲桃苷與Nrf2蛋白的分子對(duì)接結(jié)果Fig.1 The molecular docking results of hyperoside binding with Nrf2

2.6 金絲桃苷對(duì)疲勞小鼠Nrf2、HO-1、NQO-1蛋白表達(dá)的影響

采用Western blot法檢測(cè)金絲桃苷對(duì)疲勞小鼠Nrf2、HO-1、NQO-1蛋白表達(dá)的影響。研究結(jié)果顯示：與空白組比較，金絲桃苷能夠明顯下調(diào)胞漿中Nrf2的蛋白表達(dá)，上調(diào)胞核中Nrf2、HO-1、NQO-1的蛋白表達(dá)（圖2）。

圖2 金絲桃苷對(duì)疲勞小鼠肝組織中Nrf2、HO-1、NQO-1蛋白表達(dá)的影響Fig.2 Effects of hyperoside on the expressions of Nrf2, HO-1, NQO-1 of liver in fatigue mice

3 討論與結(jié)論

運(yùn)動(dòng)性疲勞可導(dǎo)致機(jī)體能量消耗、尿素氮、乳酸等代謝產(chǎn)物不斷累積，體力和工作能力下降，使機(jī)體呈現(xiàn)亞健康狀態(tài)或增加疾病發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)[13]。轉(zhuǎn)棒時(shí)間和力竭游泳時(shí)間長(zhǎng)短可直觀反映機(jī)體的運(yùn)動(dòng)能力，是檢測(cè)藥物抗疲勞作用的重要指標(biāo)[14?15]。本研究結(jié)果表明，金絲桃苷能夠明顯延長(zhǎng)小鼠在轉(zhuǎn)棒上停留的時(shí)間和力竭游泳時(shí)間，提示金絲桃苷能夠增強(qiáng)小鼠的運(yùn)動(dòng)能力和抗疲勞能力。此外，當(dāng)機(jī)體長(zhǎng)時(shí)間劇烈運(yùn)動(dòng)后，血液中LA大量產(chǎn)生，引起疲勞[16?17]。BUN是機(jī)體蛋白質(zhì)代謝的產(chǎn)物，其含量與運(yùn)動(dòng)性疲勞呈正相關(guān)，即BUN清除越快，則疲勞消除的就越快[18?19]。糖原是機(jī)體重要的能量來(lái)源，其中，MG在運(yùn)動(dòng)中直接提供能量，LG負(fù)責(zé)儲(chǔ)備能量。MG和LG的含量與抗疲勞能力呈正相關(guān)[20?21]。本研究結(jié)果表明，金絲桃苷能夠明顯降低運(yùn)動(dòng)性疲勞小鼠LA和BUN的水平，增加MG和LG的含量，表明金絲桃苷有效的提高了機(jī)體清除LA和BUN的能力，增強(qiáng)了機(jī)體糖原的儲(chǔ)備，進(jìn)而發(fā)揮其抗疲勞的作用。

劇烈運(yùn)動(dòng)可導(dǎo)致機(jī)體ROS產(chǎn)生加速，導(dǎo)致氧化應(yīng)激損傷。ROS是體內(nèi)一類氧的單電子還原產(chǎn)物，體內(nèi)常見(jiàn)的ROS類型主要包括超氧陰離子、過(guò)氧化氫（hydrogen peroxide, H2O2）、羥自由基等[22?23]。當(dāng)運(yùn)動(dòng)性疲勞發(fā)生時(shí)，過(guò)量產(chǎn)生的ROS會(huì)攻擊細(xì)胞膜，使脂質(zhì)過(guò)氧化物丙二醛（malondialdehyde, MDA）產(chǎn)生增加；同時(shí)，導(dǎo)致機(jī)體抗氧化物酶（SOD、GSHPx等）活力降低[24?25]。本研究結(jié)果表明，金絲桃苷能夠明顯降低ROS和MDA的水平，同時(shí)，增加SOD和GSH-Px的活力，提示金絲桃苷的抗疲勞作用與其抗氧化能力有關(guān)。

Nrf2 屬于 cap-‘n’-collar調(diào)節(jié)蛋白家族，具有高度保守的堿性亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)。在機(jī)體穩(wěn)態(tài)條件下，Nrf2與胞漿中Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1（Kelch-like ECH-associated protein 1, Keap1）結(jié)合而處于無(wú)活性狀態(tài)[26]；當(dāng)機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)下，Nrf2與Keap1解離后易位到細(xì)胞核，與基因啟動(dòng)子中存在的特定抗氧化反應(yīng)元件（antioxidant response element, ARE）相互作用，啟動(dòng)其下游的抗氧化酶基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程，如血紅素加氧酶1（heme oxygenase 1, HO-1）、NADPH醌氧化還原酶 1（NADPH quinone oxidoreductase 1, NQO1）等，進(jìn)而提高細(xì)胞的抗氧化應(yīng)激損傷能力[27?28]。Nrf2信號(hào)途徑與機(jī)體抗氧化能力密切相關(guān)，激活Nrf2能夠有效抑制氧化應(yīng)激損傷，進(jìn)而緩解疲勞[29?30]。但是，金絲桃苷能否通過(guò)調(diào)控Nrf2信號(hào)途徑發(fā)揮抗疲勞的作用尚不清楚，因此，本研究首先通過(guò)分子對(duì)接技術(shù)分析金絲桃苷與Nrf2的結(jié)合情況。研究結(jié)果表明金絲桃苷與Nrf2具有較強(qiáng)的親和力，提示金絲桃苷能夠與Nrf2直接結(jié)合?；谝陨嫌?jì)算機(jī)模擬預(yù)測(cè)結(jié)果，本研究進(jìn)一步通過(guò)Western blot法驗(yàn)證金絲桃苷對(duì)Nrf2信號(hào)途徑的影響。研究結(jié)果表明金絲桃苷能夠上調(diào)胞核中Nrf2的水平，下調(diào)胞漿中Nrf2的水平，提示金絲桃苷能夠促進(jìn)Nrf2由胞漿易位到胞核。此外，金絲桃苷還可上調(diào)HO-1和NQO-1的蛋白表達(dá)，提示金絲桃苷能夠通過(guò)調(diào)節(jié)Nrf2信號(hào)途徑發(fā)揮抗運(yùn)動(dòng)性疲勞小鼠氧化應(yīng)激損傷的作用。盡管本研究初步明確了金絲桃苷的抗疲勞能力與調(diào)控Nrf2有關(guān)，但是，其具體作用靶點(diǎn)仍需進(jìn)一步探索。因此，在未來(lái)的研究中將通過(guò)Nrf2基因敲除小鼠深入闡明金絲桃苷抗疲勞的作用機(jī)制。

綜上所述，金絲桃苷具有明顯抗小鼠運(yùn)動(dòng)性疲勞的作用，該作用與其調(diào)控Nrf2信號(hào)途徑進(jìn)而增強(qiáng)抗氧化能力有關(guān)。