結(jié)直腸腺瘤癌變序列組織中ciRS-7 和miR-7 的表達水平及關(guān)系探討

李伊倩，譚嘉圣，張寶庭，陳毅斌

（東莞市松山湖中心醫(yī)院消化內(nèi)科 廣東 東莞 523000）

結(jié)直腸癌是消化道常見的惡性腫瘤，具有較高的發(fā)病率和病死率，2012 年各惡性腫瘤發(fā)病率中，病死率位居第5 位[1]。近年來，隨著人口老齡化趨勢加劇，以及人們生活、工作等方式改變，結(jié)直腸癌的發(fā)病率逐年上升，并呈現(xiàn)出一定的年輕化趨勢，極大地威脅到了人們的健康乃至生命安全[2]。數(shù)據(jù)報道[3]顯示，進展期結(jié)直腸癌的5 年生存率為7%，而早期結(jié)直腸癌則高達92%。由此不難看出，若能夠早期診斷及治療，結(jié)直腸癌的預(yù)后會得到顯著的改善，然而從以往的研究來看，超過半數(shù)的結(jié)直腸癌患者確診時癌細胞已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移。至今，結(jié)直腸癌的發(fā)病機制仍不明確，早期診斷也無特效方法，結(jié)合當(dāng)前醫(yī)學(xué)界對惡性腫瘤分子學(xué)機制的研究，探索結(jié)直腸癌發(fā)病的分子學(xué)機制，尋找無創(chuàng)的早期檢測結(jié)直腸癌發(fā)病的分子生物學(xué)對結(jié)直腸癌的早期診斷十分重要。為此，本研究納入20 例同時具有結(jié)直腸腺瘤及結(jié)直腸腺癌患者，針對環(huán)狀RNA 分子-7（ciRS-7）和微小RNAs-7（miR-7）的表達及其相關(guān)性進行分析，現(xiàn)報道如下。

1.資料與方法

1.1 一般資料

納入東莞市松山湖中心醫(yī)院2019 年7 月—2021 年6 月收集的20 例同時具有結(jié)直腸腺瘤及結(jié)直腸癌病例進行研究，均行電子結(jié)腸鏡檢查及活檢。男12 例（60.00%），女8 例（40.00%）；年齡35 ～75 歲，平均年齡（56.32±2.47）歲。所有患者的病例診斷均由2 名以上資深病理專家確診。以上標(biāo)本均通過患者家屬的知情同意。納入標(biāo)準(zhǔn)：①同時具有結(jié)直腸腺瘤及結(jié)直腸癌患者；②診斷明確，且未經(jīng)過放療、化療等抗腫瘤治療；③有完整的臨床病理資料。排除標(biāo)準(zhǔn)：①來源于其他部分的腫瘤發(fā)生結(jié)直腸轉(zhuǎn)移者；②術(shù)前已接受放化療或者生物治療者。

1.2 方法

采集癌旁正常腸黏膜、結(jié)直腸腺瘤、結(jié)直腸癌新鮮組織標(biāo)本，取材過程中，每份組織標(biāo)本均分為3 部分，其中2 部分離體后30 min 內(nèi)保存于EP 管中，并迅速轉(zhuǎn)存于-80 ℃冰箱，用于提取總RNA；另1 部分送病理科進行病理診斷。

采用熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測組織標(biāo)本中ciRS-7 和miR-7 的表達水平。（1）活檢新鮮冰凍標(biāo)本總RNA 中提?。簩?biāo)本從-80 ℃冰箱中取出，立即取組織塊約100 mg，轉(zhuǎn)入研磨器中，加入液氮后繼續(xù)研磨至粉狀，再加入1 mL TRIzol 充分混勻粉末，參照常規(guī)TRIzol RNA 方法取，提取后置于-80 ℃冰箱中保存。（2）PCR 反應(yīng)：核酸蛋白檢測儀檢測RNA 濃度和純度并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，合成的cDNA 置于-20 ℃冰箱中保存，適當(dāng)稀釋后用于PCR 反應(yīng)。參照PubMed 中基因序列，利用ABI 公司的Primer Express 軟件進行引物設(shè)計，由上海生物工程技術(shù)公司合成。ciRS-7 和miR-7 引物序列，見表1。

表1 ciRS-7 和miR-7 引物序列

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2.結(jié)果

2.1 各組織標(biāo)本中ciRS-7、miR-7 表達水平比較

ciRS-7 表達：結(jié)直腸癌和結(jié)直腸腺瘤表達水平高于癌旁正常腸黏膜，結(jié)直腸癌表達水平高于結(jié)直腸腺瘤，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；miR-7 表達：結(jié)直腸癌和結(jié)直腸腺瘤表達水平低于癌旁正常腸黏膜，結(jié)直腸癌表達水平低于結(jié)直腸腺瘤，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 各組織標(biāo)本中ciRS-7、miR-7 表達水平比較（± s）

表2 各組織標(biāo)本中ciRS-7、miR-7 表達水平比較（± s）

注：*與癌旁正常腸黏膜P ＜0.05，△與結(jié)直腸腺瘤P ＜0.05。

組織例數(shù)ciRS-7miR-7癌旁正常腸黏膜200.95±0.120.39±0.07結(jié)直腸腺瘤201.48±0.20*0.61±0.10*結(jié)直腸癌202.07±0.31*△1.02±0.18*△

2.2 各組織標(biāo)本中ciRS-7、miR-7 表達的相關(guān)性

在各組織標(biāo)本中，ciRS-7 和miR-7 的表達呈顯著負相關(guān)（P＜0.05），見表3。

表3 各組織標(biāo)本中ciRS-7、miR-7 表達相關(guān)性

3.討論

結(jié)直腸癌的發(fā)病過程是漸進性的過程，其惡變途徑主要表現(xiàn)為“腺瘤→腺癌”，報道指出，超過2/3 的腺癌是由腺瘤進展而來[4]。但是，盡管臨床對結(jié)直腸癌的發(fā)病機制進行了深入探究，然而其癌變途徑和分子機制尚不明確。

CircRNA 廣泛存在與真核細胞中，是一種內(nèi)源性非編碼新型RNA 分子，其不存在5’和3’末端，被RNA 外切酶破壞的可能性較低，與傳統(tǒng)線性RNA 相比，其穩(wěn)定性更加突出，而上述特征的存在，也使其相較于miRNAs和非編碼長鏈RNA 作為生物學(xué)標(biāo)志物應(yīng)用在惡性腫瘤的早期診治中更為適合[5]。CiRS-7 是RAN 分子之一，形狀為環(huán)狀，其功能主要為miRNA 海綿、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)和與RNA 結(jié)合蛋白相互作用。但是國內(nèi)有關(guān)CiRS-7 與結(jié)直腸癌相關(guān)內(nèi)容的研究并不多見[6]。miRNAs 是非編碼RNA，有長19 ～23 個的核苷酸，參與了細胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和凋亡[7]。RNA-7 是一種新型的腫瘤標(biāo)志物，其在多種腫瘤中的表達均表現(xiàn)出下調(diào)，有研究指出其是惡性腫瘤預(yù)后不良的重要危險因素[8]。然而國內(nèi)尚無miR-7在正常腸黏膜-結(jié)直腸腺瘤-腸癌序列癌變組織中表達方面的研究。本文結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌、結(jié)直腸腺瘤、正常腸黏膜各組織標(biāo)本中，CiRS-7 的表達水平逐漸下降，而miR-7 的表達水平則逐漸上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），說明了在結(jié)直腸腺瘤癌變序列組織中，的確存在CiRS-7、miR-7 異常表達的現(xiàn)象，其中CiRS-7表達上調(diào)，miR-7 下調(diào)。因此可以說明，CiRS-7、miR-7在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮了一定的作用。進一步分析發(fā)現(xiàn)，CiRS-7、miR-7 的表達呈顯著負相關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），提示二者相互負性調(diào)控關(guān)系。由此可以推測，在結(jié)直腸癌細胞中，CiRS-7 可抑制miR-7 的表達，其可能發(fā)揮出了miR-7 抑制劑的作用。由于國內(nèi)相關(guān)報道并不多見，本研究盡管獲得上述研究結(jié)果，但仍有待深入探究并證實。

綜上所述，結(jié)直腸腺瘤癌變序列組織中，ciRS-7 表達上升，miR-7 表達下降，且二者之間呈顯著的負相關(guān)，提示ciRS-7 和miR-7 有望成為結(jié)直腸腺瘤及腺癌早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療的分子生物學(xué)指標(biāo)。