脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞治療骨關(guān)節(jié)炎研究進(jìn)展*

費(fèi)楊厚雪 ，張 鴿 ，張 云 ，黃 煒△

（1. 華北理工大學(xué)研究生院，河北 唐山 063210； 2. 河北省唐山市工人醫(yī)院，河北 唐山 063003）

骨關(guān)節(jié)炎是一種非炎性關(guān)節(jié)?。?］，主要特征為關(guān)節(jié)軟骨破壞及骨贅形成［2］，具體表現(xiàn)為關(guān)節(jié)疼痛、僵硬，日?；顒?dòng)受限，致殘率高達(dá)53%［3］。且骨關(guān)節(jié)炎所致活動(dòng)功能障礙，會(huì)增加心血管事件的發(fā)生率及全因病死率［4］。傳統(tǒng)治療方法僅能控制疼痛和恢復(fù)骨關(guān)節(jié)功能，但不能阻止疾病的發(fā)展。采用計(jì)算機(jī)檢索PubMed、中國(guó)知網(wǎng)、萬(wàn)方、維普等數(shù)據(jù)庫(kù)中治療骨關(guān)節(jié)炎的相關(guān)文獻(xiàn)，檢索時(shí)限為1988 年1 月至2021 年8 月，發(fā)現(xiàn)隨著組織工程的發(fā)展，間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）對(duì)修復(fù)軟骨有良好的長(zhǎng)期效果，其中脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（ADSCs）易于獲取，為骨關(guān)節(jié)炎的治療提供了新選擇?，F(xiàn)將ADSCs 治療骨關(guān)節(jié)炎的研究進(jìn)展綜述如下。

1 來(lái)源及特點(diǎn)

1.1 分離培養(yǎng)

脂肪組織一直被認(rèn)為是一種惰性組織。通常在吸脂術(shù)后作為手術(shù)廢物丟棄，但它和骨髓一樣源于中胚層，具有多能性，可分化為多種細(xì)胞譜系［5］。經(jīng)典提取方式為酶解法，用膠原酶消化人體成熟脂肪組織，再離心、過(guò)濾，清洗后得到血管基質(zhì)組分（SVF）［6］。2001 年，ZUK 等［7］首次鑒定了SVF，發(fā)現(xiàn)其中包含ADSCs、內(nèi)皮細(xì)胞、紅細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核－巨噬細(xì)胞、周細(xì)胞等成分，通過(guò)體外培養(yǎng)后可從中分離出ADSCs。盡管提取方法多樣，但操作流程大致相同，差異主要在于洗滌次數(shù)、酶濃度、離心參數(shù)、紅細(xì)胞溶解方法、過(guò)濾和最終培養(yǎng)條件［8］。近年來(lái)，許多企業(yè)開(kāi)始研發(fā)非酶法細(xì)胞分離系統(tǒng)，通過(guò)超聲和機(jī)械力對(duì)脂肪進(jìn)行微碎，在不使用酶的情況下，既能沖洗掉雜質(zhì)，又能完整保留SVF［9］。

1.2 特點(diǎn)

ADSCs 源于脂肪組織，呈紡錘體形態(tài)，表現(xiàn)為成纖維細(xì)胞樣生長(zhǎng)，體外培養(yǎng)可穩(wěn)定增殖。主要表達(dá)（超過(guò)80% ）CD13，CD29，CD44，CD73，CD90，CD105，極少表達(dá)（低于2% ）CD31，CD45，CD235a［10］。全能或多能干細(xì)胞表達(dá)的CD177也可見(jiàn)于ADSCs，表明ADSCs 具有分化為成骨、成軟骨和成脂肪細(xì)胞的能力。利用組織學(xué)染色和特異性生物標(biāo)志物可鑒別ADSCs 的分化方向（見(jiàn)表1）。ADSCs的多方向分化潛能使其在心血管疾病、糖尿病、炎性腸病、整形美容醫(yī)學(xué)等多領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注。作為組織工程的熱門(mén)種子細(xì)胞，ADSCs 治療骨關(guān)節(jié)炎在近年一直是各方關(guān)注的焦點(diǎn)。截至 2021 年 8 月，在 Clinicaltrials.gov 上登記的“脂肪來(lái)源干細(xì)胞”相關(guān)臨床試驗(yàn)共有291 條，關(guān)于肌肉骨骼疾病的研究占第1 位，其中絕大部分與骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)。針對(duì)骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制的研究主要集中于軟骨損傷、關(guān)節(jié)力學(xué)、細(xì)胞因子等方面。目前的研究認(rèn)為，ADSCs 主要通過(guò)修復(fù)軟骨損傷、免疫調(diào)節(jié)和旁分泌途徑改善關(guān)節(jié)腔內(nèi)微環(huán)境來(lái)治療骨關(guān)節(jié)炎。

表1 ADSCs 分化方向的鑒定方法Tab.1 The way to identify the differentiation potential of ADSCs

2 骨關(guān)節(jié)炎治療作用機(jī)制

2.1 修復(fù)軟骨損傷

軟骨細(xì)胞是關(guān)節(jié)軟骨中唯一的細(xì)胞形式，散在分布于主要由Ⅱ型膠原搭建而成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中，與細(xì)胞外基質(zhì)共同構(gòu)成關(guān)節(jié)軟骨［16］。由于關(guān)節(jié)軟骨中細(xì)胞外基質(zhì)占比高，且缺乏血液供應(yīng)，自我修復(fù)能力很差。當(dāng)解剖學(xué)異常、年齡［17］、運(yùn)動(dòng)負(fù)荷、創(chuàng)傷等因素導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨損傷時(shí)，藥物很難通過(guò)血液循環(huán)進(jìn)入。1994 年，BRITTBERG 等［18］對(duì)23 例可能進(jìn)展為骨關(guān)節(jié)炎的膝關(guān)節(jié)深部軟骨缺損患者行自體軟骨細(xì)胞移植治療，證實(shí)培養(yǎng)自體細(xì)胞生成的透明軟骨組織可用于修復(fù)膝關(guān)節(jié)深層軟骨缺損，改善臨床癥狀，為利用自體細(xì)胞形成軟骨特性修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨提供了思路。

大量體外試驗(yàn)證實(shí)，ADSCs 在軟骨誘導(dǎo)液的誘導(dǎo)下可分化為軟骨細(xì)胞，并穩(wěn)定增殖，直接向關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射ADSCs、體外預(yù)處理或聯(lián)用支架／媒介混懸液均可促使ADSCs 向軟骨分化，減輕骨關(guān)節(jié)炎癥狀。相比于誘導(dǎo)液培養(yǎng)法，軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)法、外源性生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)液培養(yǎng)法、基因修飾等方法誘導(dǎo)效果更佳。周君等［19］通過(guò)膝關(guān)節(jié)前交叉韌帶離斷法建立了大鼠骨關(guān)節(jié)炎模型，從同種異體雄性SD 大鼠腹膜脂肪組織中分離出ADSCs 后直接注射入膝關(guān)節(jié)，結(jié)果治療組Ⅱ型膠原蛋白的表達(dá)水平明顯上調(diào)，滑膜增生減輕，骨贅形成和軟骨破壞均減少，證明可通過(guò)關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射ADSCs，抑制軟骨損傷來(lái)延緩骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)程。VAN PHAM 等［20］在移植 ADSCs 的小鼠模型中觀察到新軟骨的形成；但LI 等［21］僅觀察到ADSCs 組較對(duì)照組骨關(guān)節(jié)炎軟骨退變明顯減輕，兩組均未發(fā)現(xiàn)新軟骨形成，考慮與骨關(guān)節(jié)炎模型和治療時(shí)間差異相關(guān)。

2.2 免疫調(diào)節(jié)與抗炎作用

絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）、核因子－κB（NF － κB）、Wnt／β －catenin 信號(hào)通路是骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病中的主要信號(hào)通路，白細(xì)胞介素（IL）－1β 是關(guān)鍵細(xì)胞因子。年齡、機(jī)械制動(dòng)、運(yùn)動(dòng)磨損、體質(zhì)量、外傷等多因素使 IL －1β 上調(diào)，腫瘤壞死因子（TNF）－α 和 IL －1 等炎性遞質(zhì)產(chǎn)生［16］，促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）家族表達(dá)，形成關(guān)節(jié)軟骨炎癥，使軟骨降解酶表達(dá)活躍，軟骨細(xì)胞分解增加，細(xì)胞外基質(zhì)生成減少［22］。同時(shí)，由于軟骨細(xì)胞自我修復(fù)能力差，導(dǎo)致軟骨受損鈣化，軟骨下骨形成，出現(xiàn)骨關(guān)節(jié)炎［23］。IL － 1β 還可促使前列腺素 E2和一氧化氮過(guò)表達(dá)而加重骨關(guān)節(jié)炎［22］。細(xì)胞因子促進(jìn)蛋白酶和血漿酶原激活因子產(chǎn)生，加速軟骨機(jī)制破壞［24］和微晶體形成，使軟骨基質(zhì)分解、代謝，導(dǎo)致關(guān)節(jié)滑膜炎性反應(yīng)，進(jìn)而發(fā)生骨關(guān)節(jié)炎［25］。

ADSCs 體外培養(yǎng)液可通過(guò)NF－κB 信號(hào)通路抑制IL－1β 生成，將淫羊藿苷干預(yù)的ADSCs 注入膝關(guān)節(jié)腔，同樣發(fā)現(xiàn)TNF－α、IL－1、一氧化氮等炎性因子水平降低，關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡被抑制［26］。將ADSCs 和骨關(guān)節(jié)炎的軟骨細(xì)胞、滑膜細(xì)胞共同培養(yǎng)，可抑制IL－1，IL－6，TNF － α 等炎性因子產(chǎn)生［27］。ADSCs 還可通過(guò)直接分泌抗炎因子IL－10，IL－1 受體拮抗劑等抑制炎癥發(fā)生，或促進(jìn)有免疫抑制作用的CD4＋FOXP3＋T help 細(xì)胞生長(zhǎng)，間接使IL－10 分泌增加［28］。滑膜巨噬細(xì)胞與骨關(guān)節(jié)炎發(fā)展較密切，ADSCs 作用于滑膜巨噬細(xì)胞使其活化被抑制，炎性因子分泌減少，起到調(diào)節(jié)免疫功能的作用［29］。

2.3 旁分泌作用

LEE 等［30］發(fā)現(xiàn)，ADSCs 會(huì)向病變或缺血位置遷移，這種現(xiàn)象稱(chēng)為“歸巢”。KATSHA 等［31］認(rèn)為，ADSCs 注入體內(nèi)后，導(dǎo)致歸巢現(xiàn)象的原因不明，在受損組織中分化的效率很低，甚至并不直接作用受損處。LI 等［21］認(rèn)為，ADSCs 通過(guò)旁分泌途徑影響關(guān)節(jié)腔內(nèi)的微環(huán)境，分泌各種可溶性和不可溶性細(xì)胞因子、趨化因子和生長(zhǎng)因子，介導(dǎo)軟骨細(xì)胞的抗炎、抗纖維化、抗凋亡和營(yíng)養(yǎng)效應(yīng)。

外泌體是一種細(xì)胞外囊泡，攜帶大量活性物質(zhì)，通過(guò)內(nèi)吞－融合－外排方式釋放，作用于其他靶細(xì)胞。HAN 等［32］在 ADSCs 體外培養(yǎng)上清液中找到平均直徑為90 nm 的圓形或橢圓形膜囊，且外泌體特異性生物標(biāo)志物CD63和熱休克蛋白－70 呈陽(yáng)性，證實(shí)其為外泌體。ADSCs產(chǎn)生的外泌體（ADSCs－Exos）主要通過(guò)豐富的miRNA促進(jìn)軟骨修復(fù)，還可減輕炎性反應(yīng)，保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨。

3 臨床應(yīng)用

ADSCs 無(wú)論是單獨(dú)注射還是協(xié)同治療的臨床療效和影像學(xué)改善效果均顯著。不良反應(yīng)方面，抽脂術(shù)并發(fā)癥發(fā)生率極低，1 項(xiàng)全國(guó)性調(diào)查報(bào)道為 0.1%［33］。多中心研究分析，經(jīng)干細(xì)胞治療（包括骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和ADSCs）患者，不良事件的發(fā)生率為12.1%（以疼痛和膝關(guān)節(jié)腫脹為主），嚴(yán)重不良事件發(fā)生率為1.5%（包括腫瘤、神經(jīng)和血管事件），其中腫瘤的發(fā)生率為 0.3%［34］。這些臨床研究提示，ADSCs 治療骨關(guān)節(jié)炎有良好的臨床應(yīng)用前景，且安全性高，但注射劑量尚無(wú)固定標(biāo)準(zhǔn)。同時(shí)，手術(shù)醫(yī)師水平、生物輔助劑的使用及未展開(kāi)大規(guī)模臨床試驗(yàn)，使ADSCs 的臨床療效評(píng)價(jià)存在一定局限性。詳見(jiàn)表2。

表2 ADSCs 治療骨關(guān)節(jié)炎的臨床研究Tab.2 Clinical studies of ADSCs in the treatment of osteoarthritis

4 優(yōu)勢(shì)與不足

相較于骨髓來(lái)源的MSC，ADSCs 具有取材方便、制備簡(jiǎn)單、干細(xì)胞產(chǎn)量高、免疫原性較低、致畸和致瘤性低等優(yōu)點(diǎn)［41］。不足之處：1）沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)化的分離、提取操作流程；2）細(xì)胞來(lái)源的不可預(yù)測(cè)性；3）無(wú)法抑制機(jī)械因素，可能需要長(zhǎng)期反復(fù)注射；4）現(xiàn)有臨床試驗(yàn)多停留在Ⅰ期，且多數(shù)未嚴(yán)格遵循空白對(duì)照試驗(yàn)法，盲法設(shè)計(jì)上存在對(duì)受試者開(kāi)放的情況，可信度較低［42］，同時(shí)缺乏劑量療效試驗(yàn)，難以指導(dǎo)后續(xù)臨床應(yīng)用ADSCs 的合理用量。

目前，骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病呈現(xiàn)出低齡化趨勢(shì)。由于就診率低，很多患者在第1 次就診時(shí)就已達(dá)到中／重度，嚴(yán)重影響生活質(zhì)量，也為國(guó)家醫(yī)療資源增加負(fù)擔(dān)。ADSCs 的出現(xiàn)使修復(fù)損傷組織、抑制疾病進(jìn)展成為可能，其具體作用機(jī)制、遠(yuǎn)期療效、潛在的免疫風(fēng)險(xiǎn)尚不明確，應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)研究，為臨床應(yīng)用提供詳盡的科學(xué)依據(jù)。