循環(huán)miR-155、PDCD4水平與急性心肌梗死患者PCI術(shù)后冠脈無復(fù)流的關(guān)系

蘇偉，肖暖，楊金鳳

急性心肌梗死（AMI）是由冠狀動脈（冠脈）斑塊破裂或血管痙攣引起的冠脈血管急性、持續(xù)性閉塞而使心肌組織缺血缺氧導(dǎo)致，是世界范圍內(nèi)主要因病死亡原因，發(fā)病率呈逐年上升趨勢[1]。目前經(jīng)皮冠脈介入治療（PCI）被認(rèn)為是治療AMI最安全有效的恢復(fù)再灌注的手段，但PCI術(shù)后冠脈無復(fù)流情況時有發(fā)生，發(fā)生率約5%～25%[2,3]，給患者預(yù)后及生活質(zhì)量帶來了嚴(yán)重影響。尋找有效生物學(xué)指標(biāo)早期診斷、早期預(yù)防及治療AMI患者PCI術(shù)后冠脈無復(fù)流的發(fā)生，仍是臨床研究熱點(diǎn)。目前PCI術(shù)后冠脈無復(fù)流發(fā)生機(jī)制尚未明確，研究發(fā)現(xiàn)，無復(fù)流與心肌細(xì)胞微血管痙攣、血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷及血管炎性反應(yīng)有關(guān)[4]。微小RNA（miRNA）是一類含多個核苷酸的內(nèi)源性非編碼小RNA，其通過抑調(diào)控靶基因的表達(dá)參與疾病的病理過程[5]。miR-155是miRNAs家族一員，在多種炎癥疾病（如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、動脈粥樣硬化等）中表達(dá)上調(diào)[6]。朱江等[7]研究發(fā)現(xiàn)，AMI后心力衰竭（心衰）患者血清miR-155水平顯著高于健康對照組，且提示其與血管內(nèi)皮損傷有關(guān)。程序性細(xì)胞死亡因子4（PDCD4）是新確定的一種抑癌基因，在炎癥疾病中作用尚不明確，有研究報道，PDCD4缺失可減少小鼠動脈粥樣硬化斑塊中脂質(zhì)沉積，進(jìn)而減少動脈粥樣硬化斑塊形成[8]。目前有關(guān)miR-155、PDCD4在動脈粥樣硬化中的水平研究較多，而有關(guān)二者與AMI患者PCI術(shù)后冠脈無復(fù)流的關(guān)系研究鮮有報道，因此本研究分析循環(huán)miR-155、PDCD4水平與急性心肌梗死患者PCI術(shù)后冠脈無復(fù)流的關(guān)系，以期為臨床探尋早期診斷、預(yù)防及治療AMI患者PCI術(shù)后冠脈無復(fù)流發(fā)生的可靠生物學(xué)靶標(biāo)提供參考。

1 資料與方法

1.1 研究對象回顧性分析2018年8月～2020年9月于河北大學(xué)附屬醫(yī)院急診科診斷為AMI行急診PCI的患者477例為研究對象，其中男性248例，女性229例，年齡40～80歲，平均年齡（60.00±9.85）歲?；颊呔凑?012年《經(jīng)皮冠狀動脈介入治療指南（簡本）》[9]行PCI治療（胸痛發(fā)作12 h內(nèi)），術(shù)后12 h內(nèi)按造影結(jié)果，參照心肌梗死溶栓治療臨床試驗（TIMI）血流分級[10]，分為無復(fù)流組86例（0級＜TIMI≤2級），再灌注組391例（2級＜TIMI≤3級）。入選標(biāo)準(zhǔn)：①符合2015《急性心肌梗死診斷和治療指南》[11]修訂版中AMI相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)；②發(fā)病12 h內(nèi)行急診PCI治療者；③持續(xù)胸痛＞30 min；④臨床基線數(shù)據(jù)完整者；⑤自愿參與并配合研究者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①手術(shù)禁忌癥患者；②合并嚴(yán)重感染、免疫系統(tǒng)疾病、嚴(yán)重肝臟及腎功能不全、惡性腫瘤者；③急腹癥、夾層動脈瘤等患者；④妊娠、哺乳期患者。本研究經(jīng)我院倫理委員會批準(zhǔn)，研究對象均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑與儀器TRIzol試劑（貨號：S30876）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（貨號：NGB-54415）、實(shí)時熒光定量PCR（qRT-PCR）試劑盒（貨號：638315）購自上海北諾生物科技有限公司；miR-155、PDCD4及內(nèi)參U6、GADPH引物由上海生工生物工程有限公司合成；紫外分光光度計（型號：NanoDrop One-w）購自北京智杰方遠(yuǎn)科技有限公司，qRT-PCR分析儀（型號：SLAN-96P）購自購自日本Olympus公司。

1.3 研究方法

1.3.1 一般資料收集患者的一般資料，包括性別、年齡、體質(zhì)指數(shù)（BMI）、吸煙史、飲酒史、高血壓史、糖尿病史、卒中史等；臨床血常規(guī)基線資料，主要包括白細(xì)胞值（WBC）、中性粒細(xì)胞值（N）、淋巴細(xì)胞值（L）、中性粒細(xì)胞/淋巴細(xì)胞比值（N/L）；入院次日晨起空腹檢測生化指標(biāo)，主要包括總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（γ-GGT）、白蛋白（ALB）、尿酸（UA）、前白蛋白（PA）。

1.3.2 樣品采集采集患者術(shù)后8 h外周靜脈血5 ml于肝素抗凝管中，離心5 min（3000 r/min，離心半徑8 cm），分離得到血漿，于-80 ℃冰箱待用。

1.3.3 qRT-PCR法測定血漿miR-155、PDCD4 mRNA表達(dá)水平從-80℃冰箱中取出血漿樣本，按照RNA試劑盒說明書提取總RNA，參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。參照實(shí)時熒光定量PCR試劑盒說明進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR反應(yīng)，所用引物序列見表1。反應(yīng)體系為20 μl：SYBR Premix 10 μl，cDNA 1 μl，H2O 8 μl，上下游引物各0.5 μl。反應(yīng)程序：95℃預(yù)處理20 s；95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 10 s，共40個循環(huán)。以U6、GADPH作為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計算受試者血漿miR-155、PDCD4 mRNA相對表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計量資料以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料用例數(shù)及百分比表示，組間比較采用χ2檢驗；采用Pearson法分析血漿miR-155與PDCD4水平相關(guān)性；以AMI患者PCI術(shù)后是否發(fā)生冠脈無復(fù)流為因變量，以單因素分析具有統(tǒng)計學(xué)意義因素為自變量進(jìn)行多因素Logistic回歸分析，回歸方法采用進(jìn)入法，效應(yīng)值用OR值及其95%CI值；繪制受試者工作特征曲線（ROC）分析血漿miR-155、PDCD4水平對AMI患者PCI術(shù)后冠脈無復(fù)流的診斷價值。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者一般資料比較兩組患者在年齡、性別、BMI、吸煙史、飲酒史、糖尿病、卒中基線資料及L、TG、TC、HDL、ALB、UA、PA等實(shí)驗室指標(biāo)比較中差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；無復(fù)流組患者在WBC、N、N/L、LDL、γ-GGT水平比較中明顯高于再灌注組患者（P＜0.05），表2。

2.2 無復(fù)流組與再灌注組患者血漿miR-155/U6、PDCD4 mRNA水平比較與再灌注組患者比較，無復(fù)流組患者血漿miR-155/U6、PDCD4 mRNA水平均明顯升高（P＜0.05），表3。

表3 無復(fù)流組與再灌注組患者循環(huán)miR-155/U6、PDCD4 mRNA水平比較

2.3 pearson法分析血漿miR-155、PDCD4水平相關(guān)性分析如圖1所示，生物信息學(xué)預(yù)測（miRanda網(wǎng)站）顯示，miR-155、PDCD4存在結(jié)合位點(diǎn)。pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，AMI患者血漿miR-155與PDCD4 mRNA水平呈正相關(guān)（r=0.561，P＜0.05），圖2。

圖1 血漿miR-155、PDCD4預(yù)測結(jié)合位點(diǎn)

圖2 血漿miR-155/U6、PDCD4 mRNA水平相關(guān)性分析

2.4 多因素Logistic回歸分析AMI患者PCI術(shù)后冠脈無復(fù)流的影響因素以AMI患者PCI術(shù)后是否發(fā)生冠脈無復(fù)流為因變量，排除性別、年齡等混雜因素后，以WBC、N、N/L、LDL、γ-GGT、循環(huán)miR-155/U6、PDCD4 mRNA水平等上述差異有統(tǒng)計學(xué)意義的因素為自變量，進(jìn)行多因素Logistic回歸分析。結(jié)果顯示，循環(huán)miR-155/U6、PDCD4 mRNA水平高表達(dá)是AMI患者PCI術(shù)后發(fā)生冠脈無復(fù)流的獨(dú)立危險因素（P＜0.05），表4。

表4 AMI患者PCI術(shù)后冠脈無復(fù)流的影響因素分析

2.5 循環(huán)miR-155、PDCD4水平對AMI患者PCI術(shù)后冠脈無復(fù)流的診斷價值分析循環(huán)miR-155水平診斷急性心肌梗死患者PCI術(shù)后冠脈無復(fù)流AUC為0.812（95%CI：0.756～0.863），截斷值為2.91，其靈敏度、特異度分別為66.9%、79.1%；PDCD4 mRNA診斷急性心肌梗死患者PCI術(shù)后冠脈無復(fù)流的AUC為0.866（95%CI：0.756～0.863），截斷值為0.75，其靈敏度、特異度分別為77.6%、87.9%；兩者聯(lián)合診斷的AUC為0.937（95%CI：0.901～0.936），其靈敏度、特異度分別為83.5%、89.7%（圖3）。

圖3 循環(huán)miR-155、PDCD4水平診斷AMI患者PCI術(shù)后冠脈無復(fù)流的ROC曲線

3 討論

隨著社會發(fā)展、現(xiàn)代生活節(jié)奏加快、人們生活水平提高及飲食習(xí)慣的改變，我國AMI發(fā)病率呈逐年升高趨勢，AMI是臨床常見急危重癥，在發(fā)達(dá)國家被稱為“頭號殺手”[12,13]。急診PCI手術(shù)是治療AMI主要手段之一，PCI技術(shù)的成熟與改進(jìn)使得AMI患者遠(yuǎn)期預(yù)后及生存率均有較大改善，但術(shù)后約5%～25%患者發(fā)生冠脈無復(fù)流現(xiàn)象，其是由冠脈閉塞導(dǎo)致血氧供應(yīng)中斷，經(jīng)手術(shù)重建血運(yùn)時，梗死部位心肌組織無法出現(xiàn)血液灌注的情況，嚴(yán)重影響患者院內(nèi)不良事件及近遠(yuǎn)期預(yù)后[14,15]。但目前臨床仍缺乏對PCI術(shù)后冠脈無復(fù)流早期準(zhǔn)確診斷疾病病情評估的可靠生物學(xué)指標(biāo)。本研究分析循環(huán)miR-155、PDCD4水平與AMI患者PCI術(shù)后冠脈無復(fù)流的關(guān)系，以期為尋找早期診斷PCI術(shù)后冠脈無復(fù)流發(fā)生的可靠生物標(biāo)志物，及早干預(yù)改善預(yù)后提供一定借鑒。

本研究首先比較患者一般資料，結(jié)果顯示無復(fù)流組患者在WBC、N、N/L、LDL、γ-GGT水平比較中明顯高于再灌注組患者。γ-GGT屬于氧化應(yīng)激標(biāo)志物[16]，因此一般資料表明與再灌注良好者比較，冠脈無復(fù)流患者入院時炎癥狀態(tài)，應(yīng)激反應(yīng)等均處于更高水平，機(jī)體受到更強(qiáng)打擊。研究證實(shí)，巨噬細(xì)胞中過量脂質(zhì)沉積導(dǎo)致巨噬細(xì)胞泡沫化，進(jìn)一步促進(jìn)動脈粥樣硬化等慢性炎癥疾病的發(fā)生發(fā)展，且由巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷及炎性反應(yīng)與心肌無復(fù)流關(guān)系密切[17]。miR-155是典型的多功能miRNA，位于人類21號染色體，大量研究表明其在細(xì)胞分化、免疫、血管炎癥反應(yīng)等方面發(fā)揮作用，可促進(jìn)巨噬細(xì)胞對脂質(zhì)的攝取，導(dǎo)致巨噬細(xì)胞脂質(zhì)沉積[18]。有研究報道，抑制miR-155表達(dá)水平可減弱心肌梗死巨噬細(xì)胞極化和依賴于SOCS1/NF-κB途徑的炎癥反應(yīng)，從而減弱心肌梗死引起的交感神經(jīng)重塑和室性心律失常[19]。本研究結(jié)果顯示，無復(fù)流組患者血漿miR-155/U6水平明顯高于再灌注組患者。與既往研究結(jié)果一致，提示miR-155異常高表達(dá)與AMI患者PCI術(shù)后冠脈無復(fù)流的發(fā)生有關(guān)。

PDCD4是一種抑癌基因，也是一種由巨噬細(xì)胞分泌的典型炎性介質(zhì)，可激活Toll樣受體4（TLR4）信號通路，促進(jìn)巨噬細(xì)胞脂質(zhì)沉積，從而促進(jìn)動脈粥樣硬化斑塊形成[20]。肖靜等[21]研究發(fā)現(xiàn)，抑制心臟干細(xì)胞PDCD4表達(dá)水平可明顯減少心肌細(xì)胞凋亡，為臨床治療心肌梗死提供新方向。本研究結(jié)果顯示，無復(fù)流組患者血漿PDCD4水平明顯高于再灌注組患者。與肖靜等研究結(jié)果趨勢一致，提示血漿PDCD4異常高表達(dá)可能與AMI患者PCI術(shù)后冠脈無復(fù)流發(fā)生關(guān)系密切。有學(xué)者在動物實(shí)驗研究中發(fā)現(xiàn)，miR-155可通過正性調(diào)控其靶基因PDCD4，從而過度激活血管炎癥反應(yīng)，加重冠脈粥樣硬化性病變[22]。本研究生物信息學(xué)預(yù)測（miRanda網(wǎng)站）顯示，miR-155、PDCD4存在結(jié)合位點(diǎn)且AMI患者血漿miR-155/U6與PDCD4 mRNA水平呈正相關(guān)。提示血漿miR-155、PDCD4可能發(fā)揮正向調(diào)控作用共同參與AMI患者PCI術(shù)后冠脈無復(fù)流發(fā)生，在重建血運(yùn)時，心肌梗死部位心肌組織無法出現(xiàn)血液灌注的具體機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。本研究進(jìn)一步分析顯示，血漿miR-155/U6、PDCD4 mRNA水平高表達(dá)均是AMI患者PCI術(shù)后發(fā)生冠脈無復(fù)流的獨(dú)立危險因素，提示miR-155、PDCD4高表達(dá)AMI患者發(fā)生PCI術(shù)后冠脈無復(fù)流風(fēng)險較大，對此類患者在治療和術(shù)后恢復(fù)中應(yīng)給予更多關(guān)注。基于血漿miR-155、PDCD4在PCI術(shù)后發(fā)生冠脈無復(fù)流患者中異常高表達(dá)，推測二者對PCI術(shù)后發(fā)生冠脈無復(fù)流有一定診斷價值，進(jìn)一步ROC分析結(jié)果顯示，miR-155、PDCD4診斷AMI患者PCI術(shù)后冠脈無復(fù)流的AUC分別為0.812、0.866，兩者聯(lián)合診斷的AUC為0.937。說明miR-155、PDCD4聯(lián)合檢測對AMI患者PCI術(shù)后冠脈無復(fù)流有較高診斷價值，可為臨床提供一定參考。

綜上所述，血漿miR-155、PDCD4水平異常高表達(dá)可能與AMI患者PCI術(shù)后冠脈無復(fù)流發(fā)生有關(guān)，二者聯(lián)合檢測對AMI患者PCI術(shù)后冠脈無復(fù)流有較高診斷效能，可為臨床早期評估患者PCI術(shù)后冠脈無復(fù)流并采取及早采取措施進(jìn)行改善有一定意義。而本研究并未對血漿miR-155、PDCD4與PCI術(shù)后冠脈無復(fù)流發(fā)生的具體作用機(jī)制進(jìn)行探討，后期應(yīng)進(jìn)行深入闡述。