LncRNA MALAT1、miR-155在心力衰竭患者血清中的表達及與心功能的相關性

王自豪，李素娟，宋曉光，張南南，侯艷艷

慢性心力衰竭（CHF）是由炎癥、心臟負荷過重、心肌病、心肌梗死等引發(fā)的心肌損傷疾病，可導致心肌結構與功能發(fā)生變化，預后差[1,2]。因此，發(fā)現(xiàn)與CHF病理發(fā)展相關機制對及時診治CHF、改善患者心功能尤其重要。目前研究顯示，CHF與自噬、炎癥反應、信號轉(zhuǎn)導、微小RNA（miRNA）、長鏈非編碼RNA（LncRNA）等相關[3,4]。近期研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA肺腺癌轉(zhuǎn)移相關轉(zhuǎn)錄本1 （LncRNA MALAT1）在急性心肌梗死（AMI）患者中表達上調(diào)，其有望成為診斷AMI的潛在標志物[5]；另外，微小RNA-155（miR-155）在冠狀動脈粥樣硬化性心臟病（冠心?。┗颊哐逯兴捷^低，其可能通過調(diào)節(jié)免疫炎癥反應進而影響冠心病發(fā)病進程[6]；且LncRNA MALAT1可通過調(diào)節(jié)miR-155相關途徑進而影響動脈粥樣硬化病變的進展[7]。但LncRNA MALAT1在CHF中的表達水平與miR-155、心功能的關系報道較少。因此，本研究旨在通過測定CHF患者血清中LncRNA MALAT1、miR-155表達水平，分析兩者間及兩者與心功能指標的相關性。

1 資料與方法

1.1 研究對象選取2018年9月～2019年10月收治的CHF患者103例進行研究（CHF組），其中男性55例，女性48例，年齡48～75（60.15±8.93）歲；將CHF患者按美國紐約心臟病學會（NYHA）分級將其分為Ⅱ級組（44例）、Ⅲ級組（32例）、Ⅳ級組（27例）；基礎疾病：原發(fā)性高血壓（35例）、擴張型心肌病（10例）、冠心病（58例）。選取同期體檢健康者40例行對照研究（健康組），其中男性23例，女性17例，年齡48～75歲，平均年齡（59.98±8.85）歲，無高血壓、肝腎功能障礙、高脂血癥及心臟器質(zhì)性疾病。診斷標準：依據(jù)《中國心力衰竭診斷和治療指南2018》CHF相關判定標準進行診斷[8]。納入標準：患者符合CHF診斷標準，結合超聲心動圖、實驗室檢查、臨床癥狀確診；患者自愿參與本次研究及治療，檢查資料完整。排除標準：合并肺栓塞、糖尿病、急性心肌梗死、腫瘤、急性心肌炎者；合并癡呆、免疫功能障礙、先天性心臟病者；合并肥厚性心肌病、肝腎功能不全、限制性心肌病、嚴重感染者；用藥依從性差者?；颊呒凹覍俸炇鹬橥鈺?，本研究經(jīng)我院倫理委員會批準。

1.2 治療方法CHF患者入院后給予常規(guī)抗CHF治療，包括β受體阻滯劑、鹽皮質(zhì)激素受體拮抗劑、血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑等，依據(jù)患者情況給予利尿劑、硝酸鹽類、洋地黃類藥物。

1.3 研究方法

1.3.1 樣本收集收集受試者外周血5～6 ml，靜置30 min，分離血清（4900 r/min，離心7 min），分裝，-70℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）法檢測血清LncRNA MALAT1、miR-155水平凍融適量血清，應用TRIzol? LS Reagent（Invitrogen）提取總RNA，之后采用TaqMan? MicroRNA Reverse Transcription Kit或High Capacity RNA-to-cDNA? Kit（Invitrogen）獲取cDNA，最后，利用TaqMan?Universal PCR Master Mix（Invitrogen）/SYBR Green Realtime PCR Master Mix（TOYOBO）制備反應體系后，使用熒光定量PCR儀（ABI公司）進行擴增、檢測。LncRNA MALAT1、miR-155及其內(nèi)參GAPDH、U6引物序列見表1，以2-△△CT法計算兩者相對表達量。

表1 LncRNA MALAT1、GAPDH、miR-155、U6的引物序列

1.3.3 心功能及心室重構指標檢查CHF患者入院后，健康者體檢應用彩色多普勒超聲診斷儀（IE33型，飛利浦，探頭頻率為2.0～3.5 MHZ）測定心功能指標，掃描心電圖（標準為左心室腱索水平），記錄左室舒張末期內(nèi)徑（LVEDD），計算左室射血分數(shù)（LVEF）。

1.3.4 隨訪CHF患者出院后，以電話或門診復查方式對其隨訪1年，按CHF患者轉(zhuǎn)歸分為預后良好亞組（存活且未復發(fā)者74例）和預后不良亞組（死亡/因再次發(fā)生心臟不良事件入院者）29例。

1.4 統(tǒng)計學方法采用SPSS 22.0軟件分析數(shù)據(jù)。計量資料采用均數(shù)±標準差以（）表示，組間比較行獨立樣本t檢驗，三組比較行單因素方差分析，多重比較行SNK-q檢驗；CHF患者血清LncRNA MALAT1、miR-155表達水平與心功能指標的相關性，及血清LncRNA MALAT1表達水平與miR-155的相關性采用Pearson法分析；血清LncRNA MALAT1、miR-155表達水平對CHF患者預后的評估價值采用受試者工作特征（ROC）曲線評估。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 健康組、CHF組血清LncRNA MALAT1、miR-155表達水平及心功能指標比較與健康組相比，CHF組患者血清LncRNA MALAT1表達水平、LVEDD水平均明顯升高（P＜0.05），血清miR-155表達水平及LVEF水平明顯降低（P＜0.05），表2。

表2 健康組、CHF組血清LncRNA MALAT1、miR-155表達水平及心功能指標比較

2.2 不同NYHA分級CHF患者血清LncRNA MALAT1、miR-155表達水平及心功能指標比較與Ⅱ級組比較，Ⅲ級組、Ⅳ級組CHF患者血清LncRNA MALAT1表達水平、LVEDD水平均明顯升高（P＜0.05），血清miR-155表達水平及LVEF水平明顯降低（P＜0.05）；與Ⅲ級組比較，Ⅳ級組CHF患者血清LncRNA MALAT1表達水平、LVEDD水平均明顯升高（P＜0.05），血清miR-155表達水平及LVEF水平明顯降低（P＜0.05），表3。

表3 不同NYHA分級CHF患者血清LncRNA MALAT1、miR-155表達水平及心功能指標比較

2.3 CHF患者血清LncRNA MALAT1、miR-155表達水平與心功能指標的相關性Pearson法分析顯示，CHF患者血清LncRNA MALAT1表達水平與LVEF呈負相關（P＜0.05），與LVEDD呈正相關（P＜0.05）；血清miR-155表達水平與LVEF呈正相關（P＜0.05），與LVEDD呈負相關（P＜0.05），表4。

表4 CHF患者血清LncRNA MALAT1、miR-155表達水平與心功能指標的相關性

2.4 CHF患者血清LncRNA MALAT1表達水平與miR-155的相關性Pearson法分析顯示，CHF患者血清LncRNA MALAT1表達水平與miR-155呈負相關（r=-0.479，P＜0.05），圖1。

圖1 CHF 患者血清LncRNA MALAT1表達水平與miR-155相關性

2.5 不同預后CHF患者血清LncRNA MALAT1、miR-155水平比較與預后良好亞組相比，預后不良亞組CHF患者血清LncRNA MALAT1表達水平明顯升高（P＜0.05），miR-155表達水平明顯降低（P＜0.05），表5。

表5 不同預后CHF患者血清LncRNA MALAT1、miR-155水平比較

2.6 血清LncRNA MALAT1、miR-155水平對CHF患者預后的評估價值ROC曲線顯示，血清LncRNA MALAT1表達水平預測CHF患者不良預后的曲線下面積（AUC）為0.895（95%CI：0.824～0.967），截斷值為2.09，此時其敏感度、特異度分別為89.7%、79.7%，約登指數(shù)為0.694；血清miR-155水平預測CHF患者不良預后的AUC為0.854（95%CI：0.733～0.935），截斷值為0.43，敏感度、特異度分別為89.7%、81.1%，約登指數(shù)為0.708；血清LncRNA MALAT1、miR-155聯(lián)合預測CHF患者不良預后的AUC為0.937（95%CI：0.889～0.985），敏感度、特異度分別為86.2%、91.9%，約登指數(shù)為0.781（圖2）。

圖2 血清LncRNA MALAT1、miR-155對CHF患者不良預后預測的ROC曲線評價

3 討論

CHF以體液潴留、乏力、運動耐力下降、呼吸困難為常見癥狀，其是各類心臟疾病患者致死結局及原因，威脅患者健康[9,10]。因此，積極尋找與CHF發(fā)病相關的因素，及早干預，對改善CHF患者生存質(zhì)量有一定積極意義。LncRNA是長度＞200個核苷酸的一類非編碼RNA，其在免疫調(diào)節(jié)、自噬、機體發(fā)育、炎癥反應、細胞生長、信號轉(zhuǎn)導等過程中起關鍵調(diào)控作用，與AMI、動脈粥樣硬化、CHF等關系密切[11,12]。研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA MALAT1在AMI大鼠中呈高表達，沉默LncRNA MALAT1可明顯改善AMI大鼠的心功能，且其有輔助診斷AMI的潛在價值[5,13]；另外，LncRNA MALAT1在冠心病患者中表達水平升高，敲除LncRNA MALAT1可通過調(diào)節(jié)自噬，增加細胞活力，抑制細胞凋亡進而抑制冠心病病情進展，可作為診斷CHF的有效指標[14,15]。研究表明，LncRNA MALAT1表達水平異常升高可能與CHF相關疾病密切相關。本研究中CHF患者血清LncRNA MALAT1表達水平明顯高于健康者，且其水平隨NYHA分級升高而呈升高趨勢，提示LncRNA MALAT1可能在CHF發(fā)生發(fā)展中起重要調(diào)控作用，檢測血清LncRNA MALAT1表達水平有助于臨床評估CHF患者病情嚴重程度，分析原因，LncRNA MALAT1作為LncRNA成員之一，其過表達可能通過調(diào)控相關基因異常表達，影響自噬、炎癥反應等，進而在CHF病變中發(fā)揮作用，但其具體機制有待進一步驗證。

miRNA是一類非編碼小RNA分子，其可調(diào)控氧化應激、炎癥反應、機體發(fā)育、自噬、免疫功能，與冠心病、CHF等顯著相關[16,17]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-155在冠心病患者中呈低表達，其可輔助評估患者病變程度[18]；另外，miR-155在CHF中水平降低，其可能靶向調(diào)節(jié)有關基因，進而調(diào)節(jié)心肌細胞活力及凋亡，可能在CHF中具有重要作用[19]。本研究顯示，CHF患者血清miR-155表達水平明顯低于健康者，與Li等[19]研究相似，NYHA分級越高，血清miR-155表達水平越低，提示miR-155可能在CHF病理發(fā)展中發(fā)揮重要作用，檢測血清miR-155表達水平有利于臨床判定CHF患者病情進展程度，推測miR-155作為miRNA成員之一，可能通過調(diào)節(jié)靶基因表達，影響信號轉(zhuǎn)導、自噬、炎癥反應等過程，進而在CHF發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用，其作用機制仍需深入探究。

LVEF、LVEDD是評估心功能的重要指標，本研究中CHF患者LVEDD水平明顯高于健康者，LVEF水平明顯低于健康者，并且NYHA分級越高，LVEDD水平越高，LVEF水平越低，與陳俊沖等[20]研究趨勢一致，提示CHF患者存在心功能損傷，且病情越嚴重，心功能受損越嚴重。本研究中CHF患者血清LncRNA MALAT1表達水平與LVEF，及血清miR-155表達水平與LVEDD呈負相關；血清LncRNA MALAT1表達水平與LVEDD，及血清miR-155表達水平與LVEF呈正相關，提示血清LncRNA MALAT1水平升高、miR-155水平降低，心功能減弱，兩者均可能與心功能有關。進一步研究顯示，CHF患者血清LncRNA MALAT1表達水平與miR-155呈負相關，提示LncRNA MALAT1可能與miR-155相互影響，進而共同影響CHF發(fā)生發(fā)展，但其機制有待深入探討。

本研究還探討了LncRNA MALAT1、miR-155對CHF患者預后的作用，結果顯示，預后不良亞組CHF患者血清LncRNA MALAT1表達水平明顯高于預后良好亞組，miR-155表達水平明顯低于預后良好亞組，且血清LncRNA MALAT1、miR-155表達水平預測CHF患者不良預后的AUC分別為0.895、0.854，當血清LncRNA MALAT1表達水平＞2.09、miR-155＜0.43時，CHF患者發(fā)生不良預后風險較高，提示LncRNA MALAT1、miR-155與CHF患者預后相關，且兩者對CHF患者預后均有一定預測效能；LncRNA MALAT1、miR-155聯(lián)合預測CHF患者不良預后的AUC為0.937，其敏感度為86.2%，特異度為91.9%，提示LncRNA MALAT1、miR-155聯(lián)合檢測對CHF患者預后的評估價值較高，有助于判定CHF患者預后。

綜上所述，CHF患者血清LncRNA MALAT1表達水平升高，miR-155水平降低，兩者均與心功能及預后相關，兩者聯(lián)合可提高對CHF患者預后的預測價值，可更好地評估CHF患者預后。但本研究未深入研究LncRNA MALAT1、miR-155在CHF中的作用機制，后期將結合基礎實驗進行探究。