豬人工授精實驗室操作規(guī)程

李 強(qiáng)

（四川省畜禽繁育改良總站，四川 成都 610041）

1 豬人工授精實驗室的環(huán)境要求

實驗室要求整潔、衛(wèi)生，每周要徹底清潔一次。

實驗室要求與采精室相鄰，實驗室應(yīng)分成干燥區(qū)和潮濕區(qū)，干燥區(qū)用于稀釋液的配制和精液的檢查、稀釋、分裝，潮濕區(qū)安放水槽，用于清洗器械等。實驗室內(nèi)最好安裝紫外線燈，每周至少對實驗室徹底消毒一次，下班時開啟，通宵照射。

2 豬人工授精實驗室設(shè)備要求

2.1 顯微鏡 其放大倍數(shù)可為100、400和 1000倍（油鏡），最好自帶光源、配備恒溫加熱板。

2.2 精子密度測定儀或血細(xì)胞計數(shù)器 能比較準(zhǔn)確地分析出原精密度，確定稀釋倍數(shù)。

2.3 電子臺稱 用于稱量精液質(zhì)量。

2.4 電子天平 稱量藥品配溶液用（精度達(dá)到0.01g）。

2.5 數(shù)顯恒溫水浴鍋 加熱精液稀釋液以及用于控制精液稀釋液的溫度。

2.6 17℃數(shù)顯恒溫精液保存箱波動范圍在±1℃，用于精液的存放。

2.7 數(shù)顯恒溫干燥箱和高溫滅菌鍋 用于實驗器皿的預(yù)熱和消毒。

2.8 雙重蒸餾水器 用于制備雙蒸水，稀釋液用水最好為3d內(nèi)制的新鮮蒸餾水。

2.9 量筒、燒杯 1000 mL、2000 mL各兩個，用于準(zhǔn)備稀釋液、稀釋精液以及將精液分裝到輸精瓶。

2.10 保溫瓶 各種不同的容器可用于采精，但重要的是要能保溫隔熱、能被消毒。

2.11 pH試紙或pH計 測量精液的pH值。

2.12 玻璃棒 稀釋精液攪拌用。

2.13 溫度計2支 分別用于測量精液和稀釋液的溫度。

2.14 其他 稀釋液配置和精液檢查必備的試劑及藥品、100～500 μL微量移液器及其配套吸頭、采精杯、消毒外科用紗布、輸精瓶（裝 100 mL）、浴巾（保溫用）、市售成品稀釋粉或一些配制精液稀釋液所用的藥品。

3 實驗室的準(zhǔn)備工作

3.1 器械的清洗和消毒 （最好采精前一天進(jìn)行）

3.1.1 洗滌 將采精杯，燒杯，量筒等玻璃器皿用洗衣粉或洗潔精清洗干凈，再用蒸餾水沖洗2次。

3.1.2 消毒 用錫紙包扎玻璃器皿的開口和金屬器械，放恒溫干燥箱中180℃干燥1h，也可和非耐熱器皿一起，用牛皮紙包好放高壓滅菌器中121℃，20 min濕熱滅菌；溫度計采用酒精棉球消毒；消毒過的器械使用前用稀釋液沖洗一遍。

3.2 采精前準(zhǔn)備工作

3.2.1 采精前2h，工作人員穿上實驗服，擦凈所有工作臺，保持室內(nèi)清潔。

3.2.2 用消毒外科紗布套好集精杯，將集精杯、載玻片、蓋玻片及稀釋用的玻棒、溫度計、燒杯等放入37℃恒溫干燥箱中預(yù)熱。

3.2.3 采精前1h，配制好稀釋液。

如用市場上出售的成品精液稀釋粉，則應(yīng)在采精前的1h將稀釋精液和雙蒸餾水按說明比例混勻。

3.2.4 打開水浴鍋，將溫度調(diào)至37℃，將配置好的稀釋液放入其中預(yù)熱。

3.2.5 準(zhǔn)備好顯微鏡，并將恒溫載物臺設(shè)定到37℃，將載玻片放在上面預(yù)熱。

3.2.6 準(zhǔn)備好電子臺秤、精液密度儀或血細(xì)胞計數(shù)器、微量移液器及其配套吸頭、簽字筆、記號筆、記錄本、蓋玻片等，稱量盛放精液的燒杯的質(zhì)量并記錄。

3.2.7 將預(yù)熱好的采精杯放入保溫瓶中，到采精室采精。

4 精液的品質(zhì)檢查

4.1 將采集的精液 （用采精杯采集） 從保溫瓶中取出，將用橡皮筋套住的過濾用紗布拿開，而后將精液輕輕地導(dǎo)人預(yù)熱好的燒杯中。

4.2 精液量（體積）測定 以電子臺秤稱量精液，按每克1 mL計，精液量（g）=（精子的質(zhì)量+盛放精液的燒杯的質(zhì)量）一盛放精液的杯子的質(zhì)量。避免以量筒等轉(zhuǎn)移精液盛放容器的方法測量精液的體積。

4.3 顏色 正常的精液是乳白色，呈云霧狀。精子密度越高。顏色越白，其透明度愈低。如呈灰白色或淺灰色，則表示精液密度低，且質(zhì)量不好。如帶有綠色或黃色是混有膿液或尿液，若帶有淡紅色或紅褐色是含有血液，表明精液中有炎癥物，這樣的精液應(yīng)舍棄不用。

4.4 氣味 一般正常精液無味或略帶有腥味。如果精液帶有惡臭味，應(yīng)廢棄不用。

4.5 pH值 （酸堿度） 以pH計或pH試紙測量。正常精液的pH值為6.8～7.8，呈中性或弱堿性。

4.6 精子活力檢查 檢查時，用微量移液器取精液一滴于顯微鏡載物臺恒溫加熱板上已預(yù)熱好的載玻片上，蓋上蓋玻片,由下至上調(diào)節(jié)顯微鏡物鏡，直至出現(xiàn)看到清晰精液。然后計算直線運(yùn)動的精子占總精子的比例。

4.7 精子密度檢查 指每毫升所含的精子數(shù)的多少，是確定精液稀釋倍數(shù)、評定精液品質(zhì)的重要指標(biāo)。要求用血細(xì)胞計數(shù)板或精液密度儀進(jìn)行測定。血細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)方法：以微量加樣器取具有代表性原精液100 μL，3%NaCl900 μL，混勻，稀釋 10 倍；血細(xì)胞記數(shù)室上放一蓋玻片，取1滴上述精液放入計數(shù)板槽中，靠虹吸將精液吸入計數(shù)室內(nèi)；在高倍鏡下計數(shù)5個中方格內(nèi)的精子總數(shù)，將該數(shù)乘以50萬，即得原精液每毫升的精子數(shù)（即精液密度）。精液密度儀使用參照其使用說明書。

精子密度也可采用估測法在顯微鏡下觀察，將精子分布情況分為密、中、稀三種。密：精子密集，精子間距離小于一個精子距離（每1mL 3億以上）；中：精子間能容納1～2個精子；稀：精子間距離很大，精子間能容納2個以上精子（每1mL約1億）。

4.8 精子畸形率檢查 畸形率即畸形精子占精子總數(shù)的百分率，一般要求畸形率不超過15%，要求每頭公豬每兩周檢查一次畸形率?；尉臃N類很多，包括巨型精子、短小精子、雙頭或雙尾精子、頂體膨脹或脫落、精子頭部殘缺或與尾部分離、尾部彎曲等。

4.9 認(rèn)真填寫精液品質(zhì)檢查登記表。

5 精液的稀釋

5.1 精液采集后應(yīng)盡快稀釋，原精液放置不能超過30min。

5.2 稀釋倍數(shù)的確定：活力≥0.7的精液，一般按每個輸精劑量含40億個有效精子，輸精量為80mL確定稀釋倍數(shù)。

5.3 品質(zhì)檢查不合格（活力0.7以下）的精液不能稀釋。稀釋時稀釋液要求與精液等溫，兩者溫度相差不能超過1℃，即稀釋液應(yīng)加熱至33～37℃，以精液溫度為標(biāo)準(zhǔn)，來調(diào)節(jié)稀釋液的溫度，不能反過來操作。

5.4 稀釋時，將稀釋液沿溫度計，玻璃棒或盛精液的杯(瓶)壁緩慢加入到精液中，然后輕輕搖動或用消毒玻璃棒沿一個方向緩慢攪拌，使其混合均勻。

5.5 高倍稀釋時，應(yīng)先進(jìn)行低倍稀釋（1∶1～2），稍待片刻后再將余下的稀釋液沿壁緩慢加入。

5.6 稀釋后要求靜置片刻再作精子活力檢查。如果稀釋前后精子活力一樣，即可進(jìn)行分裝與保存；如果活力下降，說明稀釋液的配置或稀釋操作有問題，不宜使用，應(yīng)查明原因并重新配置。

6 精液的常溫保存

6.1 精液稀釋后檢查精液活力，若無明顯下降，立刻按每頭份80mL分裝入瓶，盡量減少精液暴露于環(huán)境中的污染時間。

6.2 加蓋密封，在標(biāo)簽上寫清楚公豬的品種、耳號、采精日期（月、日、時），精液量、稀釋倍數(shù)、儲存溫度，良種補(bǔ)貼專用等。

6.3 放置22～25℃的室溫下1h后或用多層毛巾被包好后放置17℃冰箱中，讓其溫度緩慢下降，以免因溫度下降過快造成死精子數(shù)增多。

6.4 保存過程中要求每12h將精液混勻1次，每次搖動時，動作要輕緩均勻，同時觀察精液的色澤狀態(tài)，做好記錄，發(fā)現(xiàn)異常及時處理。

6.5 每天檢查精液保溫箱的溫度，若出現(xiàn)停電應(yīng)全面檢查貯存精液質(zhì)量。

注意：要盡量減少精液保存箱關(guān)開次數(shù)，以免造成對精子的打擊而導(dǎo)致精子死亡；

6.6 每次使用前應(yīng)對保存的精液進(jìn)行活力檢查，活力低于0.6的精液應(yīng)棄之不用。

6.7 稀釋后精液一般要求在3d內(nèi)用完，否則會影響使用效果。