Streptomyces sp.DJ菌株產(chǎn)生的角蛋白酶的序列分析

柯 野,楊家臣,屈奇奇,袁小枚,黃鏡如

(韶關(guān)學(xué)院英東生物與農(nóng)業(yè)學(xué)院，廣東 韶關(guān) 512005)

【研究意義】近年來，由于全球畜牧產(chǎn)業(yè)飛速發(fā)展，全球每年產(chǎn)生廢棄羽毛成千上萬噸[1]。羽毛富含角蛋白具有的獨特天然結(jié)構(gòu)，致使其難被降解，成為了蛋白資源廢棄物以及病源微生物滋生的污染物[2-3]。為了對廢棄羽毛的高值化開發(fā)利用、保護(hù)生態(tài)環(huán)境，分離、純化和篩選出羽毛高效降解微生物菌株成為了研究者關(guān)注的熱點。【前人研究進(jìn)展】從自然界分離獲得降解廢棄羽毛的微生物已經(jīng)超過30種，在細(xì)菌[2,4-6]、放線菌[7]和真菌[8-9]中均有分布。多數(shù)能降解羽毛的真菌同時也有致病性，這限制其應(yīng)用[10]，因此，多數(shù)研究集中在放線菌和細(xì)菌。目前所報道微生物對羽毛的降解能力有限，尚達(dá)不到工業(yè)化生產(chǎn)的水平。這主要由于當(dāng)羽毛粉濃度高于1.5%，微生物菌株產(chǎn)生的胞外蛋白酶被抑制，致使羽毛的降解效率下降[8]；如JAIN R等[7]發(fā)現(xiàn)StreptomycesexfoliatusCFS 1068菌株對0.5%濃度的羽毛降解率為96.6%，對2.0%羽毛粉的降解率僅為72.1%?！颈狙芯壳腥朦c】筆者在前期研究中分離篩選獲得一株S.sp.DJ菌株，該菌株在羽毛含量為5.0%的情況下，對羽毛的降解率高達(dá)50.0%；該DJ菌株對羽毛的降解率是現(xiàn)有文獻(xiàn)報道中對高羽毛濃度降解效果最好的菌株之一[11]?！緮M解決的關(guān)鍵問題】為了探究該菌株對羽毛高效降解的原因，預(yù)測分析羽毛降解的相關(guān)角蛋白酶基因及其酶結(jié)構(gòu)特征，采用二代高通量測序技術(shù)對S.sp.DJ菌株進(jìn)行全基因組測序，并將其基因組序列提交至美國國立生物基礎(chǔ)信息中心的Genbank數(shù)據(jù)庫中，獲得登錄號為PKSK00000000。進(jìn)一步對該基因組序列進(jìn)行了比對分析，深入分析其編碼分泌角蛋白酶的序列與結(jié)構(gòu)，以期能對Streptomycessp.DJ菌株高效降解羽毛的角蛋白酶機(jī)理提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌株來源 羽毛降解菌(Streptomycessp.) DJ菌株，是韶關(guān)學(xué)院的英東生物與農(nóng)業(yè)學(xué)院微生物學(xué)實驗室分離純化獲得的一株高效分解羽毛菌株，由本實驗室提供。

1.1.2 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基：酵母提取物0.5%，蛋白胨1.0%，NaCl 1.0%，pH 7.0左右。

1.1.3 試劑 酵母提取物、蛋白胨、瓊脂糖等購自生工生物工程(上海)股份有限公司，其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 試驗方法

1.2.1 DJ菌株的培養(yǎng)及其基因組DNA的提取 將DJ菌株接種于LB培養(yǎng)液中，37 ℃、180 r/min培養(yǎng)2～3 d后，1000 r/min離心5 min收集菌體，按照酵母DNA快速分離方法[11]，對DJ菌株的基因組DNA進(jìn)行提取，電泳鑒定基因組DNA質(zhì)量。

1.2.2 DJ菌株的基因組測序、組裝及其基因組注釋 將電泳鑒定合格后的基因組DNA 送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行全基因組測序。采用Illumina Hiseq 2500平臺對DJ菌株基因組進(jìn)行高通量測序，對測序的原始數(shù)據(jù)采用FastQC質(zhì)量評估后，利用Trimmomatic對數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量剪切，獲得相對準(zhǔn)確的有效數(shù)據(jù)后；利用SPAdes對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行拼裝，之后采用Kmer值進(jìn)行組裝，最終根據(jù)各Kmer值組裝獲得最佳的序列結(jié)果。將獲得DJ菌株的基因組序列提交至GenBank數(shù)據(jù)庫，根據(jù)NCBI網(wǎng)站提供的Prokaryotic GenomeAnnotation Pipeline注釋系統(tǒng)對基因功能進(jìn)行預(yù)測和注釋，同時也利用NCBI Blast+將基因蛋白序列與NT、NR、CDD、COG、GO、KEGG和TrEMBL等多個數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，進(jìn)一步確定注釋基因的結(jié)構(gòu)與功能。

1.2.3 DJ菌株角蛋白酶基因的序列分析 運用Bio-Edit 7.0軟件對基因和角蛋白酶的序列組成、比對等的分析，http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/的SignalP 5.0軟件和http://www.softberry.com中蛋白定位的ProtCompB 9.0軟件對酶定位分析，https://swissmodel.expasy.org/網(wǎng)站進(jìn)行同源建模以及模型評估，Discovery Studio 2.5軟件、VMD 1.9 軟件和DeepView軟件對角蛋白酶的結(jié)構(gòu)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 DJ菌株的基因組組成

采用SPAdes 3.5.0軟件對DJ菌株的高通量測序結(jié)果進(jìn)行拼接，獲得測序片段，最長為91 450 bp，平均片段長度為2540 bp，拼接獲得2058 個contigs，N50大小為3327 bp。進(jìn)一步利用GapFiller 1.11軟件對contig補(bǔ)GAP，采用PrInSeS-G 1.0.0軟件對序列矯正后，獲得完整的DJ菌株基因組序列，該序列全長5 225 166 bp，其中GC含量為72%，預(yù)測編碼5668個基因，基因序列占整個基因組序列72.65%，基因平均長度756.70 bp，將該全長序列提交到GenBank數(shù)據(jù)庫(登錄號PKSK00000000)。通過GenBank數(shù)據(jù)庫的基因注釋系統(tǒng)分析，DJ菌株基因組中共Genes (total) 5668個，CDS (total)5592個，其中CDS (coding) 為5338個，將每個CDS編碼的氨基酸序列與NT、NR、CDD、COG、GO、KEGG和TrEMBL等數(shù)據(jù)進(jìn)行比對，其中有4456個序列能被同源基因注釋分類。

2.2 確定角蛋白酶序列

根據(jù)DJ菌株基因組的注釋分類結(jié)果，在4456個基因中有42個基因是編碼蛋白酶的基因。由于DJ菌株是分泌胞外蛋白酶對羽毛進(jìn)行降解；因此，利用http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/的SignalP 5.0軟件和http://www.softberry.com中蛋白定位的ProtCompB 9.0軟件，對42個預(yù)測的蛋白酶分析可知，其中14個肽酶分泌到胞外，前期研究表明，DJ菌株分泌到胞外降解羽毛的蛋白酶主要為絲氨酸角蛋白酶[11]。在這14個分泌胞外的肽酶中有9個絲氨酸蛋白酶，即3個胰蛋白酶、2個類胰蛋白酶、4個類Subtilase；目前角蛋白酶一般都被歸類為subtilisin-like超家族(屬于絲氨酸蛋白酶，S8家族)，當(dāng)然并不是subtilisin-like超家族的蛋白酶都能降解角蛋白[12]，在這4個類Subtilase酶中，其中3個酶(GenBank數(shù)據(jù)庫的登錄號分別為：PLW69544.1、PLW71753.1和PLW71754.1)與已發(fā)現(xiàn)的角蛋白具有較高的序列同源性；因此，本論文僅對該3個角蛋白酶的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。

2.3 角蛋白酶的一級結(jié)構(gòu)分析

由表1可知，3種角蛋白酶的肽鏈長度差異顯著，最長為522 aa，最短為386 aa，相差高達(dá)136 aa，但是3種角蛋白酶肽鏈中含量最多為G和A，最少為W或C，肽鏈主要由疏水性的非極性氨基酸(A，V，L，I，F(xiàn)，W，M和P)和極性氨基酸(A，V，L，I，F(xiàn)，W，M和P)組成，占肽鏈總氨基酸殘基數(shù)83(mol，%)左右，而酸性和堿性氨基酸含量差異不大，都約占肽鏈氨基酸量的17(mol，%)左右。3種角蛋白酶的信號肽切割位點不完全一致(26或34)，3種角蛋白酶的前導(dǎo)肽長度均為71～78 aa，成熟肽長度均為274～278 aa，長度差異較小。

2.4 角蛋白酶的同源建模及其二級結(jié)構(gòu)分析

利用3種角蛋白酶的保守區(qū)域與來自MeiothermustaiwanensisWR-220的角蛋白酶(PDB數(shù)據(jù)庫code：5WSL.1.A)的氨基酸序列同源性高達(dá)60%以上[13]，根據(jù)同源性高于30%以上可建模的理論，這3種角蛋白酶以5WSL.1.A為模板進(jìn)行同源建模；利用Ramachandran軟件對建模的3種酶分別進(jìn)行模型的合理性評估，每種酶的肽鏈主鏈中φ角和ψ角均在合理范圍之內(nèi)，表明3種角蛋白酶的建模結(jié)構(gòu)合理，可用于酶結(jié)構(gòu)分析。

3種角蛋白酶3-D結(jié)構(gòu)序列在自身肽鏈位置如表1所示，而3種角蛋白酶及其模板(PDB code:5WSL.1.A)的序列比對及其二級結(jié)構(gòu)結(jié)果如圖1所示。將PLW69544.1、PLW71753.1和 PLW71754.1編碼的角蛋白酶分別命名為K1、K2和K3；對于3-D結(jié)構(gòu)中氨基酸殘基的編號，以序列比對中模板5WSL的第1個A氨基酸殘基的編號為1，往后殘基編號以此類推。由圖1可知，4種角蛋白酶包含α 螺旋6個、310α 螺旋2個和β折疊15個。4種角蛋白酶的催化三聯(lián)體D/H/S前后的氨基酸殘基均非常保守；為了確保酶的催化水解能力，雖然催化三聯(lián)體殘基在一級結(jié)構(gòu)上相距較遠(yuǎn)，但是通過空間結(jié)構(gòu)(即催化三聯(lián)體殘基分別位于第3個 β 折疊、第2個α螺旋和第6個α螺旋上)將3個殘基的距離靠近，以確保其催化水解功能。

2.5 二硫鍵、脯氨酸和鈣結(jié)合的分析

5wsl角蛋白酶中存在2個二硫鍵(C69～C101，C165～C196)，表明這2個二硫鍵有助于該酶的熱穩(wěn)定[13]。然而K1中2個二硫鍵位點均為C，表明K1中存在2個二硫鍵；而K2和K3中4個位點殘基分別為GG、DN、SS和GI，且其他位點均無C殘基，表明K2和K3中未有二硫鍵形成。

這4種酶的部分loop環(huán)中有脯氨酸殘基，如在270位點，4種酶都有脯氨酸殘基來穩(wěn)定loop結(jié)構(gòu)，而在含有242位點的loop環(huán)中，只有5wsl和K2酶具有脯氨酸殘基；因此，脯氨酸殘基維持loop環(huán)穩(wěn)定性的差異也可能導(dǎo)致4種酶具有不同熱定性。

表1 3種角蛋白酶的一級結(jié)構(gòu)分析

“→”表示β折疊,“”表示螺旋,“▲”表示催化位點 ‘→’ indicated β sheets,“”indicated helixes,‘▲’indicated catalytic sites圖1 3種角蛋白酶與M.taiwanensis角蛋白酶(PDB code:5WSL.1.A)的序列及其二級結(jié)構(gòu)分析Fig.1 Analysis of sequences and secondary structures of three kinds of keratinases and Meiothermus taiwan keratinase (PDB code：5WSL.1.A)

Ca2+對酶的正確折疊、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性以及熱穩(wěn)定的提高具有重要作用[14]。5WSL中有2個Ca2+結(jié)合，1Ca是V172和G175主鏈羰基O、T177的Oγ相結(jié)合，K1、K2和K3的172和175位點分別為A/V/V和A/A/A，雖然與模板的殘基不一致，但都有主鏈羰基O；177位點殘基分別為S/T/T，S殘基具有Oγ，與WSL T177的Oγ位置一致，表明K1、K2和K3都具有1Ca結(jié)合。5WSL中的2Ca對穩(wěn)定酶表面位于α1螺旋和β2折疊間的loop環(huán)具有作用；2Ca是D11和D14的Oδ1(分別相距Ca為2.322?和2.370?，D14的Oδ2與Ca相距3.634?，未能與Ca相結(jié)合)，D11和T23主鏈羰基O(分別相距Ca為2.475?和2.348?)，S21的Oγ以及Q15的Oε與Ca相結(jié)合(分別相距Ca為2.518?和2.268?)。在K1、K2和K3中，11、14和15位點為保守的D、D和Q；23位點分別為S/K/S，由于該位點主鏈羰基O與Ca結(jié)合，殘基保守性對Ca結(jié)合影響不大。21位點分別為S/D/N，K1和5WSL一致，表明K1有2Ca；對于K2酶，D殘基的Oδ具有2個O，Oδ1和Oδ2與Ca分別相距3.984?和5.371?，K3酶中N殘基的Oδ與Ca相距5.150O?，這表明K2和K3的21位點雖有O，但其與Ca相距遠(yuǎn)，不利于Ca結(jié)合；因此，在K2和K3酶中可能沒有2Ca。

2.6 酶表面電荷、底物結(jié)合區(qū)域的分析

由圖2可知，S4底物結(jié)合區(qū)域是由保守殘基序列104～107和132～136圍成的口袋形狀，139位點殘基位于口袋底部，99和110位點殘基位于口袋的底側(cè)。在104～107序列中，4種酶都有高度保守的S104G105殘基，106和107位點殘基的保守性較差。106位點的殘基側(cè)鏈基團(tuán)面向溶劑，未占S4空間；5wsl和K1是S殘基，K2和K3是T殘基，S和T殘基的側(cè)鏈僅相差一個甲基，該甲基占據(jù)空間較??；因此，該位點的殘基變化對S4影響不顯著。對107位點，5wsl、K2和K3分別是N、L和T殘基，這3個殘基側(cè)鏈基團(tuán)與136位點殘基連在一起圍成S4，該位點側(cè)鏈基團(tuán)越大，越利于擴(kuò)大S4，這導(dǎo)致3種酶的S4大小具有差異。在K1中，107位點為Y，Y殘基的側(cè)鏈苯環(huán)基團(tuán)直接進(jìn)入占據(jù)S4區(qū)域，與132～134構(gòu)成S4口袋，這導(dǎo)致該K1的S4明顯小于其他3種酶。在5wsl、K2和K3的S4底部是高度保守的139位點殘基L組成，而且在K1中，由于107位點殘基直接進(jìn)入S4形成口袋，導(dǎo)致其S1口袋顯著小于其他3種酶，其底部由110位點的I殘基構(gòu)成。

S3底物結(jié)合區(qū)域由保守G132和G103S104殘基構(gòu)成，無明顯口袋形狀，本區(qū)域容納底物P3位點的殘基主鏈，且底物P3位點的殘基側(cè)鏈朝向溶劑，未與S3進(jìn)行結(jié)合。

S2底物結(jié)合區(qū)域是一個“cleft”構(gòu)造，在4種酶中，構(gòu)成S2的重要殘基位點均高度保守，如G103和H72殘基位于S2側(cè)邊，L99、D39和T40殘基位于S2底部，N70位于S2的邊緣，其中D39和H72殘基為4種酶的活性位點殘基。

紅色表示正電荷氨基酸殘基，藍(lán)色表示負(fù)電荷殘基，不同的顏色表示不同的S1、S2、S3、S4和S2`底物結(jié)合區(qū)域。a:5wsl；b:K1角蛋白酶；c:K2角蛋白酶；d:K3角蛋白酶 Red indicated positive charged amino acid residues,blue indicated negative charge amino acid residues,different colors respectively indicated different substrate binding regions of S1,S2,S3,S4 and S2.a:5wsl；b:K1keratinase；c:K2keratinase；d:K3keratinase圖2 3種角蛋白酶與角蛋白酶(PDB code:5WSL.1.A)的底物結(jié)合區(qū)域比較Fig.2 Analysis of substrate binding region of three kinds of keratinases and M.taiwan keratinase (PDB code:5WSL.1.A)

S1底物結(jié)合區(qū)域具有明顯的口袋構(gòu)造，S1主要由殘基序列131～133、159～160以及167殘基圍成，其底部由高度保守A156構(gòu)成，底側(cè)部由高度保守的A157G158構(gòu)成。在131～133殘基序列中，5WSL、K1、K3是保守的LGG殘基，而K2是VGG殘基，L的側(cè)鏈比V多一個CH2基團(tuán)，但是L或V殘基的側(cè)鏈基團(tuán)朝向酶分子內(nèi)部，不占據(jù)S1口袋空間；雖然這兩個殘基不保守。但是并不影響S口袋構(gòu)造。在159～160殘基序列中，5WSL、K1、K3的159位點均為高度保守的N殘基， K2為S殘基；雖然S側(cè)鏈殘基比N殘基少NH2基團(tuán)，但是這兩種殘基的側(cè)鏈面向溶劑，雖然該位點殘基不保守，但對4種酶S1影響不顯著。對于160位點殘基，5WSL和K2是不帶電荷的S殘基，K1和K3為帶負(fù)電荷的D殘基，該位點殘基的大小相比較于帶電荷而言，帶電荷情況對酶的底物特異性具有較大的影響[15]；因此，K1、K3相對于5WSL、K2更偏向于P1帶正電荷的底物，更排斥P1帶負(fù)電荷的底物。167位點的殘基非常不保守，5WSL為F，K1和K3酶為Y，K2為S，對于F和Y殘基的側(cè)鏈有苯環(huán)基團(tuán)，猶如對S1口袋該了一個蓋子，而S側(cè)鏈無苯環(huán)，缺乏蓋子；因此，K2的S1具有更大的空間容納底物P1的側(cè)鏈。

S2`底物結(jié)合區(qū)域主要由159、190、221和222位點殘基形成。在S2`中，如對S1的分析，159位點的N或S殘基對S2`影響不大；對于190位點，為含有苯環(huán)側(cè)鏈基團(tuán)的Y(5wsl)或F(K1、K2和K3)殘基，正如多數(shù)subtilisin-like 超家族酶在該位點均為Y或者F殘基一樣，這個保守苯環(huán)側(cè)鏈基團(tuán)的取向決定了S2`的大小[16]。對于221和222位點，4種酶都分別是高度保守的S和G殘基構(gòu)成，為表現(xiàn)出任何差異。

3 討 論

蛋白質(zhì)一級序列結(jié)構(gòu)決定蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)，三維結(jié)構(gòu)決定蛋白質(zhì)空間構(gòu)象，對其功能起到至關(guān)重要的作用。本研究中DJ菌株產(chǎn)生3種角蛋白序列的信號肽、前導(dǎo)肽和成熟肽在氨基酸殘基組成、極性和長度等方面較為保守一致，其催化三聯(lián)體(D/H/S)均為IDTG/NGHGTHV/SGTSM(V)A的Motif結(jié)構(gòu)，表明3種酶屬于Subtilase超家族[16]，具有相似水解角蛋白能力；但是這3種角蛋白酶α螺旋、β折疊、特別是無規(guī)卷曲、loop環(huán)間的氨基酸殘基存在差異，以及與報道的其他角蛋白之間存在氨基酸殘基的取代、替換、刪除差異，導(dǎo)致其具有不同的底物肽鍵偏好性[17]。特別對于底物結(jié)合區(qū)域而言，氨基酸性質(zhì)、序列差異、空間結(jié)構(gòu)直接決定了其度底物肽鍵的選擇性，這主要是由于酶通過S4-S1和S2`底物結(jié)合區(qū)域與底物P4-P1和S2`殘基結(jié)合底物的側(cè)鏈與之形成氫鍵，穩(wěn)定底物分子后，活性位點殘基對底物發(fā)起親核攻擊，實現(xiàn)切斷裂底物分子達(dá)到酶解作用。這3種酶的底物結(jié)合區(qū)域形態(tài)構(gòu)造大體一致，主要由疏水性殘基構(gòu)成；這表明對疏水性底物具有更強(qiáng)的水解能力，而對親水性強(qiáng)的底物水解能力較弱，這種水解能力與其他報道結(jié)果一致[11]；對這幾種酶的S4-S1和S2`底物結(jié)合區(qū)域綜合分析而言，而這些酶S3、S2和S2`的重要構(gòu)成位點的氨基酸殘基非常保守，而在S1和S4中重要位點的氨基酸殘基保守性相對而言差一些，這也就直接體現(xiàn)出不同底物特異性。

在subtilisin-like超家族中，二硫鍵、脯氨酸和鈣離子結(jié)合的位點和數(shù)量是影響該類酶熱穩(wěn)定性的重要因素之一[18]。對于這類蛋白酶而言，一般天然自發(fā)形成的二硫鍵越多，熱穩(wěn)定性就越強(qiáng)；因此，K1熱穩(wěn)定性可能比K2和K3更強(qiáng)。蛋白質(zhì)表面loop環(huán)中的脯氨酸限制了環(huán)結(jié)構(gòu)的柔性，使之具有剛性，有助于高溫下保持適當(dāng)結(jié)構(gòu)，是保持其具有較強(qiáng)的熱定性因素之一；如aqualysin I的P5N、P240N、P7I和P268T突變體相對于野生型而言，熱穩(wěn)定性下降，特別是P7I和P268T突變體熱穩(wěn)定性顯著降低[19]；在這3種酶中，K2具有脯氨酸殘基，可能比K1和K3有更強(qiáng)的穩(wěn)定性。在subtilisin-like超家族存在2個Ca2+結(jié)合，大多數(shù)具有第一個強(qiáng)結(jié)合(1Ca)位點，部分酶有第二個弱結(jié)合(2Ca位)點[20-21]，K1具有1Ca和2Ca結(jié)合位點，而K2和K1只有1Ca結(jié)合位點，這表明K1可能具有更強(qiáng)的耐熱性。這些酶的耐熱性是二硫鍵、脯氨酸和鈣離子結(jié)合位點等多方面的綜合體現(xiàn)的結(jié)果，因此，可以對這些針對性強(qiáng)的位點進(jìn)行理性設(shè)計和改造，以提高其熱穩(wěn)定性[22]。

4 結(jié) 論

本論文對羽毛高效降解的Streptomycessp.DJ菌株進(jìn)行了全基因組的測序，通過對該基因組編碼的蛋白進(jìn)行預(yù)測分析，DJ菌株具有的高效降解羽毛的特性與其產(chǎn)生的3種角蛋白密切相關(guān)，這3種角蛋白酶的氨基酸殘基含量、長度等差異不大，均是活性殘基為D/H/S的胞外絲氨酸蛋白酶，并且3種酶的3-D結(jié)構(gòu)中主要由6個α 螺旋、2個310α 螺旋和15個β折疊構(gòu)成，3種酶中K1酶具有2個二硫鍵，2個Ca2+結(jié)合位點，而K2和K3具有1個二硫鍵，1個Ca2+結(jié)合位點；3種酶都具有含有Pro殘基的loop環(huán)，而在K2種含有這種loop環(huán)2個。3種酶都是主要偏向于對疏水性強(qiáng)的底物進(jìn)行水解，并且主要由S1和S4底物結(jié)合區(qū)域決定酶對底物水解的特異性，但是3種酶的S1和S底物結(jié)合區(qū)域重要位點的氨基酸殘基的不保守性，導(dǎo)致了3種酶對不同的底物特異性，這可能是DJ菌株分泌的3種酶對羽毛底物降解的互補(bǔ)性，導(dǎo)致對羽毛高效水解的重要因素之一。為了探究這些角蛋白酶對羽毛高效降解的機(jī)理，需進(jìn)一步對這些基因進(jìn)行克隆表達(dá)和定點突變，進(jìn)一步揭示其結(jié)構(gòu)與酶解機(jī)制。