基于類芬頓反應(yīng)的鋅摻雜碳量子點(diǎn)熒光探針測(cè)定過(guò)氧化氫和膽固醇

孫雪花，強(qiáng) 瑜，郝都婷，田 銳

(延安大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院 延安市綠色合成材料與化學(xué)安全檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 延安 716000)

1 引 言

碳量子點(diǎn)(Carbon quantum dots,CQDs)是一種新型零維碳納米材料，表面含有豐富的含氧官能團(tuán)，作為電子受體和電子給予體，在光電子學(xué)[1-2]、催化發(fā)光[3]以及傳感器[4-6]領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用。近年來(lái)，為了改變CQDs表面結(jié)構(gòu)單一、內(nèi)部電子傳遞性能較差的問(wèn)題，多采用表面功能化和雜原子摻雜的策略。但使用聚合物或有機(jī)小分子的表面功能化不能在特定分析中占據(jù)功能化位置[7]，而雜原子摻雜易于操作是改善CQDs的發(fā)光特性和電子結(jié)構(gòu)的更有利的方法。隨之金屬摻雜CQDs漸有出現(xiàn)，且能很好地提高CQDs的熒光量子產(chǎn)率。如Xu等[8]以錳摻雜首次成功合成了具有可逆切換藍(lán)色熒光的高光穩(wěn)定性Mn-CQDs，熒光量子產(chǎn)率高達(dá)54.4%。Yue等[9]采用水熱法制備的釕摻雜的CQDs具有20.79%的較高發(fā)光效率和高效的活性氧(Reactive oxygen species,ROS)生成。這是由于金屬不同的外層電子軌道能很好地調(diào)節(jié)CQDs的能帶結(jié)構(gòu)，作為CQDs的電子給體，促進(jìn)電子轉(zhuǎn)移，從而提高了CQDs的熒光量子產(chǎn)率。同時(shí)，研究還發(fā)現(xiàn)金屬摻雜的CQDs除了實(shí)現(xiàn)熒光量子產(chǎn)率提高和熒光調(diào)制，還具有一些新的物理化學(xué)性質(zhì)，如催化性能和弛豫性能。因此，合成并探究新型金屬摻雜CQDs的性能還是很有必要的。

過(guò)氧化氫(Hydrogen peroxide，H2O2)是一種典型的ROS，作為細(xì)胞周期內(nèi)的胞內(nèi)信使，起著至關(guān)重要的作用[10]。細(xì)胞內(nèi)H2O2的過(guò)量產(chǎn)生與多種疾病有關(guān)，如心血管疾病、阿爾茲海默病、神經(jīng)退行性疾病和各種癌癥。此外，人體中多種代謝物，如膽固醇、黃嘌呤、葡萄糖、乳糖、膽堿、L-賴氨酸、丙酮酸等，通過(guò)酶催化反應(yīng)會(huì)生成H2O2，而膽固醇(Cholesterol)的過(guò)量攝入可能導(dǎo)致心肌缺血、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化等疾病，因此，開發(fā)一種有效的工具來(lái)檢測(cè)H2O2并間接檢測(cè)膽固醇是十分有必要的。目前，H2O2和膽固醇的檢測(cè)方法有電解分析、高效液相色譜法和分光光度法等[11]。熒光分析法[12-13]由于響應(yīng)快、簡(jiǎn)單、靈敏被認(rèn)為是最有效的檢測(cè)手段，已有基于模擬酶活性[14]檢測(cè)H2O2和膽固醇含量的熒光分析法。但傳統(tǒng)的有機(jī)染料和半導(dǎo)體量子點(diǎn)等多種熒光染料在熒光分析中存在細(xì)胞相溶性差、水溶性低的缺點(diǎn)，因此具有易于合成、水溶性高、細(xì)胞毒性低、發(fā)光性能優(yōu)越等特點(diǎn)的CQDs備受關(guān)注。

本文以醋酸鋅作為金屬源，鹽酸乙二胺為絡(luò)合劑，檸檬酸為碳源，通過(guò)一步水熱法合成了發(fā)射峰位于428 nm的Zn-CQDs，熒光量子產(chǎn)率達(dá)到34%。基于Cu2+與H2O2構(gòu)成類芬頓體系產(chǎn)生羥基自由基進(jìn)一步猝滅Zn-CQDs的熒光強(qiáng)度，構(gòu)建了檢測(cè)H2O2含量的Zn-CQDs-Cu2+傳感器。此外，膽固醇在膽固醇氧化酶作用下可產(chǎn)生H2O2，因而可間接檢測(cè)膽固醇。這為參與H2O2生成反應(yīng)的代謝物(膽固醇，黃嘌呤，葡萄糖等)的檢測(cè)也提供了有效的方法。

2 實(shí) 驗(yàn)

2.1 主要儀器和試劑

UV-2550型紫外-可見(jiàn)吸收光譜儀(日本島津)；FLSP920型穩(wěn)態(tài)瞬態(tài)熒光光譜儀(英國(guó)愛(ài)丁堡)；LS-55型熒光分光光度計(jì)(美國(guó)珀金埃爾默)；IR Prestige-21傅里葉變換紅外光譜儀(日本島津)；ESCALAB 250XI 型 X 射線光電子能譜儀(美國(guó)賽默飛世爾科技)；XRD-7000 X粉末衍射儀(日本島津)；Tecnai G2 F20 S-Twin 型高分辨透射電子顯微鏡(美國(guó) FEI)。

膽固醇標(biāo)準(zhǔn)溶液：1.0×10-3moL/L，取0.019 g膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品(上海麥克林生化科技有限公司)用無(wú)水乙醇溶解定容至50 mL容量瓶。用時(shí)逐級(jí)稀釋。膽固醇氧化酶：0.5 mg/mL。HEPES(北京索萊寶科技有限公司)緩沖溶液：pH=7.60。過(guò)氧化氫、鹽酸乙二胺、膽固醇氧化酶(上海麥克林生化科技有限公司)。試劑級(jí)別均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

2.2 Zn-CQDs合成

準(zhǔn)確稱取0.66 g醋酸鋅、0.63 g檸檬酸和0.40 g鹽酸乙二胺置于燒杯中，加入30 mL水使其超聲溶解，將其轉(zhuǎn)移至50 mL的反應(yīng)釜中，在180 ℃下反應(yīng)6 h，冷卻至室溫后，將溶液以12 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min，除去沉淀，用濾膜(0.22 μm)過(guò)濾，在4 ℃下冷藏保存?zhèn)溆?。將濾液稀釋100倍得Zn-CQDs工作液。表征中將所得到的濾液進(jìn)行真空冷凍干燥得到Zn-CQDs固體樣品進(jìn)行測(cè)試。

2.3 過(guò)氧化氫熒光探針建立

于10 mL比色管中，加入HEPES緩沖溶液1.00 mL、稀釋100倍的Zn-CQDs溶液160 μL、0.1 mol/L Cu2+標(biāo)準(zhǔn)溶液2.50 mL、適量的H2O2溶液。在50 ℃下孵育40 min后，于λex=340 nm和λem=428 nm 處測(cè)定體系的熒光強(qiáng)度F以及試劑空白溶液的熒光強(qiáng)度F0，狹縫寬度均為5 nm。

2.4 膽固醇熒光探針建立

在2.3同樣體系Zn-CQDs-Cu2+中加入100 μL膽固醇氧化酶、適量膽固醇標(biāo)準(zhǔn)溶液，于50 ℃下孵育40 min后，在λex=340 nm和λem=428 nm 下測(cè)定體系的熒光強(qiáng)度F以及試劑空白溶液的熒光強(qiáng)度F0，狹縫寬度均為5 nm。

3 結(jié)果與討論

3.1 Zn-CQDs結(jié)構(gòu)表征

3.1.1 透射電鏡

通過(guò)高分辨率透射電鏡分析合成的Zn-CQDs的尺寸和形貌。由圖1(a)可看出Zn-CQDs呈現(xiàn)球形，粒徑均一，尺寸規(guī)則，單分散性能較好。插圖中清晰的晶格條紋間距為0.32 nm。從圖1(b)看出Zn-CQDs尺寸主要分布在1.0～3.0 nm范圍內(nèi)，平均尺寸為2 nm左右，顆粒度較小。

圖1 Zn-CQDs的透射電鏡圖(插圖為高分辨透射電鏡圖)(a)及粒徑分布圖(b)Fig.1 TEM image of Zn-CQDs(inset is high-resolution TEM image)(a)and the particle size distribution images of Zn-CQDs(b)

3.1.2 X 射線粉末衍射

粉末衍射能很好地確定物質(zhì)的晶體結(jié)構(gòu)以及結(jié)晶度，如圖2所示。Zn-CQDs的X射線粉末衍射圖分別在2θ=27.54°、2θ=51.15° 兩處有明顯的衍射峰，歸為碳的特征衍射峰，表明所制備的Zn-CQDs具有良好的結(jié)晶度。

圖2 Zn-CQDs的X射線粉末衍射圖Fig.2 XRD spectrum of Zn-CQDs

3.1.3 紅外光譜

圖 3 Zn-CQDs及CQDs的紅外光譜Fig.3 FT-IR spectra of Zn-CQDs and CQDs

3.1.4 X射線電子能譜

圖4 Zn-CQDs 的XPS全譜(a)、Zn 2p 譜(b)、C 1s譜(c)、O 1s 譜(d)及N 1s(e)。Fig.4 (a)XPS spectrum of Zn-CQDs full spectrum.(b)Zn 2p spectrum.(c)C 1s spectra.(d)O 1s spectra.(e)N 1s spectra.

3.1.5 Zn-CQDs的光學(xué)性能

圖5 (a)不同激發(fā)波長(zhǎng)下Zn-CQDs的熒光光譜；(b)Zn-CQDs紫外吸收和熒光光譜(插圖：在紫外線和自然光下的照片)。Fig.5 (a)Fluorescence spectra of Zn-CQDs at different excitated wavelength.(b)UV-Vis absorption spectrum and the fluorescence spectra of Zn-CDs(Insets:photographs under UV light and natural light).

3.1.6 熒光量子產(chǎn)率

以硫酸奎寧為參比物[15]，在340 nm相同激發(fā)波長(zhǎng)下，檢測(cè)待測(cè)物(u)與參比物(s)的熒光強(qiáng)度和該波長(zhǎng)激發(fā)光的吸光度，利用公式(1)計(jì)算得到Zn-CQDs的熒光量子產(chǎn)率(Yu)為34%，未摻雜CQDs熒光量子產(chǎn)率為2.6%(表1)。說(shuō)明金屬摻雜大大提高了碳量子點(diǎn)的熒光量子產(chǎn)率。

表1 Zn-CQDs熒光量子產(chǎn)率Tab.1 Fluorescence quantum yield of Zn-CQDs

(1)

其中，Y表示物質(zhì)的熒光量子產(chǎn)率，F(xiàn)表示物質(zhì)的熒光強(qiáng)度，A表示物質(zhì)的吸光度。

3.2 H2O2測(cè)定體系構(gòu)建

基于Cu2+與H2O2的類芬頓反應(yīng)產(chǎn)生的高活性·OH有效猝滅Zn-CQDs熒光而建立了測(cè)定H2O2和生成H2O2的代謝物(如膽固醇，黃嘌呤，葡萄糖等)的體系。如圖6(a)所示，發(fā)現(xiàn)相同濃度的Zn-CQDs與未摻雜CQDs都在最大激發(fā)波長(zhǎng)340 nm激發(fā)下于428 nm處有強(qiáng)發(fā)射，但Zn-CQDs的激發(fā)與發(fā)射強(qiáng)度更強(qiáng)。H2O2本身對(duì)Zn-CQDs與CQDs熒光幾乎沒(méi)有作用，Cu2+對(duì)Zn-CQDs熒光有一定的猝滅作用[16]，對(duì)未摻雜CQDs也具有猝滅效果。但當(dāng)加入H2O2后，Zn-CQDs-Cu2+-H2O2體系的猝滅效果明顯大于CQDs-Cu2+-H2O2體系。由圖6(b)發(fā)現(xiàn)，Cu2+加入前后Zn-CQDs紫外吸收光譜并無(wú)變化，說(shuō)明Cu2+與Zn-CQDs表面的—OH、—COOH、—NH等基團(tuán)發(fā)生電荷轉(zhuǎn)移僅改變了Zn-CQDs激發(fā)態(tài)的能量，產(chǎn)生動(dòng)態(tài)猝滅作用。但當(dāng)同時(shí)加入Cu2+與H2O2后，Zn-CQDs的熒光顯著降低(圖6(a))，推斷是Cu2+與H2O2發(fā)生芬頓反應(yīng)產(chǎn)生高活性的·OH所致。由于亞甲基藍(lán)(MB)分子中有一個(gè)中間價(jià)態(tài)的硫原子對(duì)·OH有高度親和性[17]，因此發(fā)現(xiàn)當(dāng)加入1.00 mL 1.0×10-4mol/L亞甲基藍(lán)于體系中時(shí)，原MB在664 nm的最大吸收有明顯降低(圖6(b)曲線6)，體系的熒光強(qiáng)度恢復(fù)10%(圖6(a)中曲線6)，極可能是Cu2+和H2O2產(chǎn)生的·OH被亞甲基藍(lán)捕獲，導(dǎo)致體系熒光有一定恢復(fù)，然而亞甲基藍(lán)對(duì)Zn-CQDs本身有抑制作用導(dǎo)致恢復(fù)能力較弱。由此推理得出該反應(yīng)機(jī)理如圖7。

圖6 不同Zn-CQDs體系的熒光光譜(a)與紫外-可見(jiàn)吸收光譜(b)Fig.6 Fluorescence(a)and UV-visible absorption(b)for different Zn-CQDs systems

圖7 體系反應(yīng)機(jī)理圖Fig.7 System reaction mechanism diagram

采用FLSP920穩(wěn)態(tài)瞬態(tài)熒光光譜儀測(cè)定 Zn-CQDs、Zn-CQDs+Cu2+體系和 Zn-CQDs+Cu2++H2O2體系的熒光衰減曲線(圖8)和加權(quán)平均熒光壽命(表2)。其平均熒光壽命分別為8.20，15.13，6.80 ns。Zn-CQDs和Zn-CQDs+Cu2+熒光壽命比值τ1/τ2=0.54；Zn-CQDs+Cu2+體系和Zn-CQDs+Cu2++H2O2體系的熒光壽命比值τ2/τ3=2.23，說(shuō)明Cu2+對(duì) Zn-CQDs 的熒光猝滅以及 Cu2+/H2O2產(chǎn)生的·OH 對(duì)Zn-CQDs 的熒光猝滅過(guò)程都為動(dòng)態(tài)猝滅。且根據(jù)文獻(xiàn)[18]可知，Cu2+與H2O2發(fā)生類芬頓反應(yīng)產(chǎn)生的·OH促使 Zn-CQDs 的熒光發(fā)生動(dòng)態(tài)猝滅一致。

表2 熒光壽命對(duì)照表Tab.2 Fluorescence lifetime comparison table

圖8 Zn-CQDs(a)、Zn-CQDs+Cu2+(b)、Zn-CQDs+Cu2++H2O2(c)的熒光衰減曲線。Fig.8 Fluorescence decay curves of Zn-CQDs(a)，Zn-CQDs+Cu2+(b)，Zn-CQDs+Cu2++H2O2(c).

3.3 反應(yīng)體系條件優(yōu)化

3.3.1 pH優(yōu)化

考察了酸堿度及緩沖種類(HEPES，巴比妥鈉，Trics-HCl，BR，磷酸氫二鈉-檸檬酸，PBS)對(duì)體系測(cè)定的影響。結(jié)果如圖9所示，酸度在6.8～8.0之間時(shí)，體系的熒光猝滅性能最強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)選擇pH=7.60 HEPES緩沖溶液，由于Cu2+與H2O2作用對(duì)Zn-CQDs的猝滅達(dá)到最優(yōu)狀態(tài)。

圖9 pH值對(duì)Zn-CQDs-Cu2+體系熒光強(qiáng)度的影響Fig.9 Effect of the pH on the fluorescence intensity of the Zn-CQDs-Cu2+ system

3.3.2 Cu2+量的優(yōu)化

體系加入不同體積0.01 mol/L Cu2+溶液，結(jié)果如圖10所示。發(fā)現(xiàn)隨著Cu2+用量的增加，體系熒光猝滅強(qiáng)度逐漸增大，在1.00～2.50 mL之間時(shí)達(dá)到最優(yōu)。當(dāng)Cu2+濃度太大時(shí)，催化產(chǎn)生羥基自由基的反應(yīng)受到限制，體系熒光猝滅程度顯著下降。體系選擇加入0.01 mol/L Cu2+溶液2.50 mL。

圖10 Cu2+的量對(duì)Zn-CQDs-Cu2+體系熒光強(qiáng)度的影響Fig.10 Effect of the amount of Cu2+on the fluorescence intensity of the Zn-CQDs-Cu2+ system

3.3.3 Zn-CQDs的量?jī)?yōu)化

考察了稀釋100倍的不同體積的Zn-CQDs對(duì)體系熒光強(qiáng)度的影響。從圖11發(fā)現(xiàn)，隨著Zn-CQDs的用量增加，體系熒光猝滅程度顯著增強(qiáng)，在0.16 mL時(shí)達(dá)到最佳。隨著Zn-CQDs濃度的持續(xù)增加，可能是Zn-CQDs自身出現(xiàn)團(tuán)聚，導(dǎo)致體系熒光猝滅受到影響。故本實(shí)驗(yàn)選取0.16 mL為最佳用量。

圖11 Zn-CQDs的量對(duì)Zn-CQDs-Cu2+體系熒光強(qiáng)度的影響Fig.11 Effect of the amount of Zn-CQDs on the fluorescence intensity of the Zn-CQDs-Cu2+ system

3.3.4 反應(yīng)時(shí)間及溫度優(yōu)化

反應(yīng)時(shí)間及反應(yīng)溫度對(duì)體系的影響至關(guān)重要。本實(shí)驗(yàn)分別考察了不同反應(yīng)時(shí)間(0～120 min)及不同反應(yīng)溫度(30～90 ℃)對(duì)體系的影響。如圖12，可知體系在50 ℃ 孵化40 min后逐步趨于穩(wěn)定。

圖12 Zn-CQDs-Cu2+體系反應(yīng)時(shí)間(a)與反應(yīng)溫度(b)Fig.12 Response time(a)and temperature(b)of the Zn-CQDs-Cu2+ system

3.3.5 共存物質(zhì)及干擾

圖13 干擾物質(zhì)對(duì)Zn-CQDs-Cu2+體系的影響Fig.13 Influence of interfering substances on the Zn-CQDs-Cu2+ system

3.3.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線

按照實(shí)驗(yàn)方法，在最佳實(shí)驗(yàn)條件下測(cè)定H2O2和膽固醇，結(jié)果如圖14 所示。從圖14(a)發(fā)現(xiàn)體系(F0-F)/F0與 H2O2濃度在 1.0×10-5～1.0×10-6mol/L 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，圖14(b)顯示線性方程為(F0-F)/F0=1.26×104c+6.16×10-4，r為0.994 7，檢出限(3S0/S)達(dá)到7.2×10-7mol/L；圖14(c)中體系(F0-F)/F0與膽固醇濃度在3.0×10-5～9.0×10-7mol/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，圖14(d)顯示線性方程為(F0-F)/F0=1.38×104c+0.04，r為0.992 4，檢出限為 6.8×10-7mol/L。

圖14 H2O2濃度的熒光光譜(a)和線性關(guān)系(b)；膽固醇濃度的熒光光譜(c)和線性關(guān)系(d)。Fig.14 Fluorescence spectra(a)and linear relationship(b)for H2O2 concentration.Fluorescence spectra(c)and linear relationship(d)for cholesterol concentration.

3.4 樣品檢測(cè)及回收率

為考察過(guò)氧化氫體系的實(shí)用性，以延河水為模擬水樣經(jīng)過(guò)濾處理之后，在最佳實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行測(cè)試并做加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。結(jié)果如表3所示，H2O2的回收率在98.55%～105.4%，表明該體系可用于實(shí)際樣品的檢測(cè)。

表3 延河水中過(guò)氧化氫的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)(n=3)Tab.3 Standard addition and recovery experiment of H2O2 in Yan He River samples(n=3)

將超市購(gòu)買的伊利純牛奶分別從3袋中取5.00 mL于離心管中，加入25 mL(乙腈∶水=84∶16)提取液，漩渦混勻1.0 min，振蕩2～3次并超聲提取20 min，取出于10 000 r/min離心機(jī)上離心5 min，分別取上清液10 μL在最佳實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行測(cè)試，并進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。結(jié)果如表4所示，該方法檢測(cè)牛奶中膽固醇總含量平均值為15.03 mg/100 g，與劉等[19]采用CuNCs比色法檢測(cè)牛奶中膽固醇含量平均值13.46 mg/100 g結(jié)果相近。該方法對(duì)實(shí)際樣品的檢測(cè)回收率為98.00%～103.0%，RSD≤3.8%，結(jié)果滿意。與文獻(xiàn)方法比較，如表5，在低濃度范圍內(nèi)靈敏度更高。

表4 牛奶樣品中膽固醇的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)(n=3)Tab.4 Standard addition and recovery experiment of cholesterol in milk samples(n=3)

表5 不同牛奶中膽固醇檢測(cè)方法的比較Tab.5 Comparison of cholesterol detection methods in different milk

4 結(jié) 論

本研究引入金屬源，通過(guò)水熱法一步合成了具有良好穩(wěn)定性和高熒光強(qiáng)度的Zn-CQDs?；贑u2+與H2O2構(gòu)成類芬頓體系產(chǎn)生羥基自由基可進(jìn)一步猝滅Zn-CQDs熒光強(qiáng)度，建立了類Fenton體系的Zn-CQDs熒光探針用于H2O2和有H2O2生成的反應(yīng)代謝物的測(cè)定。該方法用于牛奶中膽固醇的測(cè)定，具有較好的實(shí)用價(jià)值。