多指標(biāo)權(quán)重-響應(yīng)面法優(yōu)化葆腎1 號(hào)配制工藝研究

賈立波，卞振華（通訊作者）

（南京中醫(yī)藥大學(xué)無(wú)錫附屬醫(yī)院藥學(xué)部 江蘇 無(wú)錫 214071）

葆腎1 號(hào)方為我院腎內(nèi)科臨床實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)方，在繼承前輩江蘇省名中醫(yī)徐南甲、藍(lán)華生主任在“脾虛”、“濕熱傷腎”理論的基礎(chǔ)上，提出了“腎絡(luò)不固”是早中期慢性腎炎的基本病理機(jī)制，以益腎固絡(luò)法治療慢性腎炎，葆腎方是以益腎固絡(luò)法治療早中期慢性腎炎的基本方[1]，具有益腎和絡(luò)、扶正祛邪、脾腎兼顧之功?；诒痉皆诙嗄甑呐R床使用中具有較好的療效，未見不良反應(yīng)，擬研發(fā)為院內(nèi)制劑。本試驗(yàn)以毛蕊異黃酮葡萄糖苷、綠原酸的轉(zhuǎn)移率和浸膏得率作為綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用響應(yīng)面法優(yōu)選葆腎1 號(hào)的提取工藝，為該制劑的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1.儀器與材料

Agilent 1200 高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent 公司），DAD 二極管陣列檢測(cè)器（美國(guó)Agilent 公司）；BSA224SCW 電子天平（德國(guó)Sartorius 公司）。毛蕊異黃酮葡萄糖苷和綠原酸對(duì)照品（批號(hào)：111920-201606，110753-201817），均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。乙腈為色譜純（美國(guó)Fisher Scientific公司），其他試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)所用飲片均購(gòu)自蘇州天靈中藥飲片有限公司。

2.方法

2.1 毛蕊異黃酮葡萄糖苷、綠原酸含量測(cè)定

2.1.1色譜條件 色譜柱：XBridge C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫：30 ℃；流動(dòng)相：0.2%磷酸水（A）-乙腈（B），梯度洗脫：0 ～10 min，92%A；10 ～12 min，92%A →89%A；12 ～50 min，89%A；50 ～65 min，89%→80%A；流速：1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量：10 μL。采用波長(zhǎng)切換法：0 ～26 min，326 nm，測(cè)定綠原酸；26 ～65 min，254 nm，測(cè)定毛蕊異黃酮葡萄糖苷[3]。

2.1.2 溶液的制備 對(duì)照品溶液的制備：稱取毛蕊異黃酮葡萄糖苷、綠原酸對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇定容，配制成相應(yīng)的對(duì)照品溶液濃度為32 μg·mL-1、53 μg·mL-1。供試品溶液的制備：精密吸取1.5 mL 葆腎1 號(hào)樣品，置于5 mL 容量瓶中，加甲醇定容，超聲（300 W，40 kHz）10 min，靜置放冷后加甲醇至刻度，混勻，過(guò)0.45 μm 微孔濾膜，取續(xù)濾液作為供試品溶液。陰性樣品溶液的制備：分別稱取缺黃芪、缺石韋的全方飲片，照上述供試品溶液制備方法，制備陰性樣品溶液。

2.2 提取工藝試驗(yàn)

2.2.1 Box-Behnken 響應(yīng)面法試驗(yàn)設(shè)計(jì)[4]

按處方量稱取全方飲片，共72.5 g，分別取17 份。運(yùn)用Box-Behnken 設(shè)計(jì)模型，選取三個(gè)因素三個(gè)水平試驗(yàn)：A（煎煮時(shí)間：1、1.5、2 h）、B（煎煮次數(shù)：1、2、3 次）、C（加水量：8、10、12 倍）。按照設(shè)計(jì)方案，全方飲片浸泡30 min，煎煮后趁熱過(guò)濾，合并濾液，濃縮至200 mL。

2.2.2 浸膏得率測(cè)定 將樣品分別吸取25 mL 樣品至已恒重的蒸發(fā)皿中，水浴加熱至干，105 ℃干燥5 h，冷卻30 min 后稱重，105 ℃再干燥2 h，冷卻后稱重，直至恒重。

2.2.3 樣品成分含量及轉(zhuǎn)移率測(cè)定 分別精密吸取濃縮后的樣品溶液1.5 mL，照“2.1.2”項(xiàng)下方法，制備供試品溶液，照“2.1.1”項(xiàng)下的色譜條件，記錄峰面積，計(jì)算樣品中毛蕊異黃酮葡萄糖苷和綠原酸含量，并計(jì)算響應(yīng)面試驗(yàn)中毛蕊異黃酮葡萄糖苷和綠原酸的轉(zhuǎn)移率。

3.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所得數(shù)據(jù)用Design-Expert8.0.6 軟件進(jìn)行的統(tǒng)計(jì)分析，P＜0.05 表示數(shù)據(jù)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

4.結(jié)果

4.1 響應(yīng)面法分析和結(jié)果

為將所有指標(biāo)綜合為一個(gè)能反映總體效果的值，試驗(yàn)中引入多指標(biāo)權(quán)重來(lái)考察提取工藝[5]，兼顧君臣藥的主要貢獻(xiàn)度、有效成分的可測(cè)性以及中藥多成分發(fā)揮藥效的特點(diǎn)，賦予各指標(biāo)不同權(quán)重，賦予毛蕊異黃酮葡萄糖苷轉(zhuǎn)移率、綠原酸轉(zhuǎn)移率、浸膏得率分別為50%、30%、20%權(quán)重，見表1。

表1 試驗(yàn)方案與結(jié)果

上述實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)用Design-Expert8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析。以綜合評(píng)分為響應(yīng)值Y 分別對(duì)各因素X（自變量）進(jìn)行多元線性回歸方程擬合，回歸方程Y = 83.50 ～0.20A+12.53B+3.01C-1.42AB-0.18AC-2.20BC+0.21A2-12.52B2+0.74C2。R2= 0.8730，adjR2= 0.7097。方差分析可知，模型的F= 5.35，P= 0.0190 ＜0.05，表明實(shí)驗(yàn)所采用的二次模型有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；失擬項(xiàng)P= 0.4377 ＞0.05，說(shuō)明模型選擇合適，因此可用該回歸方程作為試驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。由P值可知，因素B 提取次數(shù)的P= 0.0009 ＜0.01，說(shuō)明提取次數(shù)對(duì)提取率有極顯著影響，提取時(shí)間（P= 0.9332）和加水量（P= 0.2295）對(duì)提取率無(wú)顯著影響（P＞0.05）。以綜合評(píng)分結(jié)果最大值為目標(biāo)，進(jìn)一步進(jìn)行模型預(yù)測(cè)，根據(jù)綜合評(píng)分，其中最高為90.5932，其最優(yōu)提取條件為：加水量12 倍，煎煮次數(shù)3 次（2.47），每次1 h。結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)，節(jié)能減排，確定最佳提取工藝為加水量12 倍，煎煮次數(shù)2 次，每次1 h。

4.2 提取工藝的驗(yàn)證試驗(yàn)與結(jié)果

按最佳工藝制備樣品，照上述方法測(cè)定，浸膏得率和毛蕊異黃酮葡萄糖苷、綠原酸轉(zhuǎn)移率均較高，驗(yàn)證結(jié)果為該提取工藝可行和穩(wěn)定，見表2。

表2 提取工藝驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果（n = 3）

5.討論

本實(shí)驗(yàn)選擇毛蕊異黃酮葡萄糖苷、綠原酸的轉(zhuǎn)移率和浸膏得率作為提取工藝的評(píng)價(jià)指標(biāo)，基于毛蕊異黃酮葡萄糖苷為本方黃芪的主要活性成分，且檢測(cè)方法成熟、分離度好、專屬性強(qiáng)，賦予其50%權(quán)重；綠原酸作為石韋的主要活性成分，賦予30%權(quán)重；充分考慮到本方作為復(fù)方中藥制劑供臨床使用，其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)為多成分共同作用，體現(xiàn)方劑其他配伍藥材的評(píng)估，將浸膏得率賦予20%權(quán)重。利用綜合評(píng)分多指標(biāo)權(quán)重結(jié)合響應(yīng)面法進(jìn)行工藝優(yōu)選，保證了提取工藝研究的可靠性和合理性。通過(guò)響應(yīng)面法的回歸分析和方差分析的結(jié)果，初步確定葆腎1 號(hào)的提取工藝條件，同時(shí)考慮到生產(chǎn)實(shí)際成本、能源消耗以及環(huán)境污染等因素，確定最佳提取工藝。