基于網(wǎng)絡藥理學的貓爪草治療結核病作用機制研究

劉媛，陳潔，孫輝，許苑南，馬志強，劉向芳，劉夢醒，劉幸*

(1.昆明市第三人民醫(yī)院，云南 昆明 650041;2普洱學院，云南 普洱 665000)

貓爪草系毛茛科植物小毛茛(RanunculusternatusThunb.)的干燥塊根，其性溫、味甘、辛，歸肝、脾經(jīng)，具有清熱解毒、消腫散結、止咳去痰之功效[1]。臨床應用貓爪草治療肺結核和淋巴結核有較好的療效，具有廣闊的應用前景[2-3]。世界衛(wèi)生組織發(fā)布的《2019年全球結核病報告》顯示全球新增結核病(tuberculosis，TB)患者為1000萬人，死亡率達到25%，處于所有傳染性疾病首位[4-5]。隨著近年來耐藥TB的感染率逐步上升及一線新的抗TB藥物的匱乏，導致TB的防治任務變得越來越艱巨。因此，發(fā)掘和充分利用中草藥治療TB，是當前醫(yī)學發(fā)展的迫切需求。Feng等[6]從貓爪草根中提取了5種新的雜環(huán)化合物，這些化合物的結構與一些抗結核藥物的結構相似。周勇等[7]研究發(fā)現(xiàn)，貓爪草可能通過提高顆粒裂解肽的表達，進而提高患者抗結核桿菌的能力，達到治療效果。楊牧之等[8]通過體外實驗表明，貓爪草多糖可通過激活小鼠腹腔巨噬細胞活力和吞噬功能，從而增強機體免疫功能。以上研究表明，貓爪草及其有效成分具有抑菌、調(diào)節(jié)免疫力等作用，治療TB療效確切。

中藥具有多成分、多靶點的特征，通過調(diào)控多通路發(fā)揮其療效，但目前對貓爪草治療TB的機制多從單一成分或單一靶點進行研究。因此，本研究基于網(wǎng)絡藥理學方法，通過建立成分-靶點-信號通路多層次網(wǎng)絡模型，分析貓爪草治療TB的成分、作用靶點及調(diào)控通路的信息，從整體角度研究貓爪草治療TB的物質(zhì)基礎和作用機制，為臨床用藥提供合理依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 貓爪草的活性化合物及相關靶點篩選

通過中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺(Traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform, TCMSP)(http://tcmspw.com/tcmsp.php)[9]，以“貓爪草”為關鍵詞檢索貓爪草的化學成分。根據(jù)口服生物利用度(oral bioavailability, OB)≥30%和類藥性(drug-likeness, DL)≥0.18 的2個ADME屬性值作為篩選貓爪草潛在活性化合物及其作用靶點的標準[10-11]。由于檢索到的藥物靶點存在命名不規(guī)范等問題，本研究利用Uniprot(https://www.uniprot.org/)數(shù)據(jù)庫輸入蛋白名稱并限定“Specie”為“Homo Sapiens”，校正靶點蛋白為規(guī)范的基因名稱。

1.2 TB相關靶點篩選

以“tuberculosis”為關鍵詞，挖掘GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)中治療TB的潛在靶點。在GeneCards數(shù)據(jù)庫中，評分(Score值)越高則代表該靶點與疾病聯(lián)系密切。

1.3 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡構建

為明晰貓爪草相關靶點與TB靶點間的相互作用，利用VENNY2.1軟件將二者靶點取交集并繪制維恩圖[12]。進而將交集靶點傳至STRING 11.0數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)構建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡模型[13]，選擇“multiple proteins”，將生物種類設定為“Homo sapiens”進行檢索，設置為評分≥0.9，以提高生物信息的可信度，通過以上信息的處理導出PPI網(wǎng)絡圖。下載tsv文件，保留節(jié)點(node1，node2)和結合率評分信息，并導入到Cytoscape 3.7.0軟件，分析靶點相關的拓撲參數(shù)。

1.4 GO和KEGG通路富集分析

運用DAVID(the database for annotation,visualization and integrated discovery)6.8數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov)對貓爪草和TB共同作用得到的交集基因進行基因本體(gene ontology, GO)分析。將所涉及潛在靶點基因參與的生物過程(biological process, BP)、分子功能(molecular function, MF)、細胞成分(cellular component, CC)三方面進行GO(gene ontology)分析[14]。以P<0.05 為閾值，將其按P值升序進行排序，并將結果以氣泡圖形式輸出。交集基因進行京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析，根據(jù)P值篩選顯著性高的通路，設置P<0.05，選取最顯著的10個通路。

1.5 成分-靶點-信號通路構建

基于藥物-成分-靶點-信號通路，運用Cytoscape構建藥理學網(wǎng)絡。根據(jù)KEGG通路富集分析結果所選取的主要信號通路，同時與參與相關通路的靶點建立聯(lián)系，并與成分-靶點間相互作用關系整合并導入Cytoscape 3.7.0軟件中，從而得到成分-靶點-信號通路網(wǎng)絡圖。

1.6 分子對接驗證

通過PubChem Compound數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下載貓爪草的活性成分分子結構SDF格式文件，并利用Open Babel 2.3.2軟件將SDF文件轉(zhuǎn)化為PDB文件。通過從Protein Data Bank數(shù)據(jù)庫(http://www.rcsb.org/pdb)中檢索獲得靶蛋白BAX(PDBID: 4BD6)、BCL2(PDBID: 5JSN)、CASP3(PDBID: 2J32)、CASP8(PDBID: 4PS1)、CASP9(PDBID: 3V3K)。運用AutoDock 軟件研究活性成分與靶點之間的分子對接可能，結果以親和能的形式輸出，通過計算受體(靶點)-配體復合物(活性成分)的空間效果、排斥作用、氫鍵、疏水相互作用以及分子的靈活性等值綜合打分，評估其親和力，最終得出親和能打分。親和能是衡量配體是否能與受體分子有效結合的重要指標，能值越低，表明二者的結合效果越好。

2 結果

2.1 貓爪草的活性化合物及相關靶點篩選

通過TCMSP共檢索到貓爪草中有效化合物79種。經(jīng)ADME篩選出活性化合物12種，相關信息見表1。通過UniProt數(shù)據(jù)庫找出化學成分對應的靶基因名稱，物種限定為“Homo sapiens”，去除重復的基因，共獲得40個靶點基因，相關信息見表2。

表1 貓爪草化合物信息特征表

表2 貓爪草潛在靶點

2.2 TB相關靶點的獲取

在GeneCards數(shù)據(jù)庫中檢索“tuberculosis”，獲得TB靶點2378個。根據(jù)經(jīng)驗設定評分大于中位數(shù)的目標靶點為TB的潛在靶點，評分最大值為48.97，最小值為0.14，中位數(shù)為1.15，故設定評分大于1.15的靶點為TB的潛在靶點，最終得到1187個相關靶點。

2.3 PPI網(wǎng)絡構建

將篩選的貓爪草活性成分靶點與TB靶點取交集，并通過VENNY 2.1軟件繪制維恩圖，得到貓爪草成分-TB共同靶點10個，分別為：ADRB2、OPRM1、BCL2、BAX、CASP9、JUN、CASP3、CASP8、LTA4H、NR3C2，見圖1。進而將靶點提交至STRING數(shù)據(jù)庫進行分析，構建貓爪草-TB靶點PPI網(wǎng)絡圖，見圖2。有4個靶點因為沒有與網(wǎng)絡相聯(lián)系，故剔除，分別為ADRB2、OPRM1、LTA4H、NR3C2。該網(wǎng)絡包括6個節(jié)點，14條邊。圖中節(jié)點表示靶點，節(jié)點內(nèi)部的螺旋結構表示該基因的三圍結構，邊表示靶點間的互作關系。度值越大則節(jié)點越大，平均度值為4.67。圖表顯示貓爪草治療TB的靶點中度值排名前6的為CASP3、CASP8、CASP9、BAX、BCL2、JUN，說明這些基因在網(wǎng)絡中發(fā)揮了相對重要的作用，成為網(wǎng)絡中聯(lián)通其他節(jié)點的關鍵節(jié)點，見表3。

注：紫色代表TB靶點；黃色代表貓爪草靶點；深黃色部分為共同靶點。圖1 貓爪草-TB共同基因靶點數(shù)Fig.1 Number of overlapping target genes between Ranunculi Ternati Radix and TB

圖2 貓爪草-TB靶點PPI網(wǎng)絡圖Fig.2 PPI network of Ranunculi Ternati Radix-TB targets

表3 貓爪草與TB共有靶點的分析

2.4 GO和KEGG通路富集結果與分析

運用DAVID數(shù)據(jù)庫對貓爪草治療TB的靶點進行GO富集分析(P<0.5)，分別從BP、MF、CC這三個方面進行。貓爪草治療TB的GO基因富集分析根據(jù)校正后P值進行排序，共得到GO條目8個。以BP結果較多，BP主要與凋亡過程的調(diào)控、細胞周期調(diào)節(jié)、細胞對紫外線的應答等有關，將結果進行氣泡圖展示，見圖3。

圖3 貓爪草潛在靶點GO富集分析Fig.3 Analysis of GO enrichment of potential targets of Ranunculi Ternati Radix

為進一步探究貓爪草的作用靶點在生物信號通路層面的機制，將交集靶點基因與KEGG 通路進行映射，根據(jù)校正后P值篩選前10條通路，見表4。結果表明貓爪草的信號通路包括癌癥通路、凋亡、HIV-1病毒感染、EB病毒感染、乙肝、麻疹、結核病、p53信號通路、單純皰疹病毒感染、沙門氏菌感染。由上述KEGG富集結果分析可知，貓爪草與TB、凋亡等相關信號通路有較密切聯(lián)系，其中主要的活性靶點為CASP8、BAX、BCL2、CASP9、CASP3，這表明貓爪草可能通過影響細胞凋亡從而發(fā)揮治療TB的作用[15]，見圖4。

表4 KEGG富集分析結果

注：粉紅色代表貓爪草活性靶點圖4 TB信號通路Fig.4 Signaling pathway involving TB development

注：藍色代表貓爪草活性成分；粉紅色代表潛在靶點；綠色代表信號通路圖5 貓爪草治療TB成分-靶點-信號通路Fig.5 Ranunculi Ternati Radix in the treatment of TB: components-target-signaling pathway

2.5 成分-靶點-信號通路構建

運用Cytoscape 3.7.0 軟件構建貓爪草活性成分-作用靶點-代謝通路網(wǎng)絡。圖中包括貓爪草活性成分12種，TB與貓爪草交集靶點10 個，信號通路10條。篩選出的貓爪草候選活性成分的作用靶點分布在不同的信號通路，相互協(xié)調(diào)，通過調(diào)控不同的信號通路發(fā)揮治療TB的作用，結果見圖5。成分-靶點-信號通路網(wǎng)絡顯示，預測出貓爪草治療TB的12種潛在活性成分與BCL2、BAX、CASP9、JUN、CASP3及CASP8等靶點存在較強的相互作用，通過KEGG富集分析顯示這些靶點主要集中在TB、凋亡、癌癥、p53 等相關信號通路。該成分-靶點-信號通路圖體現(xiàn)了貓爪草多成分-多靶點-多途徑調(diào)節(jié)TB的特點，這一特點與中藥治療疾病的系統(tǒng)性與整體性相統(tǒng)一。

2.6 分子對接驗證

12種活性化合物與5個靶點對接結果見表5，親和能能值越低表示配體與受體結合更好。從各成分的親和能來看，Stigmasta-4,6,8、vittadinoside_qt、Stigmasterol、poriferasterol monoglucoside_qt、Sitosteryl acetate、 bate-sitosterol的分值較低，可能是影響細胞凋亡的重要成分，從而發(fā)揮抗結核作用。從各靶點的親和能來看，BAX、CASP3和CASP9是這些成分共同發(fā)揮作用的重要靶點。另外，Truflex OBP和 Mandenol在對接中分值較高，表明其與TB相關靶點結合較低，可能影響細胞凋亡的作用較弱。

表5 貓爪草活性成分與5個靶點作用情況(親和能)

選取與每個靶點蛋白親和力最強的化合物，做出化合物與蛋白結合圖，可直觀觀察活性化合物與靶點的結合模式以及與周圍氨基酸殘基的相互作用，結果見圖6。

受體蛋白BAX與Stigmasta-4,6,8配體小分子之間的結合模式見圖6(a)，氨基酸殘基Leu70、Leu76、Met79、Ile80、Val83、Val91、Arg94、Val95、Asp98、Met99、Phe116、Ala112、Tyr115與Stigmasta-4,6,8配體小分子形成疏水相互作用。

受體蛋白BCL2與poriferasterol monoglucoside_qt配體小分子之間的結合模式見圖6(b)，氨基酸殘基Leu137、Glu136、Arg146與poriferasterol monoglucoside_qt配體小分子形成氫鍵相互作用，氨基酸殘基Arg139、Asp140、Asn143、Ala149、Gly145、Val148、Phe198、Leu201、Tyr202、Ala100、Arg107、Tyr108、Phe104與poriferasterol monoglucoside_qt配體小分子形成疏水相互作用。

受體蛋白CASP3與poriferasterol monoglucoside_qt配體小分子之間的結合模式見圖6(c)，氨基酸殘基Asp211、Asn208、Trp214、Phe250、Glu248與poriferasterol monoglucoside_qt配體小分子形成氫鍵相互作用，氨基酸殘基Ser209、Arg207、Thr62、Cys163、Phe256、Trp206、Ser249與poriferasterol monoglucoside_qt配體小分子形成疏水相互作用。

受體蛋白CASP8與Stigmasterol配體小分子之間的結合模式見圖6(d)，氨基酸殘基Gln358與Stigmasterol配體小分子形成氫鍵相互作用，氨基酸殘基Asp266、Leu270、Thr273、Leu277、Phe274、Ile311、Cys309、Val354、Phe356與Stigmasterol配體小分子形成疏水相互作用。

受體蛋白CASP9與Stigmasterol配體小分子之間的結合模式見圖6(e)，氨基酸殘基Val379、Ser378、Met386、Phe334、Phe337、Asp291、Gly293、Phe294、Lys384、Val296、Ser298與Stigmasterol配體小分子形成疏水相互作用。

注：粉紅色分子為配體化合物(活性化合物)圖6 貓爪草成分-靶點分子對接Fig.6 Molecular docking between components of Ranunculi Ternati Radix and the targets

3 討論

本研究運用網(wǎng)絡藥理學的方法初步探討了貓爪草治療TB的作用機制，篩選其活性成分、作用靶點及相關生物學通路。貓爪草活性成分Stigmasta-4,6,8、vittadinoside_qt、Stigmasterol、poriferasterol monoglucoside_qt、Sitosteryl acetate、bate-sitosterol等可能通過TB、凋亡、p53信號通路等相關信號通路作用于CASP3、CASP8、CASP9、BAX、BCL2等靶點而起到抗結核作用。TB是一種嚴重的慢性傳染病，主要由結核分枝桿菌(mycobacterium tuberculosis，MTB)感染引起[16]。當結核分枝桿菌感染機體時就是巨噬細胞殺菌和MTB逃逸的斗爭過程[17-18]。巨噬細胞發(fā)生凋亡后可殺死MTB，阻止MTB在體內(nèi)增殖，但MTB也可通過一系列機制有效阻斷巨噬細胞的凋亡，以逃逸巨噬細胞的殺傷而在體內(nèi)長期存活。因此，巨噬細胞的凋亡在抗MTB的過程中發(fā)揮著關鍵作用，抑制巨噬細胞的凋亡是MTB逃逸的重要途徑[19]。目前研究表明，MTB影響巨噬細胞凋亡的途徑有Caspase酶系列途徑、BCL2途徑、NF-κB途徑等，主要與CASP3、CASP8、CASP9、BAX、BCL2等相關。王健宏等[20]研究結果表明，MTB的重要毒力因子ESAT6可激活Caspase通路中的CASP1、CASP3、CASP5、CASP7、CASP8，從而誘導巨噬細胞的凋亡，這個過程往往與MTB的毒力密切相關。BCL2是一種具有延長細胞生存時間和抗細胞凋亡的蛋白，當MTB感染巨噬細胞后，可促進RIPK3和BCL2轉(zhuǎn)運至線粒體，抑制CASP8的活化和細胞凋亡，并誘導細胞壞死而讓自身存活[21]。Zhang等[22]認為MTB毒力因子Rv3033能通過抑制線粒體凋亡相關蛋白BAX進入線粒體，從而阻止巨噬細胞內(nèi)線粒體介導的內(nèi)在凋亡。因此，MTB可通過多條途徑對巨噬細胞的凋亡進行調(diào)控，以逃逸免疫系統(tǒng)的清除作用。

同時，F(xiàn)ang等[23]的研究表明，貓爪草的提取物可以激活在細胞凋亡執(zhí)行過程中起至關重要作用的CASP7、CASP8和CASP9。周玲玉[24]的研究結果顯示貓爪草活性成分β-谷甾醇可以上調(diào)BAX表達和下調(diào)BCL2表達而引起細胞的凋亡。結合本研究通過PPI、GO及KEGG分析得到的結果，可初步認為貓爪草活性化合物可能通過調(diào)控CASP3、CASP8、CASP9、BAX和BCL2等，從而促進巨噬細胞的凋亡，起到抗結核的作用。在分子對接中，本研究發(fā)現(xiàn)Stigmasta-4,6,8、vittadinoside_qt、Stigmasterol、poriferasterol monoglucoside_qt、Sitosteryl acetate、 bate-sitosterol具有較好的親和力，這些主要成分對應的重要靶點CASP3、CASP9、BAX是細胞凋亡過程的重要環(huán)節(jié)。由此，推測貓爪草可能作用于細胞凋亡通路發(fā)揮抗結核作用。

綜上所述，本研究從網(wǎng)絡藥理學的角度出發(fā)，初步闡述了中藥貓爪草治療TB的潛在活性成分、可能作用的靶點及發(fā)揮藥效的關鍵信號通路。目前貓爪草治療TB的作用機制鮮少報道，本研究通過網(wǎng)絡藥理學和分子對接方法對貓爪草治療TB的藥效機制進行預測，可為深入研究其作用機制和臨床應用提供方向與思路。