低溫脅迫對(duì)軍曹魚幼魚脂代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響

蔡潤(rùn)佳，張靜，黃建盛，施鋼，潘傳豪，謝瑞濤，陳剛，張健東，王忠良，湯保貴,3*

( 1. 廣東海洋大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院，廣東 湛江 524088；2. 南方海洋科學(xué)與工程廣東省實(shí)驗(yàn)室(湛江)，廣東 湛江 524025；3. 廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物病原生物學(xué)及流行病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江 524088)

1 引言

水溫是魚類最重要的環(huán)境因子之一，對(duì)魚類的分布、生存具有決定作用，而當(dāng)水溫低于適宜溫度范圍時(shí)，會(huì)深刻影響著魚類的免疫[1]、發(fā)育[2]、生長(zhǎng)[3]等各種生命活動(dòng)。目前的研究[4-6]表明，魚類脂代謝活動(dòng)也受到低溫的影響，低溫脅迫會(huì)導(dǎo)致魚體脂代謝相關(guān)指標(biāo)產(chǎn)生變化。目前關(guān)于低溫脅迫對(duì)魚類脂代謝相關(guān)基因的研究在多個(gè)物種上已有報(bào)道，如低溫脅迫會(huì)降低斜帶石斑魚(Epinephelus coioides)肝臟cpt-1、scd-1和fabp10 的相對(duì)表達(dá)量[7]；方玲玲[8]研究發(fā)現(xiàn)，低水溫對(duì)卵形鯧鲹(Trachinotus ovatus)肌肉pparα和cpt-1基因的表達(dá)具有誘導(dǎo)作用；Mininni等[9]對(duì)低溫脅迫下的金頭鯛（Sparus aurata）應(yīng)用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序發(fā)現(xiàn)，肝臟中大量脂代謝相關(guān)基因參與了對(duì)低溫的響應(yīng)。可見低溫脅迫對(duì)魚類脂代謝相關(guān)基因的表達(dá)具有較大的影響，也暗示脂代謝調(diào)節(jié)可能是魚類應(yīng)對(duì)低溫脅迫的重要途徑。

魚類脂肪合成代謝中，乙酰輔酶A作為底物經(jīng)過(guò)乙酰輔酶A羧化酶(Acetyl-CoA Carboxylase, ACC)的催化后產(chǎn)生丙二酰輔酶A，丙二酰輔酶A被脂肪酸合成酶(Fatty Scid Synthase, FAS)多次催化后產(chǎn)生飽和脂肪酸，魚體可以此為原料進(jìn)一步合成機(jī)體所需的各種脂肪酸[10]。脂肪分解代謝主要包括甘油三酯的水解和細(xì)胞內(nèi)β-氧化等步驟，甘油三酯水解是指甘油三酯被脂肪激素敏感脂肪酶(Hormone Sensitive Lipase,HSL)、單?；视王ッ?Monoacylglycerol Lipase, MGL)等催化生成甘油二酯、甘油一酯和游離脂肪酸的過(guò)程[11-13]。胞內(nèi)β-氧化主要發(fā)生在線粒體上[14]，借助脂酰肉堿轉(zhuǎn)移系統(tǒng)中的酶催化長(zhǎng)鏈脂酰CoA，而肉堿脂酰基轉(zhuǎn)移酶-1(Carnitinepalmitoyl Transferase-1, CPT-1)對(duì)線粒體β-氧化的速度起著決定作用[10]。

軍曹魚(Rachycentron canadum)屬于暖水性魚類，適宜溫度范圍為21～31℃，在兩廣海域養(yǎng)殖常遭受寒潮等極端天氣下的低溫脅迫。溫度會(huì)影響軍曹魚的生長(zhǎng)、抗氧化酶活性等[15-16]，但未見與脂代謝關(guān)系方面的研究。魚類的脂肪主要儲(chǔ)存在肝臟、肌肉、腹腔和皮下組織等4個(gè)部位[17]，在軍曹魚中則主要分布在肝臟、肌肉和腹腔。本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）法對(duì)比分析軍曹魚幼魚脂代謝相關(guān)基因在不同溫度（低溫和常溫）、時(shí)間（第1天、第4天、第7天）及組織（肌肉、肝臟和腹腔脂肪）的表達(dá)變化情況，為進(jìn)一步分析軍曹魚脂代謝的分子機(jī)制提供參考。

2 材料和方法

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與管理

將90尾軍曹魚幼魚[體重（211.17±9.51）g]平均放養(yǎng)在6個(gè)300 L的養(yǎng)殖桶中，每天飽食投喂兩次(08:00和16:00)，暫養(yǎng)5 d后開始正式實(shí)驗(yàn)。常溫對(duì)照組水溫為（30.5±1.0）℃，低溫實(shí)驗(yàn)組采用密封瓶裝冰塊按照0.5℃/h勻速降溫至（20.0±0.5）℃，實(shí)驗(yàn)期間靜水養(yǎng)殖且每天更換50%等溫新鮮海水。預(yù)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)軍曹魚幼魚在20℃時(shí)完全無(wú)食欲，為避免殘余飼料污染水質(zhì)，故低溫組不投喂，對(duì)照組保持每天兩次正常喂食。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組均不間斷充氣，維持溶氧在5 mg/L、pH為7.4～7.8；每隔30 min檢測(cè)1次水溫，每天使用水質(zhì)檢測(cè)試劑盒監(jiān)測(cè)水質(zhì)，維持對(duì)照組和低溫組除溫度外的水環(huán)境因子一致且保持有害物質(zhì)濃度處于較低水平（氨氮小于0.02 mg/L、亞硝酸鹽小于0.01 mg/L）。

2.2 樣品采集

預(yù)試驗(yàn)結(jié)果顯示，軍曹魚在20℃的低溫條件下半致死時(shí)間為7 d，所以正式實(shí)驗(yàn)時(shí)長(zhǎng)設(shè)置為7 d。在第1天、第4天、第7天時(shí)分別采集低溫脅迫組和常溫對(duì)照組樣品，將每桶3尾魚的組織樣品混合成一管，以同個(gè)水溫中3個(gè)桶的樣品作為3個(gè)生物學(xué)重復(fù)進(jìn)行檢測(cè)。采用丁香酚麻醉后取肌肉、肝臟和腹腔脂肪放入液氮速凍，再轉(zhuǎn)移至?80℃冰箱中保存待測(cè)。

2.3 總RNA提取與反轉(zhuǎn)錄

將樣品放置于裝有少量液氮的研缽中研碎至粉末狀，然后按照RNA提取試劑盒(TransZOL Up Plus RNA Kit，北京全式金生物技術(shù)有限公司)說(shuō)明書進(jìn)行總RNA的提取，提取后采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)提取的RNA條帶以及使用超微量核酸蛋白檢測(cè)儀對(duì)RNA的純度和濃度進(jìn)行檢測(cè)。取1 μL總RNA為反轉(zhuǎn)錄的模板按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(EasyScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix，北京全式金生物技術(shù)有限公司)說(shuō)明書合成第一鏈cDNA。

2.4 引物設(shè)計(jì)

從軍曹魚已有轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(未發(fā)表)中查找各個(gè)目標(biāo)基因及內(nèi)參基因β-actin基因序列，使用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)各個(gè)基因的上、下游引物序列，引物由上海生工生物股份有限公司合成。引物經(jīng)過(guò)驗(yàn)證確保特異性、PCR結(jié)果無(wú)二聚體和非特異性擴(kuò)增后作為正式實(shí)驗(yàn)引物。本實(shí)驗(yàn)所用引物序列如表1所示，其中acc、fas、hsl、cpt-1和mgl為目標(biāo)基因，β-actin為內(nèi)參基因。

表1 本實(shí)驗(yàn)引物序列Table 1 The primers used in the experiment

2.5 基因表達(dá)量檢測(cè)

采用熒光定量試劑盒(PerfectStart Green qPCR SuperMix，北京全式金生物技術(shù)有限公司)對(duì)肝臟、肌肉和腹腔脂肪等組織進(jìn)行檢測(cè)，將5個(gè)基因測(cè)得的Ct值按照2?ΔΔCt法[18]計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。10 μL反應(yīng)體系包括ddH2O 3.5 μL、上下游引物各0.5 μL、cDNA(100 ng/μL)0.5 μL、SYBR Green Supermix 5 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性30 s；94℃變性5 s，60℃退火15 s，72℃延伸10 s，循環(huán)40次；72℃延伸5 min。分析溶解曲線確保擴(kuò)增結(jié)果為單PCR產(chǎn)物。每個(gè)樣本重復(fù)3次。

2.6 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示，采用SPSS 19.0軟件的T檢驗(yàn)對(duì)相同時(shí)間點(diǎn)的對(duì)照組和低溫組數(shù)據(jù)進(jìn)行差異分析。分析結(jié)果默認(rèn)當(dāng)p<0.05時(shí)為差異顯著，p<0.01時(shí)為差異極顯著。

3 結(jié)果

3.1 低溫脅迫下軍曹魚脂分解相關(guān)基因表達(dá)

軍曹魚幼魚在低溫脅迫第1天、第4天和第7天時(shí)，肝臟cpt-1表達(dá)量均極顯著高于對(duì)照組(p<0.01)，肝臟hsl表達(dá)量在低溫脅迫第1天和第4天時(shí)極顯著高于對(duì)照組(p<0.01)，第7天時(shí)表達(dá)量下降但仍顯著高于對(duì)照組(p<0.05)，肝臟mgl表達(dá)量在第1天時(shí)與對(duì)照組無(wú)顯著差異(p>0.05)，第4天和第7天時(shí)均極顯著高于對(duì)照組(p<0.01) (圖1a)。隨著低溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，軍曹魚肌肉cpt-1表達(dá)量呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，其中第1天時(shí)極顯著高于對(duì)照組(p<0.01)，第4天時(shí)下降至與對(duì)照組無(wú)顯著差異(p＞0.05)，第7天時(shí)表達(dá)量下降至極顯著低于對(duì)照組(p<0.01)，肌肉hsl表達(dá)量在低溫脅迫第1天、第4天和第7天時(shí)均極顯著高于對(duì)照組(p<0.01)，肌肉mgl表達(dá)量在脅迫過(guò)程中逐漸上升，第1天時(shí)顯著高于對(duì)照組(p<0.05)，第4天和第7天均極顯著高于對(duì)照組(p<0.01)(圖1b)。腹腔脂肪cpt-1表達(dá)量在低溫脅迫第1天時(shí)極顯著低于對(duì)照組(p<0.01)，第4天時(shí)升高至顯著高于對(duì)照組(p<0.05)，第7天時(shí)表達(dá)量約為對(duì)照組的6倍，并達(dá)到差異極顯著水平(p<0.01)，腹腔脂肪hsl表達(dá)量和mgl表達(dá)量變化趨勢(shì)完全一致，兩個(gè)基因均在第1天時(shí)極顯著降低了表達(dá)(p<0.01)，在第4天和第7天時(shí)升高至極顯著高于對(duì)照組(p<0.01)(圖1c)。

圖1 低溫脅迫下軍曹魚幼魚3個(gè)脂分解相關(guān)基因表達(dá)量Fig. 1 Expression of three lipolysis-related genes in juvenile cobia under low temperature stress*表示低溫組與同期對(duì)照組之間差異顯著(p<0.05)；**表示差異極顯著(p<0.01)*indicates a significant difference (p<0.05); **indicates extremely significant difference (p<0.01) compared with the control group in the same period

3.2 低溫脅迫下軍曹魚脂合成相關(guān)基因表達(dá)

軍曹魚幼魚在低溫第1天和第4天時(shí)極顯著降低了肝臟acc表達(dá)量(p<0.01)，而脅迫至第7天時(shí)肝臟acc表達(dá)量則顯著高于對(duì)照組(p<0.05)，呈現(xiàn)出先下降后上升的趨勢(shì)。肝臟fas表達(dá)量在低溫脅迫的第1天、第4天和第7天時(shí)均極顯著低于同期對(duì)照組(p<0.01)，僅約為對(duì)照組表達(dá)量的0.2倍(圖2a)。軍曹魚幼魚肌肉acc表達(dá)量在低溫脅迫過(guò)程中呈現(xiàn)出先降后升的趨勢(shì)，在第1天時(shí)顯著低于對(duì)照組(p<0.05)，第4天和第7天時(shí)均極顯著高于對(duì)照組表達(dá)量(p<0.01)，肌肉fas表達(dá)量隨著低溫脅迫的進(jìn)行表現(xiàn)為先降后升再降的趨勢(shì)，第1天時(shí)極顯著低于對(duì)照組(p<0.01)，在第4天時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高且極顯著高于對(duì)照組(p<0.01)，第7天時(shí)又下降至與對(duì)照組無(wú)顯著差異(p＞0.05)(圖2b)。腹腔脂肪中，軍曹魚腹腔脂肪組織acc表達(dá)量隨著低溫脅迫的進(jìn)行呈現(xiàn)先降后升趨勢(shì)，其中第1天時(shí)極顯著低于對(duì)照組(p<0.01)，第4天時(shí)顯著高于對(duì)照組(p<0.05)，第7天時(shí)表達(dá)量進(jìn)一步提高，與對(duì)照組達(dá)到差異極顯著水平(p<0.01)，腹腔脂肪組織fas表達(dá)量在低溫脅迫第1天時(shí)極顯著降低(p<0.01)，但在第4天和第7天時(shí)升高至與對(duì)照組無(wú)顯著差異(p＞0.05)(圖2c)。

圖2 低溫脅迫下軍曹魚幼魚3個(gè)脂合成相關(guān)基因表達(dá)量Fig. 2 Expression of three lipid synthesis-related genes in juvenile cobia under low temperature stress*表示低溫組與同期對(duì)照組之間差異顯著(p<0.05)；**表示差異極顯著(p<0.01)*indicates a significant difference (p<0.05) ; **indicates extremely significant difference (p<0.01) compared with the control group in the same period

4 討論

4.1 低溫脅迫對(duì)軍曹魚幼魚脂分解代謝的影響

魚類吸收脂肪酸后以甘油三酯的形式進(jìn)行儲(chǔ)存，并在機(jī)體需要的時(shí)候通過(guò)甘油三酯水解和脂肪酸胞內(nèi)氧化來(lái)產(chǎn)生能量。研究表明，甘油三酯代謝過(guò)程受到水環(huán)境溫度的影響。Wen等[19]研究發(fā)現(xiàn)，低溫雖然導(dǎo)致了七彩神仙魚(Symphysodon aequifasciatus)的代謝率下降，但是七彩神仙魚可以通過(guò)自主調(diào)節(jié)來(lái)維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，提高甘油脂代謝就是其中的途徑之一。在鯉[20]、金頭鯛[21]、斑馬魚(Danio rerio)[22]等物種上也發(fā)現(xiàn)低溫脅迫對(duì)魚體脂代謝具有促進(jìn)作用。在本研究中，軍曹魚幼魚腹腔脂肪組織在低溫脅迫第1天時(shí)降低了hsl基因和mgl基因的表達(dá)，在第4天和第7天時(shí)又顯著上調(diào)了這兩個(gè)基因的表達(dá)量。由此推測(cè)軍曹魚在低溫脅迫后期才開始釋放儲(chǔ)存在腹腔脂肪的脂質(zhì)。在肝臟組織中，hsl表達(dá)量先升高后逐漸降低，mgl表達(dá)量在低溫第1天時(shí)與對(duì)照組無(wú)顯著差異，在低溫脅迫后期才有顯著提高，結(jié)果暗示，軍曹魚肝臟在低溫脅迫過(guò)程中首先通過(guò)提高對(duì)甘油三酯的催化效率來(lái)滿足機(jī)體對(duì)脂肪酸的需要，在脅迫后期還會(huì)通過(guò)增強(qiáng)催化分解甘油一酯來(lái)進(jìn)一步補(bǔ)充機(jī)體的游離脂肪酸含量。在肌肉組織中，軍曹魚在低溫過(guò)程中均顯著提高了hsl基因和mgl基因的表達(dá)，推測(cè)促進(jìn)脂肪水解代謝是維持肌肉能量供應(yīng)的重要途徑之一。

游離脂肪酸從甘油三酯中釋放出來(lái)之后，還需要經(jīng)過(guò)β-氧化才能釋放出能量，此過(guò)程主要受到cpt-1活力的影響。本研究發(fā)現(xiàn)，在低溫脅迫前期，肝臟和肌肉cpt-1表達(dá)量均顯著升高，與卵形鯧鲹[8]、斜帶石斑魚[7]、多鱗白甲魚(Onychostoma macrolepis)[23]等物種的研究結(jié)果一致，可見提高脂肪酸β-氧化可能是多種魚類應(yīng)對(duì)低溫脅迫的共有反應(yīng)。但隨著低溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，cpt-1表達(dá)量在軍曹魚3種組織中出現(xiàn)了差異，在肝臟中的表達(dá)量與脅迫前期一致仍顯著高于對(duì)照組，但在肌肉中表達(dá)量逐漸下降，腹腔脂肪中的表達(dá)量則逐漸升高。由cpt-1基因在3個(gè)組織的表達(dá)情況推測(cè)，軍曹魚在低溫脅迫前期進(jìn)行脂肪酸β-氧化的主要組織是肝臟和肌肉，而在脅迫后期進(jìn)行脂肪酸β-氧化的主要組織則變成是肝臟和腹腔脂肪。

4.2 低溫脅迫對(duì)軍曹魚幼魚脂合成代謝的影響

動(dòng)物體在正常情況下，體內(nèi)的脂質(zhì)主要來(lái)自食物攝入和體內(nèi)生物合成等兩個(gè)途徑[24]，食物攝入減少或停止會(huì)導(dǎo)致脂質(zhì)代謝的平衡受到破壞，此時(shí)提高脂質(zhì)生物合成相關(guān)基因表達(dá)，可使機(jī)體的脂質(zhì)代謝恢復(fù)到一個(gè)新的平衡。ACC和FAS是影響脂肪生物合成的兩個(gè)關(guān)鍵限速酶[25-26]。通過(guò)對(duì)軍曹魚肌肉、肝臟和腹腔脂肪的檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，除了肝臟fas的表達(dá)水平在低溫時(shí)均極顯著低于對(duì)照組之外，acc表達(dá)量在3種組織以及fas在肌肉和腹腔脂肪中的變化趨勢(shì)都表現(xiàn)為先下降后上升。推測(cè)低溫脅迫第1天時(shí)，由于機(jī)體代謝強(qiáng)度隨著溫度的下降而下降，所以出現(xiàn)了脂質(zhì)合成基因表達(dá)量減少的情況。但隨著軍曹魚在低水溫環(huán)境中進(jìn)行適應(yīng)性調(diào)整，脂質(zhì)合成相關(guān)基因表達(dá)量有所提升。乙酰輔酶A被ACC催化后產(chǎn)生的丙二酰輔酶A是脂質(zhì)代謝的關(guān)鍵調(diào)控因子，可以決定脂肪酸是氧化供能還是進(jìn)行酯化反應(yīng)[10]，并且能夠抑制肉堿轉(zhuǎn)移酶的活性從而減少脂肪酸的氧化[27]，增加脂肪在細(xì)胞內(nèi)的沉積[28]。軍曹魚肝臟fas表達(dá)水平的降低可能導(dǎo)致丙二酰輔酶A的蓄積，從這方面看，低溫條件下，軍曹魚可能通過(guò)丙二酰輔酶A來(lái)調(diào)節(jié)體內(nèi)脂肪酸氧化過(guò)程，以延長(zhǎng)脂肪酸供能的時(shí)間。另外，fas表達(dá)量在肝臟和腹腔脂肪中呈現(xiàn)出下降或與對(duì)照組無(wú)顯著差異的趨勢(shì)，僅在低溫脅迫第4天時(shí)的肌肉組織中極顯著升高，表明肝臟和腹腔組織在低溫脅迫過(guò)程中，與對(duì)照組脂肪酸生物合成量相比沒(méi)有升高甚至有所下降。在脅迫中期，肌肉中脂肪酸合成基因的表達(dá)顯著增加，說(shuō)明低溫脅迫對(duì)軍曹魚脂肪酸在不同組織間的分布產(chǎn)生一定影響。本實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)軍曹魚肌肉在低溫前期中顯著上調(diào)了脂分解相關(guān)基因的表達(dá)，而增加肌肉在低溫脅迫中期脂質(zhì)合成相關(guān)基因的表達(dá)可以補(bǔ)償前期過(guò)多的消耗，從而維持肌肉中脂肪酸含量的相對(duì)穩(wěn)定。肝臟同樣作為低溫前期的主要供能組織，fas表達(dá)量卻在整個(gè)低溫過(guò)程中極顯著降低，推測(cè)組織脂肪含量以及組織功能可能是肝臟與肌肉fas差異表達(dá)的重要因素，具體原因則有待進(jìn)一步分析。

5 結(jié)論

從基因表達(dá)水平上看，軍曹魚幼魚在低溫脅迫前期通過(guò)抑制脂合成代謝，促進(jìn)肝臟和肌肉中的脂質(zhì)水解，抑制腹腔脂肪的脂質(zhì)分解來(lái)響應(yīng)低溫脅迫；在低溫脅迫后期，軍曹魚幼魚脂合成和分解代謝均顯著提高，且利用脂肪酸提供能量的主要組織由前期的肝臟和肌肉轉(zhuǎn)變?yōu)楦闻K和腹腔脂肪。