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    油酸對(duì)非酒精性脂肪肝細(xì)胞活性氧、周期及凋亡的影響

    2021-12-13 07:01:20李建華黃登亮田美媛張耀剛馬艷艷
    醫(yī)學(xué)研究雜志 2021年11期
    關(guān)鍵詞:油紅流式油酸

    李建華 侯 靜 黃登亮 田美媛 張耀剛 劉 哲 馬艷艷

    非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)是一種引起肝臟脂肪沉積的疾病,發(fā)生于男性飲酒量<30g/d,女性飲酒量<20g/d的人群[1]。根據(jù)病理診斷,NAFLD可分為單純性脂肪變性和脂肪性肝炎。進(jìn)展型非酒精性脂肪肝,即非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis,NASH),可導(dǎo)致肝硬化和肝細(xì)胞癌[2]。隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)水平的提高,不良生活方式和飲食習(xí)慣使得NASH的發(fā)生率顯著提高。NASH影響世界25%人口,已經(jīng)成為世界重大公共衛(wèi)生問(wèn)題,預(yù)計(jì)在2016~2030年期間,與NASH相關(guān)的病死率將增長(zhǎng)1倍[3, 4]。研究發(fā)現(xiàn),部分NASH患者發(fā)展成肝硬化,其風(fēng)險(xiǎn)遠(yuǎn)高于單純性脂肪肝[5]。

    目前,甘油三酯(triglyceride, TG)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase,AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase,ALT)是臨床上評(píng)價(jià)肝功能的常用指標(biāo),NASH引起TG、AST、ALT升高,同時(shí)研究也發(fā)現(xiàn)血漿高濃度TG可以引起脂肪變性[6,7]。飽和脂肪酸到單不飽和脂肪酸比率影響細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化,這一比率的改變可造成肝功能紊亂、小腸炎癥等疾病[8]。油酸屬于單不飽和脂肪酸,是人類飲食中最豐富的脂質(zhì)形式之一,與其他脂肪酸比較,其在循環(huán)中的含量相對(duì)較高,常被用來(lái)建造非酒精性脂肪肝模型[9~12]。目前NASH的研究主要集中肝細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)及凋亡,很少有研究報(bào)道在NASH肝細(xì)胞中油酸代謝產(chǎn)生的活性氧(ROS)是如何影響細(xì)胞周期及凋亡。

    細(xì)胞模型常被用于研究脂肪變性,研究常采用HepG2及L02細(xì)胞系, AML-12是正常小鼠肝臟細(xì)胞,本研究通過(guò)油酸處理AML-12細(xì)胞建立NASH細(xì)胞模型,觀察細(xì)胞脂肪變性,分析ROS、周期及細(xì)胞損傷變化,為NASH的發(fā)病機(jī)制及預(yù)防提供理論基礎(chǔ)[10~12]。

    材料與方法

    1.材料:小鼠AML-12細(xì)胞株購(gòu)自上海通派生物科技有限公司。油酸(貨號(hào):01008)、油紅O(貨號(hào):00625)、DMSO(貨號(hào):34943)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;DMEM(貨號(hào):2230805)購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;ROS檢測(cè)試劑盒(貨號(hào):S0033M)購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;Annexin V-PI凋亡試劑盒(貨號(hào):556547)購(gòu)自美國(guó)BD公司;TG(貨號(hào):A110-1-1)、AST(貨號(hào):C010-2-1)、ALT(貨號(hào):C009-2-1)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所;EdU細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒(貨號(hào):RN:R11053.9)購(gòu)自廣州瑞博生物科技有限公司。

    2.細(xì)胞培養(yǎng)及處理:小鼠肝細(xì)胞系A(chǔ)ML-12用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。含有10ml DMEM的100mm培養(yǎng)皿中接種細(xì)胞1×106個(gè),細(xì)胞貼壁4h后,加入60μg/ml油酸,分別在第24、48、72h測(cè)定細(xì)胞上清液TG、ALT、AST含量,同時(shí)收集細(xì)胞進(jìn)行凋亡和周期檢測(cè)。在含有2ml DMEM的6孔板中接種2×105個(gè)細(xì)胞,貼壁4h后,加入60μg/ml油酸,72h后進(jìn)行油紅O、EdU染色。

    3.TG、AST、ALT測(cè)定:分別收集24、48、72h細(xì)胞培養(yǎng)上清液,按照南京建成TG、AST、ALT檢測(cè)試劑盒操作說(shuō)明書進(jìn)行檢測(cè)。(1)TG檢測(cè)原理:TG在脂肪酶的作用下生成甘油及脂肪酸,甘油及ATP在甘油激酶的作用下生成甘油-3-磷酸和ADP,甘油-3-磷酸在3-磷酸甘油氧化酶的作用下生成磷酸羥基丙酮和H2O2,H2O2和4-AAP及對(duì)氯酚在過(guò)氧化物酶的作用下生成紅色醌化物。通過(guò)510nm波長(zhǎng)檢測(cè),查標(biāo)準(zhǔn)曲線,求酶活力單位。(2)AST檢測(cè)原理:AST能使α-酮戊二酸和天門冬氨酸移換氨基和酮基,生成谷氨酸和草酰乙酸。草酰乙酸在反應(yīng)過(guò)程中可自行脫羧成丙酮酸。丙酮酸與2,4-二硝基苯肼反應(yīng)生成2,4-二硝基苯腙,在堿性溶液中顯紅棕色。通過(guò)510nm波長(zhǎng)檢測(cè),查標(biāo)準(zhǔn)曲線,求酶活力單位。(3)ALT檢測(cè)原理:ALT在37℃及pH7.4條件下,作用于丙氨酸及α-酮戊二酸組成的底物,生成丙酮酸及谷氨酸。反應(yīng)30min后加入2,4-二硝基苯肼鹽酸溶液,即中止反應(yīng),同時(shí)2,4-二硝基苯肼與酮酸中羰基加成,生成丙酮酸苯腙。苯腙在堿性條件下呈紅棕色,通過(guò)510nm波長(zhǎng)檢測(cè),查標(biāo)準(zhǔn)曲線,求酶活力單位。

    4.油紅O染色觀察脂滴形成:稱取油紅O粉末溶于異丙醇中,配制成5mg/ml儲(chǔ)存液,避光密封保存。油紅O儲(chǔ)存液∶雙蒸水=3∶2稀釋成工作液,用定性濾紙過(guò)濾,室溫放置10min,現(xiàn)配現(xiàn)用。吸取棄掉6孔板中的培養(yǎng)基,用2ml PBS漂洗1遍,加10%中性甲醛固定30min,棄掉甲醛,加入2ml油紅O工作液,染色10min。棄掉油紅O,加入2ml PBS洗1遍,棄掉PBS,加入60%異丙醇脫色,棄掉脫色液,加入2ml PBS在顯微成像儀下觀察脂滴形成情況。

    5.EdU染色觀察:EdU染色按照銳博EdU細(xì)胞增殖檢測(cè)使用說(shuō)明書進(jìn)行操作,之后用Cytation5 細(xì)胞顯微成像儀觀察,并用儀器自帶軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

    6.ROS流式檢測(cè):每支流式管中加入1×106個(gè)細(xì)胞,同時(shí)加入10μmol/L的ROS檢測(cè)熒光探針,37oC避光孵育20min,加1ml PBS重懸細(xì)胞,450×g離心5min,倒掉上清,加入400μl PBS重懸上機(jī)。

    7.細(xì)胞周期流式檢測(cè):每支流式管中加入1×106個(gè)細(xì)胞,加入1ml 70%乙醇,渦旋混勻,4oC固定30min,450×g離心5min倒掉上清,加1ml PBS重懸細(xì)胞,450×g離心5min倒掉上清,加100μl PBS,再加入1μl RNase A(10mg/ml)和5μl PI,渦旋混勻,避光孵育15min,加1ml PBS重懸細(xì)胞,450×g離心5min,倒掉上清,加入400μl PBS重懸上機(jī)。

    8.細(xì)胞凋亡流式檢測(cè):每支流式管中加入1×106個(gè)細(xì)胞,加入PI和Annix V各5μl,渦旋混勻,避光孵育15min,加入400μl Binding buffer 染色緩沖液,渦旋混勻上機(jī)。

    結(jié) 果

    1.TG、ALT、AST測(cè)定:在24、48及72h分別檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液TG、ALT、AST含量,發(fā)現(xiàn)處理組TG含量在24、48及72h比對(duì)照組高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),24、48h 時(shí)ALT、AST比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),72h時(shí)ALT、AST比對(duì)照組高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖1)。

    圖1 細(xì)胞培養(yǎng)上清液TG、ALT、AST柱狀圖A.TG;B.ALT;C.AST

    2.油紅O染色脂滴形成情況:72h后,油紅染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)60μg/ml油酸處理后,細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見橘紅色脂滴形成,印戒形脂滴形成明顯(圖2中A、B),經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)處理組油O平均吸光度比對(duì)照組高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖2C),說(shuō)明油酸處理后形成了脂肪變性現(xiàn)象。

    圖2 72h脂滴顯微成像及統(tǒng)計(jì)圖A.處理組油紅O染色圖(×20);B.對(duì)照組油紅O染色圖(×20);C.柱狀圖;D.處理組油紅O染色圖(×4); E.對(duì)照組油紅O染色圖(×4)

    3.EdU染色結(jié)果分析:72h后,EdU染色結(jié)果顯示處理組比對(duì)照組陽(yáng)性高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),因此60μg/ml油酸處理后進(jìn)入S期細(xì)胞增多(圖3)。

    圖3 72hEdU染色成像散點(diǎn)圖及柱狀圖(EdU染色,×4)A.處理組成像圖;B.對(duì)照組成像圖;C.處理組散點(diǎn)圖;D.對(duì)照組散點(diǎn)圖;E.柱狀圖

    4.流式ROS結(jié)果分析:油酸處理細(xì)胞72h后,經(jīng)過(guò)流式檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn),處理組與對(duì)照組比較,ROS明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000,圖4)。

    圖4 細(xì)胞ROS流式單參數(shù)直方及柱狀圖A.處理組;B.對(duì)照組;C.柱狀圖

    5.流式周期結(jié)果分析:油酸處理細(xì)胞72h后,經(jīng)過(guò)流式檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn),處理組與對(duì)照組相比G0/G1期細(xì)胞降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),S期細(xì)胞數(shù)量增多,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),G2/M期沒(méi)有變化,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,圖5)。

    圖5 流式細(xì)胞周期分析圖A.處理組;B.對(duì)照組;C.統(tǒng)計(jì)圖

    6.流式凋亡結(jié)果分析:油酸處理細(xì)胞72h后,經(jīng)過(guò)流式檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn),處理組細(xì)胞凋亡比對(duì)照組高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000),處理組壞死比對(duì)照組高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,圖6)。

    圖6 細(xì)胞凋亡及壞死散點(diǎn)圖及柱狀圖A.處理組;B.對(duì)照組;C.柱狀圖

    討 論

    NASH是肝功能不全最常見的原因之一,肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積過(guò)多是其主要特征之一,主要由高脂飲食引起。長(zhǎng)期高脂飲食可以增加血液中的游離脂肪酸(FFA)水平,增強(qiáng)外周脂肪組織的脂肪分解,導(dǎo)致甘油三酯及游離脂肪酸在肝臟中的積累。脂質(zhì)的過(guò)氧化、線粒體功能紊亂、炎癥都可能最終導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷和肝纖維化,研究也發(fā)現(xiàn)游離脂肪酸可降低肝細(xì)胞的存活率并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,同時(shí)NASH患者8-羥基-脫氧鳥苷可引起DNA的氧化損傷,油酸屬于游離脂肪酸在誘導(dǎo)非酒精性脂肪肝發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起了一定作用[13,14]。

    潘雪豐等[12]研究發(fā)現(xiàn)60μg/ml油酸處理L02細(xì)胞24、48及72h后,形成橘紅色脂滴較明顯,本研究通過(guò)60μg/ml油酸處理AML-12細(xì)胞24、48h后發(fā)現(xiàn),TG升高,ALT及AST并沒(méi)有升高,因此24、48h只是造成脂滴形成,脂肪變性,但并未造成肝細(xì)胞實(shí)質(zhì)性損傷,72h后TG、AST、ALT比對(duì)照組升高,說(shuō)明72h后造成了肝細(xì)胞實(shí)質(zhì)性損傷。因此,非酒精性脂肪肝造成的損傷是長(zhǎng)時(shí)間脂代謝障礙引起的,可導(dǎo)致肝臟甘油三酯的異常積累及線粒體功能紊亂。線粒體功能紊亂主要表現(xiàn)在線粒體β氧化和過(guò)氧化物酶體β氧化,線粒體β氧化異??梢鹬舅嵩诟渭?xì)胞基質(zhì)中堆積,當(dāng)肝細(xì)胞中蓄積大量脂肪酸,過(guò)氧化物酶體可對(duì)中長(zhǎng)鏈脂肪酸進(jìn)行氧化,產(chǎn)生大量ROS及細(xì)胞因子,造成肝細(xì)胞損傷及肝臟纖維化[15]。本研究也發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)60μg/ml油酸處理72h后ROS含量明顯升高,這可能是造成本實(shí)驗(yàn)中肝細(xì)胞損傷的主要原因。丙二醛是脂質(zhì)過(guò)氧化的一個(gè)產(chǎn)物,能與DNA等新核性生物大分子發(fā)生反應(yīng),從而使細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能造成損傷[16]。本研究發(fā)現(xiàn),經(jīng)過(guò)60μg/ml油酸處理72h之后,S期細(xì)胞增多,G0/G1降低,G2/M期細(xì)胞不變,通過(guò)EdU染色結(jié)果也發(fā)現(xiàn)通過(guò)油酸處理后,進(jìn)入S期的細(xì)胞增多,說(shuō)明油酸參與細(xì)胞代謝后產(chǎn)生的ROS可能使細(xì)胞阻滯在S期,造成肝細(xì)胞的凋亡和壞死,而且流式結(jié)果也發(fā)現(xiàn)在72h之后,處理組凋亡和壞死細(xì)胞增多,這一現(xiàn)象可能與脂質(zhì)的過(guò)氧化產(chǎn)物與DNA等生物大分子發(fā)生反應(yīng)相關(guān)。

    綜上所述,在非酒精性脂肪肝細(xì)胞模型中,油酸代謝產(chǎn)生的ROS可能使細(xì)胞阻滯在S期,同時(shí)加快細(xì)胞凋亡和壞死,而且也有研究發(fā)現(xiàn)人肝癌細(xì)胞HepG2中油酸的氧化產(chǎn)物環(huán)氧硬脂酸能夠誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期,同時(shí)引起細(xì)胞凋亡[17]。除此之外,用油酸處理牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞后G0/G1期細(xì)胞降低,S期細(xì)胞升高,使細(xì)胞阻滯在S期,同時(shí)上調(diào)細(xì)胞脂代謝相關(guān)基因表達(dá)[18]。這也表明不同的疾病模式,油酸對(duì)細(xì)胞周期的影響機(jī)制可能不同,具體機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

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