lncRNA KIZ-AS1通過調(diào)控miR-1290/CDC73軸抑制膀胱癌細(xì)胞增殖和遷移

魯帥奇 楊凌博 秦帥鋒 張 寒 孫建濤

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤之一，致病因素包括抽煙、環(huán)境因素等[1,2]。膀胱癌患者男性多于女性，發(fā)生率隨年齡增長(zhǎng)逐漸增高[3]。膀胱癌患者復(fù)發(fā)比例和轉(zhuǎn)移率較高，嚴(yán)重威脅患者生命健康[4]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)和微小RNA(miRNA)均是非編碼RNA，參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的癌變、增殖、凋亡、遷移等過程，在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起到關(guān)鍵作用[5,6]。miR-1290在口腔鱗狀細(xì)胞癌、胰腺癌、胃癌等多種腫瘤組織或血清中高表達(dá)，顯著促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，與腫瘤患者的不良預(yù)后密切相關(guān)[7,8]。有研究顯示，miR-1290在膀胱癌細(xì)胞中表現(xiàn)為促癌因子作用[9]。KIZ-AS1是近年來發(fā)現(xiàn)的lncRNA，由562個(gè)核苷酸構(gòu)成，目前關(guān)于KIZ-AS1在膀胱癌組織中的表達(dá)、作用及與miR-1290的靶向關(guān)系未見報(bào)道。本研究旨在觀察KIZ-AS1在膀胱癌組織和細(xì)胞系中的表達(dá)，探討KIZ-AS1對(duì)miR-1290/CDC73軸的調(diào)控作用及對(duì)膀胱癌細(xì)胞增殖和遷移的影響。

材料與方法

1.臨床標(biāo)本：選取2017年9月～2020年12月鄭州大學(xué)附屬洛陽中心醫(yī)院泌尿外科膀胱癌根治性手術(shù)切除37例癌組織和癌旁組織，所有患者術(shù)前均未行放療和化療，本研究經(jīng)鄭州大學(xué)附屬洛陽中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)同意，患者均簽署知情同意書。其中男性29例，女性8例，平均年齡為57.19±13.15歲；病理分級(jí)按照WHO(2004年)病理分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：1級(jí)7例，2級(jí)17例，3級(jí)13例；臨床分期按照國際抗癌聯(lián)盟(UICC)TNM分期標(biāo)準(zhǔn)：Ta～T125例，T2～T412例。所有組織術(shù)后立即于液氮中保存，所有標(biāo)本均經(jīng)筆者醫(yī)院兩名以上病理科醫(yī)生確診。

2.細(xì)胞與試劑：膀胱癌細(xì)胞系(RT-4、BIU-87、T24、5637)和膀胱上皮永生化細(xì)胞(SV-HUC-1)購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心。KIZ-AS1慢病毒、陰性對(duì)照慢病毒、miR-1290 模擬物(mimic)、miR-NC mimic、pGL3-KIZ-AS1野生型質(zhì)粒(KIZ-AS1-WT)與突變型質(zhì)粒(KIZ-AS1-MUT)購自蘇州吉瑪基因股份有限公司。胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司。Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司。qPCR試劑盒和MTT試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。雙熒光素酶報(bào)告基因試劑盒購自美國Promega公司。一抗(CDC73、cyclin D3、CDK2、α-tubulin、claudin-1、E-Cadherin)和辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗購自美國Cell Signaling Technology公司。

3.細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染：將SV-HUC-1細(xì)胞加入含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，將RT-4、BIU-87、T24、5637細(xì)胞加入含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的5637細(xì)胞分為對(duì)照組和KIZ-AS1組，根據(jù)感染復(fù)數(shù)為30，分別感染陰性對(duì)照慢病毒和KIZ-AS1慢病毒，于感染48h后收集各組細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

4.qPCR檢測(cè)：TRIzol法提取膀胱癌組織和細(xì)胞系總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。按照qPCR試劑盒說明書設(shè)定反應(yīng)體系和反應(yīng)參數(shù)，KIZ-AS1和CDC73 mRNA以GAPDH為內(nèi)參，miR-1290以U6為內(nèi)參。KIZ-AS1、miR-1290和CDC73 mRNA相對(duì)表達(dá)水平按照2-ΔΔCt方法計(jì)算。qPCR引物序列如下，KIZ-AS1正向引物：5′-TTTCCAGCATTTCCCATAGC-3′，反向引物：5′-CAGGTGGAATGTGGAACGA-3′；U6正向引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACAT-3′，反向引物：5′-TTTGCGTGTCATCCTTGCG-3′；miR-1290正向引物：5′-TGGATTTTTGGATCAGGG-3′，反向引物：5′-GAACATGTCTGCGTATCTC-3′；GAPDH正向引物：5′-GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG-3′，反向引物：5′-ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA-3′；CDC73正向引物：5′-GAGAGAGTATGGAGGACA-CGAAC-3′，反向引物：5′-ATTTGGGGCAGGTCGCTGTTCA-3′。

5.生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測(cè)和雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證：采用starBase v2.0數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)KIZ-AS1互補(bǔ)結(jié)合的miRNA。將KIZ-AS1-WT、KIZ-AS1-MUT分別與miR-1290 mimic、miR-NC mimic采用Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑共轉(zhuǎn)染至5637細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48h，參照雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒說明書，分別檢測(cè)海參熒光素酶發(fā)光強(qiáng)度和螢火蟲熒光素酶發(fā)光強(qiáng)度，兩者的比值代表KIZ-AS1與miR-1290的結(jié)合力。

6.Western blot法檢測(cè)：5637細(xì)胞感染48h后，加入細(xì)胞裂解液提取總蛋白，調(diào)節(jié)每組蛋白的上樣量，采用10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，進(jìn)一步轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，在5%脫脂牛奶中封閉，稀釋一抗：CDC73(1∶2000稀釋)、cyclin D3(1∶3000稀釋)、CDK2(1∶2000稀釋)、E-cadherin(1∶1000)、claudin-1(1∶1000)及α-tubulin(1∶3000)，在4℃冰箱內(nèi)孵育過夜。加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育2h。均勻滴加化學(xué)發(fā)光試劑，采用凝膠成像系統(tǒng)中曝光、拍照。

7.MTT法檢測(cè)：5637細(xì)胞感染48h后，按照1×103個(gè)/孔加入96孔板中，分別培養(yǎng)1、2、3、4、5天后加入濃度為5%的MTT溶液20μl，正常培養(yǎng)4h，吸出上清液，加入140μl二甲基亞砜，在振蕩器振蕩10min。采用酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)450nm處的吸光度(A)值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。

8.Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)：5637細(xì)胞感染48h后，采用無血清培養(yǎng)基重懸5637細(xì)胞至2×105個(gè)/毫升，取180μl細(xì)胞懸液加入Transwell上室，加入600μl含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的培養(yǎng)基至下室。培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，采用體積分?jǐn)?shù)1%多聚甲醛固定10min，采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2%結(jié)晶紫染液染色10min，流水沖洗并風(fēng)干，采用顯微鏡(×100)下拍照、計(jì)數(shù)進(jìn)入膜下的細(xì)胞數(shù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。

結(jié) 果

1.膀胱癌組織和癌旁組織中KIZ-AS1表達(dá)水平：如圖1所示，膀胱癌組織和癌旁組織中KIZ-AS1表達(dá)分別為1.46±0.41和6.69±1.15，癌旁組織的KIZ-AS1表達(dá)是膀胱癌組織的4.58倍，顯著高于膀胱癌組織(P<0.01)。

圖1 膀胱癌組織和癌旁組織中KIZ-AS1表達(dá)水平

2.膀胱癌細(xì)胞和膀胱上皮永生化細(xì)胞細(xì)胞中KIZ-AS1表達(dá)水平：膀胱癌RT-4、BIU-87、T24、5637細(xì)胞中KIZ-AS1的表達(dá)分別為0.53±0.07、0.63±0.03、0.35±0.04、0.17±0.03，明顯低于膀胱上皮永生化細(xì)胞SV-HUC-1(1.04±0.14)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05，圖2)，5637細(xì)胞中KIZ-AS1表達(dá)水平最低(P<0.01)，選擇5637細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)研究。

圖2 膀胱上皮永生化細(xì)胞和膀胱癌細(xì)胞中KIZ-AS1表達(dá)水平與SV-HUC-1細(xì)胞比較，*P<0.05，**P<0.01

3.對(duì)照組和KIZ-AS1組5637細(xì)胞中KIZ-AS1的表達(dá)水平：qPCR結(jié)果顯示，KIZ-AS1組和對(duì)照組5637細(xì)胞中KIZ-AS1表達(dá)分別為11.29±1.87和1.06±0.25，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

4.過表達(dá)KIZ-AS1抑制5637細(xì)胞增殖活力：MTT法結(jié)果顯示，從第2天起，KIZ-AS1組5637細(xì)胞增殖活力顯著低于對(duì)照組(P<0.05，圖3)。

圖3 MTT檢測(cè)KIZ-AS1對(duì)5637細(xì)胞增殖活力的影響與對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01

5.過表達(dá)KIZ-AS1抑制5637細(xì)胞遷移能力：Transwell實(shí)驗(yàn)顯示，對(duì)照組和KIZ-AS1組5637細(xì)胞遷移數(shù)分別為71.53±6.23個(gè)和26.87±3.88個(gè)，與對(duì)照組比較，過表達(dá)KIZ-AS1可明顯抑制5637細(xì)胞遷移(P<0.01，圖4)。

圖4 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)KIZ-AS1對(duì)5637細(xì)胞遷移能力的影響A.Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)KIZ-AS1對(duì)膀胱癌細(xì)胞遷移的影響(結(jié)晶紫染色，×100)；B.細(xì)胞遷移數(shù)的半定量分析

6.生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測(cè)及雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證KIZ-AS1的潛在機(jī)制：利用starBase v2.0數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)miR-1290可能是KIZ-AS1的靶基因，預(yù)測(cè)序列見圖5。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，與miR-NC組比較，miR-1290組KIZ-AS1-WT細(xì)胞中相對(duì)熒光素酶活性顯著降低(P<0.01)，KIZ-AS1-MUT細(xì)胞中相對(duì)熒光素酶活性無明顯變化(P>0.05，圖6)。

圖5 生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測(cè)KIZ-AS1的潛在機(jī)制

圖6 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證KIZ-AS1的潛在機(jī)制

7.過表達(dá)KIZ-AS1的5637細(xì)胞中miR-1290和CDC73 mRNA表達(dá)變化：qPCR檢測(cè)顯示，對(duì)照組和KIZ-AS1組5637細(xì)胞miR-1290的表達(dá)分別為1.11±0.15和0.40±0.09，過表達(dá)KIZ-AS1顯著下調(diào)miR-1290的表達(dá)(P<0.01)。對(duì)照組和KIZ-AS1組5637細(xì)胞CDC73 mRNA的表達(dá)分別為1.02±0.17和4.94±0.90，過表達(dá)KIZ-AS1顯著上調(diào)CDC73 mRNA的表達(dá)(P<0.01)。

8.過表達(dá)KIZ-AS1促進(jìn)CDC73蛋白表達(dá)：Western blot法檢測(cè)結(jié)果顯示，過表達(dá)KIZ-AS1后5637細(xì)胞中CDC73蛋白表達(dá)明顯增加，細(xì)胞增殖蛋白如cyclin D3、CDK2表達(dá)降低，細(xì)胞遷移蛋白如claudin-1、E-cadherin表達(dá)明顯增加，提示5637細(xì)胞的增殖和遷移能力明顯降低(圖7)。

圖7 Western blot法檢測(cè)CDC73蛋白及細(xì)胞功能蛋白表達(dá)情況

討 論

lncRNA是一大類長(zhǎng)度>200個(gè)核苷酸的內(nèi)源性單鏈RNA，已被證明在各種惡性腫瘤組織或外周血清中異常上調(diào)或下調(diào)，表現(xiàn)為促癌因子或抑癌因子作用[10～12]。伴隨測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展，越來越多的lncRNA被發(fā)現(xiàn)在膀胱癌細(xì)胞中發(fā)揮重要功能[13, 14]。Zhang等[15]研究表明，在膀胱癌組織中發(fā)現(xiàn)lncRNA BCAR4表達(dá)升高，沉默lncRNA BCAR4可通過調(diào)節(jié)miR-370-3p表達(dá)，抑制膀胱癌5637和T24細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。He等[16]研究表明，lncRNA ZNF503-AS1在膀胱癌組織中降低，過表達(dá)ZNF503-AS1可通過與轉(zhuǎn)錄因子GATA6結(jié)合，減弱膀胱癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力，促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與癌旁組織比較，膀胱癌組織中KIZ-AS1相對(duì)表達(dá)水平顯著降低；與膀胱上皮永生化細(xì)胞比較，膀胱癌細(xì)胞系中KIZ-AS1相對(duì)表達(dá)水平明顯降低；過表達(dá)KIZ-AS1可抑制膀胱癌5637細(xì)胞的增殖和遷移，提示KIZ-AS1低表達(dá)可能與膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，KIZ-AS1在膀胱癌細(xì)胞中可能發(fā)揮抑癌因子作用。

lncRNA主要通過競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miRNA應(yīng)答元件，降低miRNA表達(dá)水平，阻止miRNA與靶基因mRNA的結(jié)合，促進(jìn)靶基因mRNA的表達(dá)[17, 18]。本研究利用starBase v2.0預(yù)測(cè)顯示，KIZ-AS1與miR-1290可能存在結(jié)合位點(diǎn)，雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)進(jìn)一步證實(shí)了KIZ-AS1和miR-1290的靶向關(guān)系。近年來研究證實(shí)，miR-1290高表達(dá)與胰腺癌、結(jié)直腸癌的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)，外周血miR-1290高表達(dá)是腫瘤患者預(yù)后不良的重要標(biāo)志物[19, 20]。Wang等[9]研究表明，miR-1290在膀胱癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)明顯上調(diào)，CDC73基因在膀胱癌組織和細(xì)胞系中低表達(dá)，miR-1290通過靶向抑制CDC73基因表達(dá)，促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。qPCR和Western blot法檢測(cè)結(jié)果顯示，過表達(dá)KIZ-AS1后，miR-1290表達(dá)明顯降低，CDC73基因表達(dá)明顯增加，表明KIZ-AS1通過競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-1290應(yīng)答元件，促進(jìn)CDC73基因表達(dá)，抑制膀胱癌的發(fā)生和發(fā)展。Western blot法檢測(cè)結(jié)果顯示，過表達(dá)KIZ-AS1后，細(xì)胞增殖蛋白如cyclin D3、CDK2表達(dá)減少，細(xì)胞遷移蛋白如claudin-1、E-cadherin表達(dá)明顯增加，表明5637細(xì)胞增殖和遷移能力明顯降低。

綜上所述，膀胱癌組織和細(xì)胞系中KIZ-AS1表達(dá)下調(diào)，KIZ-AS1通過抑制miR-1290表達(dá)，間接增高CDC73基因表達(dá)，進(jìn)而抑制膀胱癌5637細(xì)胞的增殖和遷移。KIZ-AS1/miR-1290/CDC73軸的研究為膀胱癌診斷和靶向治療提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。