兩種臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記方法及在1型糖尿病小鼠體內(nèi)示蹤的研究

劉 鵬 王從容

1型糖尿病(type 1 diabetes mellitus,T1DM)是一種嚴(yán)重的自身免疫疾病，主要以T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的β細(xì)胞破壞為主要特征，可導(dǎo)致胰島素分泌絕對不足，引發(fā)高血糖[1]。T1DM需終身使用外源性胰島素，如治療不及時(shí)或治療不當(dāng)會(huì)引起嚴(yán)重并發(fā)癥，影響患者生活質(zhì)量，甚至危及生命。目前臨床上使用的胰島素可有效降低血糖，從一定程度上減緩糖尿病患者并發(fā)癥的發(fā)生及進(jìn)展速度，但卻無法從源頭上遏制胰島β細(xì)胞的損傷。因此，針對T1DM開發(fā)一種新的治療方式尤為重要。近年來，干細(xì)胞治療各個(gè)領(lǐng)域疾病的基礎(chǔ)和臨床研究備受關(guān)注。人臍帶來源間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells, hUC-MSCs)由于其再生能力強(qiáng)、高可塑性及低免疫原性等特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)和臨床探索性研究[2]。

動(dòng)物和臨床探索性研究均表明，hUC-MSCs單獨(dú)或聯(lián)合其他細(xì)胞有望改善T1DM[3～6]。然而，細(xì)胞在移植受體中的分布、遷移和分化尚不完全明確。采用示蹤方法明確移植的細(xì)胞是否能歸巢到受損器官是hUC-MSCs治療T1DM發(fā)揮作用的關(guān)鍵因素之一。即往研究中，干細(xì)胞示蹤的標(biāo)記方法有很多，主要包括使用綠色熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP)作為報(bào)告基因轉(zhuǎn)入細(xì)胞，用假核酸分子Brdu標(biāo)記，生物染料PKH26、CFSE、DiL、DiR等標(biāo)記，以及直接檢測受體組織中的人源基因序列的方法[4, 7～11]。其中，報(bào)告基因轉(zhuǎn)染步驟較為復(fù)雜，且熒光強(qiáng)度隨著細(xì)胞傳代呈遞減狀態(tài)，因此，GFP標(biāo)記法存在不夠穩(wěn)定、可實(shí)施性較差的問題[12]。另一種Brdu也是較為常用的細(xì)胞標(biāo)記方法。但由于已凋亡的移植細(xì)胞釋放出的Brdu可滲入周圍任何處于細(xì)胞分裂S期的細(xì)胞，因此Brdu無法判斷標(biāo)記細(xì)胞是正在分裂的移植細(xì)胞還是宿主細(xì)胞[13]。

目前，在基礎(chǔ)研究中較為常用的標(biāo)記細(xì)胞方法為直接標(biāo)記移植細(xì)胞的細(xì)胞膜，但該方法在T1DM動(dòng)物模型中的應(yīng)用效果尚不明確[14]。本研究首次采用兩種方法，分別用親脂性細(xì)胞膜熒光染料PKH26與DiR對hUC-MSCs直接進(jìn)行標(biāo)記，通過構(gòu)建T1DM小鼠模型，比較尾靜脈注射PKH26標(biāo)記的hUC-MSCs后組織學(xué)染色或DiR標(biāo)記的hUC-MSCs后動(dòng)物活體成像兩種示蹤方法的優(yōu)缺點(diǎn)，為探索hUC-MSCs靜脈注射后對T1DM小鼠的歸巢特征提供基礎(chǔ)。

材料與方法

1.材料：6～8周齡C57BL/6J小鼠，體質(zhì)量為18～21g，由上海市第六人民醫(yī)院動(dòng)物房提供，飼養(yǎng)于上海市第六人民醫(yī)院動(dòng)物房SPF環(huán)境，用于T1DM小鼠模型構(gòu)建。hUC-MSCs由上海市東方醫(yī)院干細(xì)胞基地GMP實(shí)驗(yàn)室提供，原代細(xì)胞提取、傳代、鑒定方法及結(jié)果見參考文獻(xiàn)[15]。鏈尿佐菌素(streptozotocin, STZ)購自美國Sigma-Aldrich公司，MEM Alpha培養(yǎng)基、胎牛血清FBS購自美國Gibco公司，細(xì)胞膜染料PKH26購自美國Sigma-Aldrich公司，細(xì)胞膜染料DiR購自美國Thermo Fisher公司。

2.動(dòng)物分組及T1DM模型構(gòu)建：T1DM小鼠模型的構(gòu)建方法為C57BL/6J小鼠單次腹腔注射STZ溶液(50mg/kg)，1周后測定隨機(jī)血糖>16.7mmol/L認(rèn)為T1DM小鼠模型造模成功，未注射STZ的C57BL/6J小鼠作為正常對照。構(gòu)建成功的T1DM模型小鼠分為4組，分別是PKH26標(biāo)記細(xì)胞注射組(PKH26+組)及空白對照組(對照組1)，DiR標(biāo)記細(xì)胞注射組(DiR+組)及空白對照組(對照組2)，每組小鼠數(shù)量為3只。

3.PKH26標(biāo)記hUC-MSCs：取第4代hUC-MSCs，將用胰蛋白酶消化后的細(xì)胞置于離心管中，1500r/min離心5min后棄上清，再用PBS清洗1次，重懸于稀釋液C內(nèi)(細(xì)胞濃度約為2×107/ml)。避光環(huán)境下，將以上細(xì)胞懸液迅速加入PKH26稀釋液中，反復(fù)吹打混勻，于室溫避光孵育3min，每隔1min顛倒混勻1次。隨后加入1ml血清終止染色。1500r/min離心5min后棄上清，用含血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞3次，最后用PBS重懸細(xì)胞，用于尾靜脈注射。

4.DiR標(biāo)記hUC-MSCs：取第4代hUC-MSCs，將用胰蛋白酶消化后的細(xì)胞置于離心管中，1500r/min離心5min后棄上清，重懸于PBS內(nèi)[細(xì)胞濃度約為(3～5)×106/ml]。避光環(huán)境下，向每毫升細(xì)胞懸液中加入1μl濃度為10mmol/L的DiR稀釋液，反復(fù)吹打混勻，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中染色30min。加入PBS沖洗細(xì)胞懸液，1500r/min離心5min，再用PBS洗滌細(xì)胞2次，最后用PBS重懸細(xì)胞，用于尾靜脈注射。

5.細(xì)胞移植：將PKH26或DiR標(biāo)記的hUC-MSCs經(jīng)尾靜脈移植入T1DM小鼠，每只小鼠注射的細(xì)胞量為1×106，對照組1及對照組2均注射等體積的PBS，每組各3只，于移植后24h取材或進(jìn)行活體成像。

6.觀察PKH26標(biāo)記的hUC-MSCs在T1DM小鼠組織中的歸巢：hUC-MSCs移植24h后麻醉小鼠，通過左心室用0.9%氯化鈉溶液進(jìn)行灌注，取胰腺、心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟等6種組織用OCT進(jìn)行包埋。用冷凍切片機(jī)進(jìn)行常規(guī)切片，切片厚度約6～10μm。隨后用細(xì)胞核染料DAPI染細(xì)胞核，室溫孵育7min，用PBS洗滌3次，每次5min。最后用50%甘油PBS封片后在熒光顯微鏡下觀察。

7.活體觀察DiR標(biāo)記的hUC-MSCs在T1DM小鼠臟器內(nèi)的歸巢：hUC-MSCs移植24h后麻醉小鼠，采用活體成像系統(tǒng)檢測熒光信號(hào)強(qiáng)度，同時(shí)用PBS注射作為對照組2去除生物發(fā)光背景?；铙w成像結(jié)束后，將小鼠過量麻醉致死，取胰腺、心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟等6種臟器分別在活體成像系統(tǒng)中成像，觀察hUC-MSCs在不同器官中歸巢情況。

結(jié) 果

1.體外PKH26標(biāo)記hUC-MSCs的效果觀察：熒光倒置顯微鏡下觀察，hUC-MSCs細(xì)胞懸液經(jīng)PKH26標(biāo)記后，可見整個(gè)細(xì)胞均呈現(xiàn)紅色，染色效率約為100%(圖1)。

圖1 PKH26染色效率A.hUC-MSCs光學(xué)顯微鏡照片；B.同一視野下PKH26染色后熒光效果(×200)

2.體外DiR標(biāo)記hUC-MSCs的效果觀察：細(xì)胞懸液經(jīng)DiR染色，經(jīng)活體成像系統(tǒng)成像后發(fā)光強(qiáng)度為2.5×1010p/s，顯著高于未染色hUC-MSCs細(xì)胞(圖2)。

圖2 活體成像系統(tǒng)下DiR體外熒光強(qiáng)度檢測A.未染色hUC-MSCs成像；B.DiR染色hUC-MSCs成像

3.T1DM小鼠模型鑒定：STZ注射后6天，T1DM小鼠模型隨機(jī)血糖升至16.31±2.44mmol/L(圖3)，12天后上升至25mmol/L左右，而正常對照小鼠隨機(jī)血糖維持在8mmol/L左右，T1DM小鼠造模成功。

圖3 T1DM小鼠模型鑒定與正常對照比較，*P<0.01

4.PKH26標(biāo)記的hUC-MSCs在T1DM小鼠體內(nèi)示蹤效果：PKH26標(biāo)記的hUC-MSCs尾靜脈移植入T1DM小鼠體內(nèi)后24h，取PKH26+組T1DM小鼠胰腺、心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟等6種組織制作冷凍切片在熒光倒置顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)在以上器官中均可找到紅色熒光標(biāo)記的細(xì)胞，熒光強(qiáng)度較為明顯，但細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則(圖4A)。其中，熒光信號(hào)表達(dá)量最高的器官為脾臟組織，其次為肝臟和肺組織，在胰腺組織中也可觀察到發(fā)射紅色熒光的hUC-MSCs，歸巢效果最不明顯的為心肌組織(圖4B)。

圖4 PKH26標(biāo)記hUC-MSCs在T1DM小鼠體內(nèi)示蹤A.熒光顯微鏡下各組織中hUC-MSCs歸巢情況(×200);B.熒光量化結(jié)果。箭頭所示為組織冷凍切片中PKH26染色陽性的細(xì)胞

5.DiR標(biāo)記的hUC-MSCs在T1DM小鼠體內(nèi)示蹤效果：動(dòng)物活體成像結(jié)果顯示，DiR+組在hUC-MSCs移植24h后即可在體內(nèi)檢測到hUC-MSCs發(fā)射的熒光信號(hào)，經(jīng)量化后與對照組2比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 [(2.21±0.07)×109p/s vs (7.80±0.60)×109p/s，P=0.000]， 且主要集中在胸腹腔臟器分布部位，判斷結(jié)果為陽性。分析小鼠各臟器熒光表達(dá)量，結(jié)果表明，在所進(jìn)行熒光檢測的6種臟器中，肝臟平均熒光表達(dá)量最高，為(378.13±10.00)×108p/s。肺次之，平均熒光表達(dá)量為(81.98±2.44)×108p/s。心臟中檢測到的平均熒光表達(dá)量最低，為7.8×107p/s。在T1DM小鼠胰腺中也檢測到陽性熒光信號(hào)，平均表達(dá)量為(1.14±0.11)×108p/s。各組織平均熒光表達(dá)量詳見圖5。

圖5 DiR標(biāo)記hUC-MSCs在T1DM小鼠體內(nèi)示蹤A.T1DM小鼠活體動(dòng)物成像；B.活體成像量化結(jié)果；C.T1DM小鼠臟器成像；D.臟器成像量化結(jié)果

討 論

運(yùn)用模型動(dòng)物可模擬人體糖尿病狀態(tài)下的疾病特征，為研究hUC-MSCs在T1DM患者體內(nèi)的歸巢提供參考。hUC-MSCs作為間充質(zhì)干細(xì)胞的重要來源之一，在糖尿病治療領(lǐng)域已取得一定進(jìn)展。其發(fā)揮作用的機(jī)制包括調(diào)節(jié)免疫、分泌各種細(xì)胞因子等[2]。干細(xì)胞在動(dòng)物體內(nèi)的歸巢程度對于明確hUC-MSCs治療T1DM的機(jī)制研究具有重要意義。Maldonado等[4]用DiL標(biāo)記hUC-MSCs后腹腔注射入T1DM小鼠體內(nèi)，解剖后可在小鼠腹腔觀察到呈紅染的胰腺。同時(shí)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測小鼠各部分臟器中人源DNA序列的表達(dá)量，可在小鼠肝臟、腎臟、胰腺、脾臟組織中檢測到人源DNA的表達(dá)，提示在T1DM小鼠的胰腺中存在歸巢的hUC-MSCs。然而，DiL標(biāo)記實(shí)驗(yàn)中肉眼觀察到的呈紅染的胰腺組織不能排除是由于移植細(xì)胞所攜帶的熒光染料轉(zhuǎn)移至胰腺所造成的假陽性結(jié)果。另一方面，人源DNA的定量檢測結(jié)果雖相對可靠，但缺乏直觀的影像觀察結(jié)果。DiR作為一種發(fā)近紅外熒光親脂性細(xì)胞膜染料(與DiO、DiD、DiL屬于同一家族)，在嵌入細(xì)胞膜后會(huì)發(fā)出明亮且穩(wěn)定的熒光，這類染料有很高的激發(fā)態(tài)壽命和淬滅常數(shù)，染色效率極高，且對細(xì)胞生物特性及生理狀態(tài)無明顯影響。相較于其他細(xì)胞標(biāo)記方式，DiR的發(fā)射波長約為780nm，組織穿透力更強(qiáng)，其發(fā)射光基本不受機(jī)體自身組織背景的干擾，是用于動(dòng)物活體成像的理想材料[14, 16, 17]。另一方面，PKH26的發(fā)射波長為576nm，與DiR比較，更適合于熒光顯微鏡下觀察。

由于臨床上進(jìn)行干細(xì)胞移植多采用靜脈注射[18, 19]。因此，本研究選用尾靜脈注射方式作為hUC-MSCs動(dòng)物示蹤的研究方法。本研究首次應(yīng)用PKH26與DiR兩種標(biāo)記細(xì)胞方式，對hUC-MSCs在T1DM小鼠模型中進(jìn)行示蹤，獲得較好的成像效果。一方面，移植后24h，可在熒光顯微鏡下觀察到胰腺組織冷凍切片中PKH26標(biāo)記的細(xì)胞，證實(shí)了尾靜脈注射的hUC-MSCs可歸巢至STZ誘導(dǎo)的T1DM小鼠胰腺，同時(shí)也證實(shí)了hUC-MSCs在高血糖微環(huán)境中的趨化能力，與Yin等[20]報(bào)道的結(jié)果一致。在肝臟、脾臟、肺、腎臟、心臟等組織中均可觀察到PKH26陽性細(xì)胞。量化結(jié)果顯示，脾臟組織切片中PKH26陽性表達(dá)的細(xì)胞最多，其次為肝臟、肺等血管豐富的器官。胰腺組織中觀察到的hUC-MSCs高與心臟和腎臟組織。另一方面，采用DiR標(biāo)記的細(xì)胞對T1DM小鼠進(jìn)行活體成像，結(jié)果顯示在心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟、胰腺中均可檢測到陽性熒光信號(hào)。胰腺組織中也可觀察到陽性熒光信號(hào)，且熒光信號(hào)高與心臟和腎臟組織。與PKH26標(biāo)記細(xì)胞示蹤結(jié)果不同的是，DiR標(biāo)記的成像結(jié)果中可在肝臟中觀察到較強(qiáng)的熒光信號(hào)，這可能與肝臟血供較為充沛且臟器體積較大有關(guān)。

當(dāng)然，PKH26與DiR標(biāo)記方法也存在一定的不足，有報(bào)道稱細(xì)胞膜親脂染料可能存在染料轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，即移植入體內(nèi)的細(xì)胞凋亡破碎后，其細(xì)胞碎片可能會(huì)被臨近巨噬細(xì)胞吞噬，細(xì)胞膜上的染料隨之轉(zhuǎn)移至這些細(xì)胞膜上。同時(shí)，細(xì)胞膜染料的局限性還在于不能區(qū)分觀察到的陽性信號(hào)是存活細(xì)胞還是凋亡細(xì)胞，在體內(nèi)示蹤檢測移植細(xì)胞的存活狀態(tài)方面沒有報(bào)告基因標(biāo)記有優(yōu)勢。因此，有待于開發(fā)一種能在活體中穩(wěn)定表達(dá)，且能特異性標(biāo)記移植的存活細(xì)胞的示蹤方法。

本研究表明，采用PKH26或DiR標(biāo)記hUC-MSCs可觀察到T1DM小鼠心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟、胰腺中移植細(xì)胞的歸巢情況，并對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行量化。其中，PKH26標(biāo)記適用于熒光顯微鏡下觀察對組織切片中的hUC-MSCs移植細(xì)胞進(jìn)行量化。DiR標(biāo)記適用于在活體成像系統(tǒng)中觀察hUC-MSCs移植細(xì)胞在活體動(dòng)物組織中的分布，并進(jìn)行離體組織量化。本研究為hUC-MSCs治療T1DM的機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。