沙棘油中脂肪酸的GC-MS分析及其抗炎機(jī)制的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

鄭蘇楠，程春雷，王永剛*

(1.中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東省中藥上市后質(zhì)量與藥效再評價工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510275；2.山東省食品藥品檢驗研究院，山東 濟(jì)南 250101)

沙棘作為一種藥食同源作物，廣泛分布于我國西部干旱、半干旱以及高寒地區(qū)，不僅用于生產(chǎn)多種保健食品、飲品，也常用于治療各種疾病。沙棘果中油脂含量豐富，可達(dá)到約20%[1]。沙棘油是從天然植物沙棘的果實中提取的天然肉脂，是用途最廣泛的天然油之一，富含類胡蘿卜素、生育酚、omega-3和omega-6脂肪酸以及植物甾醇等生物活性物質(zhì)[2]。這些活性物質(zhì)不僅具有很高的抗氧化活性，也可以降低高脂喂養(yǎng)兔子血漿中的總膽固醇含量，具有抗動脈粥樣硬化潛力[3]。多項研究表明，沙棘油包含的棕櫚油酸和亞麻酸等[4]，具有促進(jìn)皮膚再生，改善血液循環(huán)，防止感染，預(yù)防過敏，抑制衰老等作用，還可以調(diào)節(jié)腸道菌群[5]。同時沙棘油還具有明顯的抗炎鎮(zhèn)痛、化腐生肌和扶正固本作用，對于放射性皮炎、黏膜炎,以及燒傷、燙傷、褥瘡、皮膚潰瘍、子宮糜爛等非放射性炎癥均有顯著療效[6]。其物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制尚不清楚，本研究通過對沙棘油進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)法分析，基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，對沙棘油的主要脂肪酸成分及抗炎作用靶點(diǎn)、通路進(jìn)行系統(tǒng)分析，以期為后續(xù)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 胡頹子科沙棘屬沙棘(HippophaerhamnoidesLinn.)果干，產(chǎn)地寧夏。

1.2 實驗方法

1.2.1 沙棘油脂肪酸種類測定 將沙棘果干粉碎過篩后，以石油醚(沸程60～90 ℃)為溶劑，在80 ℃下索氏提取8 h后回收石油醚，即得沙棘油樣品。將沙棘油樣品在堿性條件下甲酯化，采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法進(jìn)行測定[7]。

樣品配制：將6.55 g氫氧化鉀溶于50 mL無水甲醇中，加入無水硫酸鈉干燥，過濾后得2 mol·L-1氫氧化鉀-甲醇溶液備用。稱取50 mg沙棘油樣品，加入10 mL正己烷振搖2 min，再加入2 mol·L-1氫氧化鉀-甲醇溶液5 mL快速混勻，振搖1 min，靜置5 min，取上清液待測。

色譜條件：色譜柱TR-FAME(30 m × 0.25 mm × 0.25 μm)；載氣He，流量1 mL·min-1；進(jìn)樣量為0.3 μL，分流進(jìn)樣，分流10∶1；進(jìn)樣口溫度250 ℃，初始溫度為60 ℃，保持3 min，以5 ℃·min-1升至160 ℃，以2 ℃·min-1升至220 ℃，以10 ℃·min-1升至250 ℃；接口溫度280 ℃。

質(zhì)譜條件：電子轟擊(EI)離子源；離子源溫度230 ℃，電離能70 eV；倍增器電壓800 V；采用Q1 MS 掃描模式，掃描質(zhì)量范圍35 ～ 550 amu。標(biāo)準(zhǔn)譜庫為NIST 2.3譜庫(美國國家科學(xué)技術(shù)研究所)。

1.2.2 沙棘油活性成分作用靶點(diǎn)篩選 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索候選化合物作用靶點(diǎn)，并通過UniProt數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)將其蛋白名稱轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的基因名稱。同時通過Swiss TargetPrediction數(shù)據(jù)庫(http://www.swisstargetprediction.ch/)進(jìn)行沙棘油活性成分作用靶點(diǎn)篩選，以Probability>0為篩選標(biāo)準(zhǔn)，預(yù)測作用靶點(diǎn)。將上述2個數(shù)據(jù)庫平臺篩選得到的作用靶點(diǎn)進(jìn)行合并、去重，即為沙棘油活性成分的作用靶點(diǎn)。

1.2.3 疾病靶點(diǎn)收集匯總 以Inflammation為關(guān)鍵詞，在DisGeNET數(shù)據(jù)庫(https://www.disgenet.org/)中檢索抗炎的潛在靶點(diǎn)，Score值越高就表明此靶點(diǎn)與清熱抗炎的聯(lián)系越緊密，選取Score≥0.1的靶點(diǎn)作為抗炎作用潛在靶點(diǎn)，整理得到炎癥對應(yīng)的疾病靶點(diǎn)。

1.2.4 構(gòu)建藥物成分-靶點(diǎn)-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò) 將沙棘油活性成分對應(yīng)靶點(diǎn)及其炎癥相關(guān)的潛在作用靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape軟件，構(gòu)建沙棘油抗炎作用的“藥物成分-靶點(diǎn)-疾病靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)并利用Cytoscape自帶的分析功能模塊“Networkanalysis”進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)屬性分析。節(jié)點(diǎn)(Node)代表成分、靶點(diǎn)以及通路，邊(Edge)代表它們之間的聯(lián)系。

1.2.5 構(gòu)建沙棘油活性成分-抗炎靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò) 將篩選得到的沙棘油活性成分靶點(diǎn)與炎癥相關(guān)靶點(diǎn)取交集，并利用在線網(wǎng)站Venny 2.1.0(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)繪制Venn圖。所得靶點(diǎn)交集即為沙棘油抗炎潛在靶點(diǎn)，將所得靶點(diǎn)交集輸入STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)，選擇Multiple proteins之后將物種設(shè)置為Homo sapiens，其余設(shè)置默認(rèn)，得到蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)。

1.2.6 GO富集分析和KEGG通路分析 利用DAVID數(shù)據(jù)庫對潛在作用靶點(diǎn)進(jìn)行GO(Gene ontology)富集分析，并通過KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)富集分析探尋沙棘油抗炎作用生物功能以及主要信號通路分析，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 沙棘油脂肪酸成分 沙棘果油GC-MS色譜圖見圖1，檢測到的脂肪酸種類如表1所示。結(jié)果表明，沙棘果油中含有豐富的棕櫚油酸、棕櫚酸、油酸、亞油酸和亞麻酸等，測量結(jié)果與文獻(xiàn)報道相近[8-9]。

圖1 沙棘果油脂肪酸甲酯GC-MS總離子流圖

表1 沙棘油中脂肪酸種類測定結(jié)果

2.2 沙棘油脂肪酸的作用靶點(diǎn)及炎癥對應(yīng)靶點(diǎn) 將所得到的沙棘油中8個成分通過TCMSP數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，同時基于Swiss TargetPrediction數(shù)據(jù)庫平臺進(jìn)行預(yù)測，使用UniProt數(shù)據(jù)庫收集作用靶點(diǎn)的基因名(gene name)，刪除重復(fù)或者無效靶點(diǎn)，共獲得沙棘油脂肪酸成分的作用靶點(diǎn)208個。在DisGeNET數(shù)據(jù)庫中檢索篩選得到炎癥相關(guān)作用靶點(diǎn)共175個。

2.3 沙棘油抗炎的“成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò) 將篩選得到的成分靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape，建立沙棘油抗炎的“成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)。結(jié)果如圖2所示，共有372個節(jié)點(diǎn)，918條邊。

圖2 沙棘油抗炎作用的“成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)

2.4 沙棘油活性成分-抗炎靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò) 將沙棘油脂肪酸作用靶點(diǎn)與炎癥相關(guān)靶點(diǎn)取交集，結(jié)果如圖3所示，得到PTGS2、PIK3CG、PPARA、NR1H4、SLC22A5、PTPN1、PPARG、PTGER4、ABCB1、PLA2G4A、PTGES、ALOX5、RORC、LTB4R、NOS2、TRPV1、IL6、ALOX5AP、TRPA1共19個交集靶點(diǎn)，即為沙棘油抗炎的潛在作用靶點(diǎn)。

圖3 沙棘油抗炎的潛在作用靶點(diǎn)

PPI網(wǎng)絡(luò)如圖4所示，共有19個節(jié)點(diǎn)，48條邊，有1個潛在靶點(diǎn)未參與蛋白相互作用。該網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)平均連接度為5.05。

2.5 GO富集分析和KEGG通路分析結(jié)果 將19個交集靶點(diǎn)基因上傳到David在線數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO富集分析以及KEGG分析，得到具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)的GO條目共88條，富集得到15條相關(guān)通路。GO條目中生物學(xué)進(jìn)程(biological process，BP)共67條，細(xì)胞組分(cellular component，CC)共5條，分子功能(molecular function，MF)共16條。靶點(diǎn)基因主要參與細(xì)胞或亞細(xì)胞成分的運(yùn)動、蛋白激酶B信號的正調(diào)控、傷口愈合、RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控等生物學(xué)進(jìn)程，對應(yīng)質(zhì)膜、胞質(zhì)溶膠、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜等細(xì)胞組分以及蛋白質(zhì)結(jié)合、藥物結(jié)合、離子通道活性等分子功能，R語言可視化結(jié)果如圖5所示。

圖4 沙棘油抗炎的靶蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)

圖5 GO分析結(jié)果圖

此外，KEGG通路分析結(jié)果顯示的相關(guān)通路有酒精性脂肪肝、癌癥通路、TNF信號通路等，具體結(jié)果見表2，R語言可視化結(jié)果如圖6所示。

3 討論

沙棘油作為沙棘的主要活性成分，具有顯著抗炎效果，但沙棘油抗炎的作用機(jī)制尚不明確。本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，從沙棘油活性成分、作用靶點(diǎn)以及相關(guān)通路等方面對于沙棘油的抗炎機(jī)制進(jìn)行分析與討論。沙棘油中主要活性成分為脂肪酸類物質(zhì)含有大量不飽和脂肪酸。其中棕櫚油酸可降低白介素6(IL-6)基因以及過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)基因的表達(dá)，抑制NF-κB通路，從而起到降低炎癥因子的表達(dá)，達(dá)到抗炎目的[10-11]。研究表明，特殊促愈合介質(zhì)(specialized pro-resolving mediators，SPMs)是一類具有特殊抗炎作用的生物活性分子，可能是多不飽和脂肪酸的抗炎基礎(chǔ)[12]。

在沙棘油抗炎的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)中，核心靶點(diǎn)為IL-6、PTGS2、ALOX5、PTGEP4等。其中IL-6是一種多功能炎性細(xì)胞因子，是炎性介質(zhì)網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵成分，在呼吸系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)及消化系統(tǒng)等炎癥反應(yīng)中起重要作用[13-14]。PTGS2的治療可通過降低血清中IL-1β、IL-6和TNF-α的水平及其mRNA表達(dá)來減輕類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠的炎癥。ALOX5是脂氧合酶(lipoxygenase，LOX)家族基因的一員，ALOX5編碼的5-LOX可催化炎癥介質(zhì)白細(xì)胞三烯(leukotriene，LT)和脂氧素(lipoxins，LX)生成[15]。

表2 KEGG通路分析結(jié)果

圖6 KEGG富集分析氣泡圖

通過KEGG信號通路氣泡圖的顏色和大小可以得出，沙棘油抗炎的主要通路有癌癥通路、非酒精性脂肪肝(NAFLD)等。NAFLD本身就是一種低濃度的全身性炎癥反應(yīng)，炎癥因子會參與疾病的進(jìn)展。脂質(zhì)在肝細(xì)胞中沉積，免疫細(xì)胞激活，促炎因子釋放，引起脂肪變性，而脂肪變性促進(jìn)炎癥的產(chǎn)生，炎癥反過來促進(jìn)單純肝脂肪變性向非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis,NASH)進(jìn)展[16-17]。炎癥因子與癌癥也密切相關(guān)，可以作用于腫瘤的發(fā)生、惡性轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)移等疾病進(jìn)程。NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作為炎癥的一個整體啟動子，在炎癥和腫瘤之間起到重要作用[18]。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，構(gòu)建出“沙棘油-靶點(diǎn)-炎癥”網(wǎng)絡(luò)模型，對沙棘油抗炎機(jī)制進(jìn)行了初步預(yù)測，分析了沙棘油抗炎相關(guān)靶點(diǎn)及信號通路?；谏鲜鲅芯?，可以發(fā)現(xiàn)沙棘油通過多成分多靶點(diǎn)對炎癥反應(yīng)進(jìn)行調(diào)控，為后續(xù)研究提供了指導(dǎo)意義。