葉面噴施亞精胺對干旱脅迫下閩楠幼苗生理的影響

胡勝男 王 波 李鐵華 張心藝 李陽寧 閆 旭 周 磊 羅亦伶

（1. 中南林業(yè)科技大學(xué)林學(xué)院，湖南 長沙 410004；2. 江西省林業(yè)科學(xué)院，江西 南昌 330032）

干旱能夠引起植物形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理生化及分子水平等一系列變化[1]，破壞植物葉綠體結(jié)構(gòu)，降低光合酶活性，使光合速率下降，同時還會使植物內(nèi)源激素紊亂，葉肉細(xì)胞損傷，導(dǎo)致葉片、根系等生長器官受到影響，生長緩慢，嚴(yán)重時甚至導(dǎo)致植物死亡[2]。隨著氣候變暖及水資源匱乏日益嚴(yán)重，我國干旱半干旱土地面積不斷增加，干旱已成為導(dǎo)致我國經(jīng)濟(jì)損失的嚴(yán)重災(zāi)害之一[3]，雖然南方降雨量大，但也存在季節(jié)性干旱，因此如何緩解干旱對植物的損傷已成為亟待解決的重要問題。多胺是植物內(nèi)源性成長調(diào)節(jié)劑之一，廣泛存在于包括植物體在內(nèi)的所有有機(jī)體中，對植物生長發(fā)育過程起著重要的調(diào)節(jié)作用，并參加植物對環(huán)境脅迫的響應(yīng)[4]。植物體中最常見的多胺有3種，分別是腐胺、亞精胺和精胺[5]。亞精胺是高等植物體中一種非常重要的多胺，諸多研究證明亞精胺與植株抗逆生理的關(guān)系較其他多胺更為密切[6]。施用外源亞精胺可提高植物組織亞精胺含量，減少葉綠素和蛋白質(zhì)的降解，提高抗氧化酶活性，有效地清除植物體內(nèi)的自由基和過氧化物等活性氧，延長植物生長時期，緩解干旱傷害，提高植物耐旱性[7-8]。王尚堃等[9]研究表明，干早脅迫下噴施適量的亞精胺可使杏（Armeniaca vulgaris）苗葉片的可溶性糖含量、脯氨酸（Pro）含量、葉綠素總含量及大部分光合參數(shù)顯著提高，丙二醛（MDA）含量下降；劉球等[10]研究得出，外源亞精胺處理可有效防御調(diào)節(jié)紅椿（Toona ciliata）葉片相對含水量、葉綠素含量、游離Pro含量和MDA含量等生理指標(biāo)，且1 mmol/L和2 mmol/L濃度防御效果更好；李麗杰等[11]對玉米（Zea mays）的結(jié)果表明，亞精胺顯著提高了葉綠素含量、凈光合速率（Pn）、氣孔導(dǎo)度（Gs）、和水分利用效率（WUE），促進(jìn)玉米生長；梁坤倫、王明艷等[12]發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫下施加外源亞精胺可提高牧草葉片超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物歧化酶（CAT）、過氧化物酶（POD）和抗壞血酸過氧化物酶活性，減少M(fèi)DA含量，同時還可提高Pn和Gs，增強(qiáng)WUE。

閩楠（Phoebe bournei）是我國特有的珍貴用材樹種，資源短缺，被列為國家二級珍稀瀕危樹種[13]。如今全球水資源匱乏，干旱對農(nóng)業(yè)、林業(yè)及園藝等生產(chǎn)領(lǐng)域的影響日益嚴(yán)重，閩楠苗木對水分要求較高，湖南、江西等大部分閩楠分布地都存在季節(jié)性干旱問題，如何緩解季節(jié)性干旱對閩楠的傷害，提高其耐旱性具有重要意義。目前對閩楠的研究中，對其干旱及抗旱機(jī)理研究很少，盧思等[14]研究了不同干旱脅迫及復(fù)水對閩楠葉片蛋白質(zhì)組及生理指標(biāo)的影響，靳月等[15]也研究了不同干旱脅迫對閩楠幼苗生長及生理影響，而關(guān)于如何緩解閩楠幼苗干旱及提高耐旱性的研究少之又少。諸多研究表明，亞精胺對緩解植物干旱起著重要作用，因此本研究以1年生閩楠幼苗為材料，研究干旱脅迫下施加不同濃度外源亞精胺對閩楠幼苗光合生理的影響，從而探究亞精胺對閩楠耐旱性的影響，進(jìn)而篩選出最佳亞精胺濃度，為緩解干旱對閩楠幼苗的傷害提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗以閩楠1年生實生幼苗作為試驗材料。2019年4月份從湖南金洞林場運(yùn)回閩楠1年生實生幼苗（平均苗高19.56±0.42 cm，平均地徑3.72±0.08 mm），每盆1株，栽種于20 cm×16 cm×13 cm的塑料花盆中，盆中土壤為壤土，pH值5.8左右。花盆置于中南林業(yè)科技大學(xué)林學(xué)院塑料大棚中，保持大棚通風(fēng)良好，只起擋雨作用。試驗開始前每天傍晚為幼苗澆水，保證幼苗水分充足，生長狀態(tài)良好。

1.2 試驗方法

1.2.1 干旱處理及各指標(biāo)測定

于2019年9月，選取生長狀態(tài)良好、無病蟲害、長勢相近的幼苗160株，分為4組，每組40株，進(jìn)行試驗處理。CK（葉片噴施清水）；A1（葉片噴施0.01 mmol/L濃度的亞精胺）；A2（葉片噴施0.1 mmol/L濃度的亞精胺）；A3（葉片噴施1 mmol/L濃度的亞精胺）。

試驗前3 d停止?jié)菜?，試驗開始后，根據(jù)Hsiao[16]提出的植物水分梯度劃分方法，利用稱重法對各組幼苗減少的水分進(jìn)行補(bǔ)充，保持土壤含水量為田間持水量的40%。每隔2 d對CK、A1、A2、A3各組幼苗葉片按處理方式用噴壺霧狀噴施清水及不同濃度的亞精胺，將所有葉片噴濕至無滴液，共噴施16次，為期32 d；隔8 d對各組幼苗進(jìn)行各指標(biāo)測定，共測4次。

選擇晴朗天氣于上午9：00—10:00采用LI?6400XT便攜式光合儀（LI?COR，美國）測定光合參數(shù)。每個處理隨機(jī)選取3株長勢均勻的幼苗，每株幼苗選擇同一方向，從上向下數(shù)第3、4、5片完全展開葉測定，每片葉重復(fù)測定3次，測定指標(biāo)為Pn、Gs、蒸騰速率（Tr）；采取成熟葉片，多株幼苗混合取樣，液氮保存，進(jìn)行Pro、MDA、CAT、POD、SOD的測定，每個處理每個指標(biāo)做3次重復(fù)。MDA含量采用硫代巴比妥酸法；Pro含量采用酸性茚三酮法；POD活性采用愈創(chuàng)木酚法；SOD活性采用N藍(lán)四唑光化還原法；CAT活性采用紫外吸收法[17]。

1.2.2 干旱緩解效果綜合評價

運(yùn)用模糊隸屬函數(shù)法篩選出對閩楠幼苗干旱緩解效果最好的處理組。具體方法為，求出各指標(biāo)隸屬值，所有指標(biāo)隸屬值平均數(shù)即為綜合評價值。綜合評價值與亞精胺對干旱脅迫損傷的緩解能力呈正相關(guān)。測量指標(biāo)與抗旱性呈正相關(guān)時選擇公式（1），呈負(fù)相關(guān)則選擇公式（2）。

式中：X表示某指標(biāo)的測定值；Xmin和Xmax分別表示某指標(biāo)的最小測定值和最大測定值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，Origin作圖，用SPSS 22.0對各組測定指標(biāo)進(jìn)行單因素方差分析和多重比較，采用模糊隸屬函數(shù)法進(jìn)行外源亞精胺最佳濃度篩選。

2 結(jié)果與分析

2.1 亞精胺處理對閩楠幼苗生長的影響

由表1可知，A1、A2、A3的苗高地徑增量均大于CK，但差異未達(dá)到顯著水平，苗高地徑增量均為A2最大；A1、A2、A3總生物量增量均大于CK，且與CK間差異顯著（P<0.05），A1、A2、A3間總生物量增量A2>A1>A3，A2與A1、A3差異顯著（P<0.05）。

表1 不同濃度亞精胺對干旱脅迫下閩楠生長的影響Table 1 Effects of different concentrations of spermidine on growth of P. bournei under drought stress

2.2 亞精胺處理對閩楠幼苗光合參數(shù)的影響

由圖1a可知，隨著干旱脅迫時間的延長，各處理的Pn變化趨勢一致，均呈逐漸下降的趨勢，A2下降幅度相對其他組較小。除第24天A3的Pn稍低于CK外，其他所有處理的Pn值均高于CK，差異達(dá)到顯著水平（P<0.05）；A2葉片Pn最高，與其他各組差異顯著（P<0.05），特別是在第24天時明顯高于其他組。A2在干旱脅迫第8天時Pn比CK高29.9%，第16天高61.4%，第24天高58.7%，第32天高82.1%。

由圖1b可知，各組Gs均隨脅迫時間的延長呈現(xiàn)逐漸下降的變化趨勢。A2的Gs最大，除第16天與A3差異不顯著外，其他時間與各組差異均達(dá)到顯著水平（P<0.05），尤其在脅迫第24天時，A2的Gs遠(yuǎn)高于其他組；干旱脅迫第8、16、24、32天，A2的Gs分別比CK高16.4%、2.0%、57.7%、41.5%。A1的Gs僅在第24天時稍高于CK，差異不顯著；A3的Gs始終高于CK，在第24天差異顯著（P<0.05）。

由圖1c可知，隨著干旱脅迫時間的延長，A1、A2、A3的Tr均呈現(xiàn)逐漸下降的變化趨勢，CK的Tr呈先下降后上升的變化趨勢。在脅迫第8天A1的Tr稍低于CK，差異不顯著，從第16天后逐漸高于CK，差異不顯著；A2的Tr除在脅迫第24天稍高于CK外，其余時間均低于CK，差異顯著（P<0.05）；A3的Tr一直低于CK，除第24天外差異均達(dá)到顯著水平（P<0.05）。

由圖1 d可知，CK的WUE呈先下降再上升再下降的變化趨勢；A1、A2的WUE均呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢，峰值均出現(xiàn)在干旱脅迫第16天；A3呈逐漸下降的變化趨勢。脅迫第8、16、32天，A1、A2、A3組WUE均高于CK，差異顯著（P<0.05）；A2的WUE明顯高于其他處理組，除了在第8天與A3差異不顯著外，其他時間與各組均存在顯著性差異（P<0.05）；脅迫第8、16、24、32天，A2分別比CK高了43.3%、75.1%、32.8%、123.7%。

圖1 不同濃度亞精胺對干旱脅迫下閩楠葉片光合參數(shù)的影響Fig. 1 Effects of different concentrations of spermidine on photosynthetic parameters of P. bournei leaves under drought stress

2.3 亞精胺處理對閩楠幼苗脯氨酸和丙二醛的影響

由圖2知，各組Pro含量都隨干旱時間的延長呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢，脅迫第8天時含量最小，第32天達(dá)到最大。脅迫第8天時，A1、A2、A3的Pro含量與CK相差較小，僅A2與其他各組存在顯著性差異（P<0.05）；但從第16天起，各組Pro含量都迅速上升，且A1、A2、A3的Pro含量明顯低于CK，差異顯著（P<0.05）。脅迫第16天A1、A2、A3Pro含量分別比CK低40.1%、33.5%、43.4%，第24天時分別低23.7%、16.2%、41.0%，第32天時分別低13.8%、21.6%、28.9%。

圖2 不同濃度亞精胺對干旱脅迫下閩楠葉片Pro的影響Fig. 2 Effects of different concentrations of spermidine on Pro of P. bournei leaves under drought stress

由圖3可知，隨著干旱時間的延長，各組MDA含量均呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢，CK上升幅度明顯大于A1、A2、A3，且A1、A2、A3的MDA含量均明顯小于CK，差異顯著（P<0.05），但從第16天起差值逐漸增大。脅迫第8天時A1、A2、A3的MDA含量分別比CK低7.5%、15.9%、20.1%，第16天時分別低7.8%、20.6%、17.8%，第24天時分別低16.5%、26.3%、28.9%，第32天時分別低18.9%、22.6%、29.5%。

圖3 不同濃度亞精胺對干旱脅迫下閩楠葉片MDA的影響Fig. 3 Effects of different concentrations of spermidine on MDA of P. bournei leaves under drought stress

2.4 亞精胺處理對閩楠幼苗抗氧化酶活性的影響

由圖4a可知，各組SOD活性均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在第16天時達(dá)到峰值。在脅迫第8天時，A1、A2、A3的SOD活性均低于CK，差異不顯著；隨著干旱時間的延長，從第16天開始，A1、A2、A3的SOD活性逐漸超過CK，特別在第32天差異顯著（P<0.05），A1、A2、A3分別比CK高45.4%、41.1%、20.8%。

圖4 不同濃度亞精胺對干旱脅迫下閩楠葉片抗氧化酶活性的影響Fig. 4 Effects of different concentrations of spermidine on the activities of antioxidant enzymes of P. bournei leaves under drought stress

由圖4b可知，除A1在脅迫第24天POD活性稍有降低外，各組POD活性整體上呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，峰值都出現(xiàn)在第16天。脅迫第8天時，A3的POD活性最高，與A1、A2差異顯著（P<0.05），A2最低，與其他組差異顯著（P<0.05）；第16天時，CK的POD活性最高，A2最低，與其他各組差異顯著（P<0.05）；第24天時，CK組POD活性最高，A1最低，差異顯著（P<0.05）；第32天時，A1的POD活性最高，A2最低，與其他處理差異顯著（P<0.05）。

由圖4c可知，隨著干旱時間的加長，閩楠幼苗CAT活性總體上呈先升高后降低的趨勢，峰值出現(xiàn)在第16天。干旱脅迫第8天時，A1、A2、A3的CAT活性都低于CK，A1與CK差異顯著（P<0.05）；從第16開始，A1、A2、A3的CAT活性逐漸開始高于CK，尤其在第24天和32天A1、A2的CAT活性明顯高于CK，存在顯著性差異（P<0.05）；第24天時A1、A2分別比CK高14.7%、22.3%，第32天分別高47.0%、35.1%。

2.5 模糊隸屬函數(shù)法篩選外源亞精胺最佳濃度

由表2可知，整體來說各濃度的亞精胺對閩楠的干旱緩解都有顯著提升，A2的綜合評價值最高，綜合評價值達(dá)到0.789 9，A1的綜合評價值最低，綜合評價值僅0.281 2。說明在干旱脅迫下，0.1 mmol/L亞精胺對閩楠幼苗的光合及生理的緩解或保護(hù)效果最優(yōu)。

表2 干旱脅迫下不同濃度亞精胺處理的各指標(biāo)隸屬函數(shù)值Table 2 Membership function values of each index treated with different concentrations of spermidine under drought stress

3 結(jié)論與討論

苗高地徑等生長指標(biāo)是反映苗木受害程度最直觀因子，可以明顯地反映出逆境環(huán)境對苗木生長的影響[18]。本研究表明，在干旱脅迫下噴施不同濃度外源亞精胺對閩楠幼苗的苗高、地徑及總生物量均高于噴施清水的對照組，尤其對總生物量影響顯著。適量外源亞精胺可以緩解干旱對苗木葉片及根系等的損傷，增強(qiáng)苗木光合作用以及對土壤水分及營養(yǎng)的吸收和利用[19]，增加苗木生物量積累，有效地減輕了干旱對閩楠苗木生長的抑制作用，這與吳旭紅等[20]研究結(jié)果一致。

光合作用是植物重要的生理代謝過程，是植物生長發(fā)育和能源的主要來源[21]，同樣它也是植物對環(huán)境脅迫最敏感的生理過程之一[22]。干旱脅迫下，植物光合效率降低的原因主要有兩類，一是的植物自身關(guān)閉部分氣孔導(dǎo)致的氣孔限制，二是葉肉細(xì)胞光合活性下降導(dǎo)致的非氣孔限制[23]。本研究中，隨著干旱時間的延長，閩楠幼苗Pn、Tr和Gs均呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢，說明光合速率下降的原因可能是植物為了減少內(nèi)部水分流失而引起的氣孔限制，導(dǎo)致CO2進(jìn)入葉片受阻，光合原料減少，光合速率降低；氣孔張開程度減小，葉片Tr隨之降低；WUE先上升后下降，這是由于干旱前期氣孔關(guān)閉，水分散失減少，提高了閩楠幼苗對水分的利用率，而后期由于干旱加重，水分虧缺，WUE又下降。噴施外源亞精胺能有效地維持閩楠幼苗氣孔張開程度，保持較高的Pn，研究表明，亞精胺可通過調(diào)節(jié)保衛(wèi)細(xì)胞膜上K+通道，調(diào)控氣孔關(guān)閉程度，減輕氣孔對光合的抑制作用[24]。A2、A3的Tr總體上低于CK，差異顯著，這說明雖然亞精胺處理使閩楠維持較高Gs，卻不會大幅度增加Tr值，有利于閩楠維持自身水分，減少水分散失。WUE是光合速率與蒸騰速率的比值，亞精胺處理減小了干旱對閩楠Gs的影響，維持了Pn，同時氣孔可以根據(jù)環(huán)境條件來調(diào)節(jié)開度大小，使植物在損失較少水分的情況下獲得最多的CO2，因此使閩楠保持了較高WUE。干旱脅迫下施用外源亞精胺減輕了閩楠光合作用的下降程度，這是由于亞精胺可以促進(jìn)植物組織滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累，提高滲透調(diào)節(jié)能力，利于水分的吸收與利用，同時能夠調(diào)控質(zhì)膜離子通道，保持氣孔開放和細(xì)胞內(nèi)CO2濃度的穩(wěn)定，減輕氣孔限制，維持植物光合速率。Yin等[25]對歐李（Cerasus humilis）幼苗的研究結(jié)果也表明，外源亞精胺能顯著提高光合能力，并有助于維持水分脅迫下幼苗的SOD和POD活性；陳小民[26]研究表明，干旱脅迫下藍(lán)莓（Vacciniumspp.）葉片失綠嚴(yán)重，葉片相對含水量（RWC）、葉綠素含量、Pn都呈下降趨勢，而噴施亞精胺的藍(lán)莓植株葉片外形良好，RWC、葉綠素含量、Pn都顯著增加。

Pro是植物體內(nèi)一種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，脅迫條件下Pro的積累能夠降低細(xì)胞的滲透勢，維持細(xì)胞一定膨壓，防止細(xì)胞脫水，保護(hù)細(xì)胞膜系統(tǒng)，保證氣孔運(yùn)動和光合作用等生理過程正常進(jìn)行，防止或減輕植物因干旱受到的傷害[27]。干旱脅迫下植物體內(nèi)酶系統(tǒng)混亂、水解酶類活性增強(qiáng)、蛋白質(zhì)合成受阻、水解加劇等各種原因?qū)е碌鞍踪|(zhì)含量下降，蛋白質(zhì)的降解在細(xì)胞內(nèi)會形成游離Pro，因此干旱脅迫下Pro含量增加，原因之一是其參與合成蛋白質(zhì)減少；此外，在Pro的合成途徑中，脯氨酸合成酶活化導(dǎo)致Pro合成加強(qiáng)且降解受阻，也是Pro含量增加的重要原因之一[28]。本研究中，隨著干旱時間的延長，各組Pro含量均呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢，原因是隨著干旱程度的加重，閩楠幼苗需要通過積累Pro，來減輕干旱脅迫帶來的損害。秦嶺等[29]研究也表明，Pro含量升高是植物應(yīng)對外界刺激的一種自我防御機(jī)制，在一定的干旱強(qiáng)度的范圍內(nèi)，Pro含量會隨著干旱強(qiáng)度的增強(qiáng)而逐漸增加。本研究A1、A2、A3的Pro含量均低于CK，說明CK相對于A1、A2、A3來說受脅迫程度更大，亞精胺降低了閩楠的干旱程度，因此Pro積累量低于CK，這說明施加外源亞精胺可有效緩解閩楠幼苗的干旱程度。劉歡等[30]研究中也有相似結(jié)論，他的研究表明，不同程度干旱Pro累積量不同，中度干旱含量最高，其次為重度干旱，輕度干旱量最低，重度干旱Pro含量低于中度干旱的原因可能是，嚴(yán)重干旱脅迫導(dǎo)致植物接近死亡。

干旱脅迫會損傷植物膜結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生活性氧自由基以及過氧化氫等過氧化物，而MDA是膜脂過氧化的最終產(chǎn)物，MDA會導(dǎo)致細(xì)胞膜上蛋白質(zhì)、酶等失活，其含量越多，表明植物受到的傷害越大，因此常被用于鑒定細(xì)胞膜系統(tǒng)受損程度[31]。本研究表明，隨著干旱時間延長，閩楠MDA含量呈上升趨勢，說明干旱加重使閩楠幼苗膜脂過氧化加重，MDA含量積累，損害了閩楠細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)。經(jīng)亞精胺處理的閩楠幼苗MDA含量明顯小于CK，說明外源亞精胺顯著降低了MDA含量，抑制或減輕了膜脂過氧化，在一定程度上減小了干旱脅迫對閩楠幼苗的損傷。這與顧帆[32]對高溫干旱脅迫下黃薇（Heimia myrtifolia）生理響應(yīng)的研究和全文選[33]對干旱脅迫下馬尾松（Pinus massoniana）的研究結(jié)果一致。

植物遭受干旱脅迫后，體內(nèi)的活性氧（ROS）不能及時代謝而大量囤積[34]，破壞細(xì)胞膜脂結(jié)構(gòu)，使植物生理活動不能正常進(jìn)行，此時，植物會利用體內(nèi)的抗氧化酶來清除活性氧，保護(hù)自身不受損傷[35]，因此抗氧化酶活性可以作為一種重要的抗旱指標(biāo)[36]。本研究中，隨著干旱時間的延長，SOD、POD、CAT酶活性均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，原因是隨干旱程度逐漸加重，閩楠需要增強(qiáng)體內(nèi)抗氧化酶活性以清除活性氧過量積累，防止或減輕自身受到損傷，干旱程度過重時會破壞保護(hù)酶活力，導(dǎo)致酶活性有降低。SOD酶使超氧自由基和H+結(jié)合，生成H2O2和O2，而H2O2在CAT的作用下生成H2O和O2，所以SOD活性增強(qiáng)的同時CAT活性也會隨之增強(qiáng)。研究表明，干旱脅迫導(dǎo)致植物組織NADPH氧化酶活性增強(qiáng)，ROS增多，而施用外源亞精胺，可降低NADPH活性，降低ROS，進(jìn)一步增強(qiáng)SOD、POD、CAT活性，清除ROS，提高干旱適應(yīng)性[37]。隨著干旱程度的加重，抗氧化酶活性會受到不同程度損傷，亞精胺可在一定程度上維持抗氧化酶活性，大大降低閩楠受損傷的程度，這與Chen[38]對高叢藍(lán)莓（Vaccinium corymbosum）的研究以及胡景江[39]對油松（Pinus tabuliformis）的研究結(jié)果相一致。

本研究表明，干旱脅迫下，噴施外源亞精胺可使閩楠幼苗Pn、Gs、WUE保持在較高水平，同時提高抗氧化酶活性來清除活性氧，降低了閩楠膜脂過氧化程度，減小膜損傷，緩解了閩楠幼苗因干旱受到的損傷；從光合及生長的角度來看，0.1 mmol/L亞精胺維持效果最好，對抗氧化酶來說，0.01 mmol/L亞精胺和0.1 mmol/L亞精胺效果差別不明顯。綜合所有指標(biāo)來看，A2綜合評價值最高，達(dá)到0.789 9。因此，在土壤含水量為田間持水量40%的中度干旱脅迫下，噴施一定濃度外源亞精胺有助于緩解干旱對閩楠幼苗的損傷，維持一定生長量，0.1 mmol/L外源亞精胺的效果最優(yōu)。