石仙桃多糖對帕金森病大鼠模型抗氧化損傷和神經(jīng)保護作用研究

周乃強 趙世元 梁曉坤

廣西壯族自治區(qū)崇左市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣西崇左 532200

帕金森?。≒arkinson's disease，PD）是一種神經(jīng)損傷和黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元進行性損傷導致運動功能障礙的神經(jīng)系統(tǒng)疾病。帕金森病表現(xiàn)為靜止性震顫、僵硬、運動遲緩和逐漸失去正性反射。左旋多巴是治療帕金森病的主要藥物[1]。在帕金森病中，中腦小膠質(zhì)細胞的過度激活觸發(fā)了毒性和非記憶性介質(zhì)的合成，如誘導型一氧化氮和環(huán)氧合酶-2（COX-2），并釋放自由基，而自由基反過來又導致了人類和動物模型中多巴胺神經(jīng)元的凋亡[2]。在病理條件下，氧化應激可刺激細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導途徑，使單核細胞產(chǎn)生大量炎癥介質(zhì)從而促進炎癥反應的發(fā)生，在帕金森病發(fā)生發(fā)展過程中伴隨著炎癥反應[3]，因此靶向抗炎治療也可作為治療帕金森病的一種治療策略。

課題組前期實驗表明：石仙桃多糖能抑制大鼠氣道平滑肌細胞增殖[3]。石仙桃多糖對肺炎支原體肺炎模型小鼠有較好治療效果[4]。本研究將在帕金森動物整體模型基礎上，采用電鏡、酶聯(lián)免疫技術(shù)、分子生物學等技術(shù)，觀察石仙桃多糖抗氧化損傷和神經(jīng)保護作用，為石仙桃多糖開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗藥物（石仙桃多糖）的提取

石仙桃多糖（PCLP）的提取參考文獻[5]。取石仙桃鱗莖，洗凈曬干。1 kg加4 L蒸餾水80℃回流6 h，冷卻后加1倍體積95%乙醇沉淀，用丙酮和乙醚萃取沉淀物3次，Sevag法去除蛋白，用95%乙醇沉淀，再將沉淀物水解、醇沉，用丙酮和乙醚脫水，重復操作數(shù)次，得石仙桃多糖。經(jīng)高效色譜檢測，在260～280 nm無吸收峰，收集多糖。樣品真空包裝、冰箱冷藏保存。

1.2 實驗動物

120只SPF級雄性SD大鼠，體重200～220 g，由湖南斯萊克景達實驗動物技術(shù)有限公司提供，動物許可證號SCXK（桂）2016-0002。大鼠均飼養(yǎng)在22℃、相對濕度為30%且無病原體環(huán)境下，單籠喂養(yǎng)，自由進食，自由活動。動物適應2周后可以進行實驗。實驗嚴格遵守動物倫理委員會的法律法規(guī)，實驗均符合動物行為規(guī)范。小鼠腹腔注射MPTP 20 mg/kg，每晚1次，連續(xù)5 d。行為測試應在最后一次注射MPTP后3天進行。

1.3 主要試劑

6-羥基多巴胺（6-OHDA，美國Sigma公司，批號：20181203）；丙二醛（MDA）試劑盒（碧云天生物技術(shù)公司，批號：2019082101）；一抗酪氨酸羥化酶（TH）多克隆抗體（美國Santa Cruz公司，批號：20191103）；腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）和核因子κB（NF-κB），以上試劑由南京建成生物工程研究所提供。

1.4 PD大鼠模型制備、實驗動物分組及石仙桃多糖給藥方法

PD大鼠模型制備參考文獻[6]?？瞻讓φ战M：每只大鼠隔日皮下注射太陽花油10 ml/kg，共9次，每天灌胃生理鹽水5 ml/kg；模型組：每只大鼠隔日皮下注射魚藤酮溶液（用太陽花油溶解，1 mg/kg，共9次），劑量相當于10 ml/kg，并在藥物治療的同時每天灌胃生理鹽水5 ml/kg；陽性對照組：每只大鼠隔日皮下注射魚藤酮溶液（1 mg/kg，共9次），每天用左旋多巴灌胃10 mg/kg。石仙桃多糖低劑量組：每只大鼠隔日皮下注射魚藤酮溶液（1 mg/kg，9次）并灌胃石仙桃多糖15 mg/kg；石仙桃多糖中劑量組：每只大鼠隔日皮下注射魚藤酮溶液（1 mg/kg，9次）并灌胃石仙桃多糖20 mg/kg，石仙桃多糖治療高劑量組：每只大鼠隔日皮下注射魚藤酮溶液（1 mg/kg，9次）并每天灌胃石仙桃多糖30 mg/kg。每組動物實驗從第1天開始，最后一次給藥是第18天。給藥期間，觀察大鼠毛發(fā)、進食量、活動情況、精神狀況及對刺激的逃避反應。第19天，進行行為學檢測，步驟如下。1.4.1 滾軸試驗 將大鼠放置滾軸上以4 r/s速度轉(zhuǎn)動，當加速到5 r/s開始計時，當大鼠掉落滾軸時停止計時，記錄時間。每分鐘檢測一次，共檢測5次，取平均值。

1.4.2 網(wǎng)格試驗 將大鼠置于水平金屬網(wǎng)格（12 cm×12 cm，格間距為1 cm）上，大鼠四腳爪均抓住網(wǎng)格線，180°向下翻轉(zhuǎn)網(wǎng)格裝置并計時，當大鼠掉落網(wǎng)格時停止計時，懸掛時間超過180 s時均計為180 s，每隔2分鐘進行測試一次，共測試5次，取平均值。

運動評估完成后1 d，在氯胺酮麻醉下用頸椎脫臼處死大鼠。在大鼠頭骨上開洞，解剖大腦。每個大腦被分成兩個獨立的半球。右半球立即在液氮中冷凍，隨后分離紋狀體，用于生化指標檢測。左半球用中性福爾馬林（1∶10 v/v）固定24 h，將標本用乙醇脫水，用二甲苯清除，并嵌入聚對苯二甲酸乙二醇。在黑質(zhì)水平切取4 μm厚的切片，用于免疫組織化學。

1.5 紋狀體多巴胺和丙二醛水平的測定

先用雙縮脲法檢測組織勻漿蛋白，再采用熒光分光光度法測定DA，采用分光光度法檢測MDA，操作按試劑盒產(chǎn)品使用說明書進行。

1.6 PD大鼠紋狀體炎癥因子TNF-α、NF-κB和IL-1β的表達測定

從紋狀體組織中提取總mRNA，采用Promega結(jié)構(gòu)變異總RNA分離系統(tǒng)進行分離。提取的RNA濃度和純度用貝克曼DU-6400紫外可見分光光度計進行波普掃描，樣本在-80℃下保存。檢測TNF-α、IL-1β和NF-κB的表達，使用的特定引物如下： ①NF-κB： 5'-CAATGGCTACACAGGACCA -3'and 5'-CACTGTCACCTG GAACCAGA-3'；②TNF-α： 5'-TCTACTGAACTTCGGGGTGATCG -3'、5'- TGATCTGAGTGTGAGGGTCTGGG -3'；③IL-1β：5'-GCTCATCTGGGATCCTCTCC-3' and 5'- CCTGCCTGAAGCTCTTGTTG -3'；④β-actin ：and 5'-ACGGCCAGGTCATCACTATTG-3'and 5'- CAAGAAGGAAGGCTGGAAAAGA -3'

使用Promega GoTaq?1步RTqPCR系統(tǒng)進行實時PCR。反應混合物包括4 μlRNA模板、1 μl每個引物、10 μl GoTaq?qPCR主混合物、0.4 μl GoScript?RT混合，0.31 μl CXR參考染料，和無核酸酶的水。實時PCR熱循環(huán)儀（StepOnePlus?；應用生物系統(tǒng)公司，MA，USA）用于檢測和收集結(jié)果，在37℃下開始反轉(zhuǎn)錄15 min。

1.7 黑質(zhì)酪氨酸羥化酶的免疫組化研究

將腦組織切片（4 μm）在37℃下放置過夜。每組取兩片，去乙?；偎?，用pH=9 Tris-EDTA洗滌。將原代兔多克隆抗磷酸酪氨酸羥化酶（TH）抗體稀釋成1∶800，并用該稀釋液滴到組織切片中，在4℃冰箱中孵育過夜，用生物素化二級抗體染色覆蓋染色60 min，最后用蘇木精復染。用光學顯微鏡在×100和×400放大倍數(shù)下，對每個組織切片中黑質(zhì)致密部的邊界進行檢查和成像。

1.8 統(tǒng)計學方法

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0統(tǒng)計學軟件進行分析。正態(tài)分布資料以（）表示，并用單因素方差分析（ANOVA）和t檢驗進行分析。不符合正態(tài)性分布的數(shù)據(jù)用K-W方差分析方法進行分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 石仙桃多糖對魚藤酮所致PD大鼠行為障礙的影響

模型組大鼠毛發(fā)變黃，活動減少，行動遲緩和震顫，精神不振，對刺激反應慢；行為學檢測結(jié)果，模型組的大鼠掉落滾的時間和掉落網(wǎng)格時間明顯較空白對照組縮短，在5 min內(nèi)表現(xiàn)出更多的停止次數(shù)，交叉方塊數(shù)量較少，活動指數(shù)較低（P＜0.05）。與模型組相比，陽性對照組大鼠活動增強，交叉方塊數(shù)量更多，活動指數(shù)更大，停止次數(shù)更少；石仙桃多糖組表現(xiàn)輕微。石仙桃多糖高劑量組大鼠，行為學檢測試驗中記錄的交叉方格數(shù)增多、停止次數(shù)減少和活性指數(shù)增加。見圖1。

圖1 石仙桃多糖對PD大鼠活動行為障礙的影響

2.2 石仙桃多糖對魚藤酮所致PD大鼠紋狀體多巴胺和丙二醛的影響

模型組大鼠紋狀體DA水平降低，陽性對照組可增加紋狀體DA水平。石仙桃多糖高劑量組顯著增加紋狀體DA水平，見圖2D。模型組紋狀體MDA含量較高，陽性對照組和石仙桃多糖低、中、高劑量組均顯著降低紋狀體MDA的水平（P＜0.05）。與陽性對照組相比，石仙桃多糖高劑量組對MDA水平的作用明顯優(yōu)于陽性對照組（P＜0.05）。見圖2E。

圖2 石仙桃多糖對魚藤酮所致PD大鼠紋狀體多巴胺和丙二醛的影響

2.3 石仙桃多糖對PD大鼠紋狀體炎癥因子TNF-α、NF-κB和IL-1β表達的影響

定量PCR檢測大鼠紋狀體中的炎癥因子TNF-α、NF-κB和IL-1β的結(jié)果表明，模型組與空白對照組大鼠相比，表達顯著增加（P＜0.05），陽性對照組大鼠紋狀體炎癥因子TNF-α、NF-κB和IL-1β表達下降（P＜0.05）。與模型組相比，石仙桃多糖低劑量組PD大鼠紋狀體炎癥因子TNF-α、NF-κB和IL-1β表達不顯著，石仙桃多糖中、高劑量組PD大鼠紋狀體炎癥因子TNF-α、NF-κB和IL-1β表達顯著降低（P＜0.05）。石仙桃多糖高劑量組大鼠紋狀體炎癥因子TNF-α、NF-κB和IL-1β呈低表達（P＜0.05），見表1。

表1 PD大鼠紋狀體炎癥因子TNF-α、NF-κB和IL-1β表達比較（± s）

表1 PD大鼠紋狀體炎癥因子TNF-α、NF-κB和IL-1β表達比較（± s）

注：與空白對照組相比，*P＜0.05；與模型組相比，#P＜0.05；與陽性對照組相比，$P＜0.05

組別 TNF-α NF-κB IL-1β空白對照組 2.65±0.35 1.25±0.21 1.86±0.31模型組 19.31±3.56* 24.84±4.25* 17.98±2.84*陽性對照組 7.82±1.26*# 11.25±2.38*# 6.53±1.48*#石仙桃多糖低劑量組 17.85±3.87*$ 22.43±4.56*$ 14.97±1.42*$石仙桃多糖中劑量組 13.26±2.46*# 19.68±3.42*# 10.36±2.48*#石仙桃多糖高劑量組 7.56±1.23*# 6.87±1.47*# 4.24±0.85*#

2.4 石仙桃多糖對PD大鼠紋狀體TH的影響

免疫組織HE染色，圖3a、b為HE染色黑質(zhì)神經(jīng)元的正常外觀；模型組TH陽性細胞數(shù)量減少，胞漿染色模糊，核固縮，見圖3c、d。石仙桃多糖干預處理相對增加了TH陽性神經(jīng)元的數(shù)量，其具有顯著的胞漿染色反應，見圖3e、f。石仙桃多糖高劑量組大鼠的腦切片顯示出對TH的強烈胞漿染色反應和較高百分比的TH陽性神經(jīng)元，表明石仙桃多糖具有強烈的神經(jīng)保護作用見圖3g。

圖3 各組大鼠黑質(zhì)酪氨酸羥化酶免疫組化HE染色注：圖a和b：空白對照組大鼠黑質(zhì)神經(jīng)元細胞免疫組化HE染色（×10和×40）；圖c和d：模型組TH陽性細胞數(shù)明顯減少（×10）；圖e和f：石仙桃多糖中、低劑量組的TH陽性細胞數(shù)明顯比模型組多（×10和×40）；圖g：石仙桃多糖高劑量組出現(xiàn)較多的TH陽性數(shù)目；圖h：陽性對照組TH高表達（×10和×40）

3 討論

石仙桃屬（Pholidota）是蘭科（orehidaeeae）植物，別名石橄欖、石上仙桃和石上蓮等。石仙桃的主要成分是多糖，含量2.25%[7]。研究發(fā)現(xiàn)多糖具有抗病毒、抗炎、抗腫瘤、抗凝血、降糖等多方面的生物活性[8]。本課題組采用石仙桃多糖，通過建立肺炎支原體（mycoplasma pneumoniae，MP）肺炎模型BALB/c小鼠模型，通過定量培養(yǎng)肺泡灌洗液（BALF）肺炎支原體、肺組織病理學評分（HPS）和檢測BALF中IFN-γ、TNF-α、IL-1、IL-12等的表達，探討石仙桃多糖治療肺炎支原體肺炎小鼠的可能作用機制。研究結(jié)果：石仙桃多糖干預肺炎支原體模型小鼠1～3 d，能迅速調(diào)節(jié)MPP小鼠體內(nèi)的免疫功能，小鼠BALF中IL-1β、IFN-γ、IL-12、TNF-α等細胞因子明顯下調(diào)，輔助性Th1細胞因子明顯降低，小鼠肺部炎癥明顯減少，其作用機制可能參與調(diào)節(jié)肺炎支原體模型小鼠體內(nèi)Th1/Th2細胞有關(guān)[9]。

帕金森病是一種神經(jīng)退行性疾病，主要由紋狀體多巴胺能神經(jīng)元損傷引起。一些與氧化應激和炎癥有關(guān)的生化異常也在帕金森病腦中被發(fā)現(xiàn)[10]。臨床和動物研究的數(shù)據(jù)表明，神經(jīng)炎與帕金森病病理學及神經(jīng)退行性機制相關(guān)[11]。 魚藤酮是一種高親脂性殺蟲劑和除草劑，它容易穿過生物膜，常用于誘發(fā)帕金森病運動功能障礙動物模型。其機制是阻斷復合體I中的線粒體電轉(zhuǎn)運鏈，從而降低選擇性影響黑質(zhì)神經(jīng)元的氧化磷酸化。魚藤酮作為檢查嚙齒類動物氧化應激所致多巴胺能損傷機制的一個有價值的工具，氧化應激在帕金森病的病理學中起著重要作用。應用魚藤酮建立的PD動物模型不僅很好地模擬PD突觸核蛋白聚集和路易小體形成，而且還可以復制PD的所有癥狀[12]。

在本研究中，模型組引起的運動障礙類似于帕金森病，滾軸實驗和網(wǎng)格試驗中，大鼠停止次數(shù)增加，交叉方塊減少，活動明顯減少。與模型組相比，石仙桃多糖高劑量組大鼠這種運動障礙得到改善，其方形數(shù)量增加，停止次數(shù)減少。石仙桃多糖高劑量組紋狀體多巴胺水平高于模型組；石仙桃多糖低、中劑量組處理PD模型導致紋狀體多巴胺水平略有增加，但不足以顯著改善運動行為。

細胞因子在神經(jīng)退化過程中起重要作用。在帕金森病患者中，研究顯示NF-κB向細胞核的易位顯著增加[13]，并伴有誘導的細胞因子轉(zhuǎn)錄[14]。此外，發(fā)現(xiàn)帕金森病患者大腦中IL-1β、IL-6、IL-2和IL-4水平上調(diào)[15]。本研究結(jié)果表明，模型組紋狀體中TNF-α、IL-1β和NF-κB的表達水平較高。石仙桃多糖高劑量組大鼠上述細胞因子表達大幅下降。與模型組相比，石仙桃多糖高劑量組免疫組化出現(xiàn)的TH神經(jīng)元數(shù)量增加，本研究結(jié)果與Strathern等[16]實驗結(jié)果一致。

綜上所述，本研究表明石仙桃多糖具有顯著的抗氧化、抗損傷和神經(jīng)保護作用。本研究初步認為，石仙桃多糖神經(jīng)保護活性可能與其消炎抗菌作用有關(guān)，課題組將在動物實驗基礎上進行深入臨床研究。