大動(dòng)物模型在耳科學(xué)研究中的應(yīng)用

翟天穎 郭維維

解放軍總醫(yī)院第六醫(yī)學(xué)中心耳鼻咽喉頭頸外科醫(yī)學(xué)部，國家耳鼻咽喉疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，聾病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，聾病防治北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（北京 100039）

耳科學(xué)是研究聽覺與平衡系的重要學(xué)科，其常見疾病為聾病與暈病，我國目前有聾病患者2700萬人，其中聾啞人200多萬，并以每年3萬多的數(shù)量在增長。聾病給個(gè)人、家庭及社會(huì)帶來巨大的痛苦和沉重負(fù)擔(dān)，防聾治聾是全社會(huì)的共同責(zé)任，是全面建設(shè)健康中國的重要內(nèi)容之一，而加強(qiáng)耳科學(xué)的基礎(chǔ)與臨床研究，尤其是拓展聾病基礎(chǔ)研究，創(chuàng)新聾病的治療技術(shù)是解決上述問題的關(guān)鍵。

1 動(dòng)物模型在科學(xué)研究中意義

醫(yī)學(xué)創(chuàng)新性研究離不開動(dòng)物實(shí)驗(yàn),動(dòng)物模型是生物醫(yī)學(xué)研究中極其重要的實(shí)驗(yàn)方法和手段。關(guān)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇有以下幾個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)：首先要考慮物種的電生理學(xué)與解剖學(xué)是否符合實(shí)驗(yàn)要求，所需要的生存空間和飼養(yǎng)成本是否合理，飼養(yǎng)和繁殖的條件是否苛刻，要考慮動(dòng)物在研究中是否相對(duì)常用且符合倫理學(xué)要求，盡量不使用爭議較大的動(dòng)物作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物；其次要考慮物種是否可用于人類醫(yī)學(xué)診斷和外科技術(shù)，另外還要考慮該動(dòng)物模型是否可用于基因工程并且能夠進(jìn)行有效的基因編輯。合適的動(dòng)物模型是決定生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)價(jià)值的關(guān)鍵，生物醫(yī)學(xué)研究的進(jìn)展在一定程度上依賴于作為實(shí)驗(yàn)和臨床假說的試驗(yàn)基礎(chǔ)的動(dòng)物模型。

在毛細(xì)胞的相關(guān)研究中，斑馬魚也是一種應(yīng)用較多的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，斑馬魚已被廣泛用于了解眼睛和內(nèi)耳發(fā)育的基本機(jī)制。斑馬魚的視覺和前庭聽覺系統(tǒng)與人類的視覺和前庭聽覺系統(tǒng)非常相似，雖然尚未成熟，但它們?cè)谑芫?天即可發(fā)揮功能，但其作為魚類不具備哺乳類動(dòng)物的相關(guān)特性，研究僅能停留在針對(duì)毛細(xì)胞的層面[1]。

嚙齒目動(dòng)物因其體型及內(nèi)耳體積較小，發(fā)育成熟較晚，解剖結(jié)構(gòu)與人類差異較大[2]，因而阻礙了此動(dòng)物模型在耳科領(lǐng)域的進(jìn)一步應(yīng)用。和人類相比，部分動(dòng)物的電生理和人存在較為顯著的差異，例如在聽性腦干反應(yīng)（auditory brainstem response,ABR），測試中，小鼠和豚鼠等嚙齒目由于Ⅱ波的出現(xiàn)頻率較高，常用Ⅱ波來判斷閾值的存在，但在對(duì)于人的臨床檢測中，通常使用V波來判斷閾值[3]?；诖嗽?，嚙齒目的實(shí)驗(yàn)結(jié)果雖然能夠轉(zhuǎn)化為臨床，但是仍舊需要大動(dòng)物模型來支撐結(jié)論[4]。這一動(dòng)物實(shí)驗(yàn)復(fù)雜性也就促進(jìn)了大動(dòng)物模型的建模和開展。狗的電生理特性也較為接近人類，也在耳科的疾病研究中被應(yīng)用為試驗(yàn)動(dòng)物，但由于狗的研究耗時(shí)更長、勞動(dòng)較為密集并且相對(duì)昂貴。此外，狗作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的飼養(yǎng)沒有相對(duì)成熟的飼養(yǎng)體系和飼養(yǎng)空間，這是使用該物種的一個(gè)主要障礙。由于各種模型的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)相對(duì)短缺，因此關(guān)于狗模型的研究和開展受到限制。同時(shí)，使用狗作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物存在較大的倫理爭議，這也是狗模型的一個(gè)重要限制因素[5]。

而豬這一大動(dòng)物模型，在近年的研究中不斷興起。使用豬作為大動(dòng)物模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)有幾個(gè)比較明顯的優(yōu)勢[6]。首先豬與人的解剖結(jié)構(gòu)更為相似，基因同源性更高，解剖結(jié)構(gòu)與人高度相似同時(shí)中耳的大小也與人類接近[5]，與此同時(shí)，小型豬內(nèi)耳形態(tài)學(xué)及聽力發(fā)育和人類一樣，都是在胚胎的后期完成，這也就意味著耳蝸在出生時(shí)已經(jīng)發(fā)育成熟[7,8]。出于這些原因豬可以更好的彌補(bǔ)嚙齒動(dòng)物模型與人之間的差距，加上豬在倫理學(xué)方面存在的爭議相對(duì)較少，相對(duì)易于繁殖和飼養(yǎng)且可以進(jìn)行基因改造，因此發(fā)展豬這一大動(dòng)物模型是十分有必要的。

2 耳科動(dòng)物模型的現(xiàn)狀

對(duì)于常用的耳科研究方式，在此進(jìn)行了一個(gè)優(yōu)缺點(diǎn)的對(duì)比，見表1。由此可見各種研究方式都有長處與不足，但整體來看每個(gè)層面的模型都是不可或缺的。

表1 各類型耳科模型對(duì)象優(yōu)缺點(diǎn)對(duì)照Table 1 Comparison of advantages and disadvantages of various types of otology model objects

在耳科研究中，有兩個(gè)重要的研究部分：一個(gè)是耳蝸的相關(guān)生理特性的研究；另一個(gè)是利用電生理對(duì)聽力進(jìn)行評(píng)價(jià)。在這種情況下，對(duì)動(dòng)物模型與人之間耳蝸解剖學(xué)及電生理實(shí)驗(yàn)的相關(guān)特性進(jìn)行對(duì)比就顯得尤為有意義。在表2中，對(duì)不同物種與人之間關(guān)于耳蝸和電生理的生理參數(shù)進(jìn)行了對(duì)比[8,9]。

表2 動(dòng)物與人的生理參數(shù)的對(duì)照Table 2 Comparison of physiological parameters between animals and humans

3 耳科大動(dòng)物模型的建立及其應(yīng)用情況

在了解了大動(dòng)物模型相關(guān)的基本情況之后，嘗試對(duì)目前大動(dòng)物模型在耳科疾病中的已有的應(yīng)用現(xiàn)狀進(jìn)行了總結(jié)，下面對(duì)研究較為集中的幾類疾病和模型進(jìn)行了一個(gè)簡單的總結(jié)，以期發(fā)現(xiàn)一些有意義的規(guī)律和結(jié)論。

3.1 Waardenburg綜合征（Waardenburg Syndrome,WS）的動(dòng)物模型

WS是與內(nèi)耳相關(guān)的遺傳性疾病，是一種以聽覺-色素異常為特征的常染色體遺傳性疾病，多為顯性遺傳，也可表現(xiàn)為隱性遺傳。其主要的致病基因主要有6種，均與神經(jīng)嵴細(xì)胞的遷徙及分化有關(guān)，導(dǎo)致耳蝸血管紋中間層黑色素細(xì)胞的缺失[11]。動(dòng)物模型主要涉及到Sox1和Mitf-M等基因。盡管小鼠模型在更好地理解人類WS的病因和潛在治療方法方面取得了巨大成功，但仍存在許多局限性[8]。所有這些局限性限制了其應(yīng)用。首先對(duì)WS進(jìn)行一個(gè)分類如表3。

表3 四種WS的分型癥狀和基因Table 3 Symptoms and genes of four types of Waardenburg syndrome

主要癥狀：主要癥狀?感音神經(jīng)性聽力損失+眼睛、頭發(fā)和皮膚色素障礙。

3.1.1 Mitf-M基因和KIT基因的動(dòng)物模型（WS2類型的模型）

Mitf-M基因的作用主要是調(diào)控黑色素細(xì)胞的游走和血管紋的中間細(xì)胞的正常生理功能[12]，該基因突變會(huì)導(dǎo)致WS，這一基因?qū)е碌闹饕憩F(xiàn)為小眼球畸形。該基因缺失在小鼠中無法表現(xiàn)出和人類相似的先天性聽力缺失等性狀，主要原因可能與嚙齒目動(dòng)物的耳蝸的形態(tài)學(xué)與聽力發(fā)育有關(guān)[12,13]。小鼠的耳蝸形態(tài)學(xué)與聽力發(fā)育是在出生之后，所以在胚胎期無法檢測到和人類相似的發(fā)育過程及發(fā)育表現(xiàn)。但豬的形態(tài)學(xué)與聽力發(fā)育與人類一樣，都是在胚胎后期完成的，并且在出生時(shí)耳蝸已經(jīng)完全發(fā)育成熟[3]。因此豬的動(dòng)物模型在WS這一疾病中更具有優(yōu)勢。

在電生理實(shí)驗(yàn)中，小鼠與豬也有很大區(qū)別。在Mitf-M的小鼠中，耳蝸病變的主要表現(xiàn)是血管紋的異常，中間細(xì)胞的消失，和耳蝸內(nèi)電位降低[13]；但在豬模型中主要表現(xiàn)為Mitf-M基因突變導(dǎo)致耳蝸血管紋中間細(xì)胞消失、內(nèi)淋巴液K+濃度異常、耳蝸毛細(xì)胞發(fā)生退行性病變，耳蝸內(nèi)電位消失，最后導(dǎo)致嚴(yán)重耳聾[14,15]。

人類和小鼠中相同突變相關(guān)的表型差異表明，Mift/Mift的活性在每個(gè)物種中并不完全相同，或者M(jìn)ift對(duì)黑素細(xì)胞正常發(fā)育和分化的絕對(duì)要求在物種之間存在細(xì)微差異。

3.1.2 Kit基因的研究

Kit基因與Mift基因的部分作用重疊，和Mift一樣導(dǎo)致的是WS2型的WS，在這一基因相關(guān)的WS的探究中小鼠模型同樣存在相應(yīng)的缺陷，小鼠和人類之間的生物學(xué)差異也限制了它們?cè)谶M(jìn)一步治療研究中的應(yīng)用[14]。在Kit相關(guān)基因突變的研究中，小型豬可以作為一種有用的模型，彌補(bǔ)了遺傳和生理特征及其內(nèi)耳結(jié)構(gòu)與人類的高度相似性。在小鼠和大鼠中，Kit基因突變導(dǎo)致皮膚和毛發(fā)脫色以及耳聾，已被證明可中斷神經(jīng)嵴衍生黑素細(xì)胞的發(fā)育和遷移，導(dǎo)致中間細(xì)胞數(shù)量減少和血管紋畸形，導(dǎo)致無法產(chǎn)生正常的內(nèi)淋巴電位，并導(dǎo)致聽力損失，這些變化在豬模型中得到了同樣的證實(shí)[15,16]，然而，與其他Kit突變嚙齒動(dòng)物不同的是，豬模型和人類有一類似的過程，即耳蝸疾病開始于胚胎階段，耳蝸球囊退化主要在出生后觀察到。這種相似點(diǎn)使得豬模型和其他嚙齒目動(dòng)物模型相比具有更接近人類的研究價(jià)值[16]。

3.2 先天性單側(cè)耳聾模型（Congenital single-Sided Deafness，CSSD）

先天性單側(cè)聾主要是重度感音神經(jīng)性聾。單側(cè)聾模型作為先天性疾病，在嚙齒目動(dòng)物模型中的表現(xiàn)較差，原因可能是由于嚙齒目動(dòng)物的致聾基因與人類致聾基因的匹配率非常低，同時(shí)表觀遺傳學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)的差異也會(huì)帶來很大的不確定性。而豬的先天性單側(cè)聾的模型與人更接近。獲得有效實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的方式主要通過雜交來進(jìn)行，其表現(xiàn)用雄性個(gè)體是穩(wěn)定家譜最有效的方法[17]。該豬模型在臨床上高度模仿人類非綜合性CSSD[18]。但在檢測中也存在麻藥不耐受的情況，需要使用短聲ABR進(jìn)行檢測，并結(jié)合耳聲發(fā)射檢查[19]。相比于嚙齒目動(dòng)物，豬對(duì)于先天性單側(cè)聾的遺傳模型更容易獲得，同時(shí)基于與人的相似性，對(duì)于其單側(cè)聾的鑒定也更為清晰，且鑒定標(biāo)準(zhǔn)更接近于人類[18]。

3.3 干細(xì)胞治療與基因治療的耳科研究

耳科疾病中的許多細(xì)胞損傷是不可再生的，也因此促進(jìn)了再生醫(yī)學(xué)的出現(xiàn)與發(fā)展。而干細(xì)胞在耳科治療中的應(yīng)用前景也十分廣闊，目前由于血腦屏障的存在，干細(xì)胞治療和基因治療的實(shí)驗(yàn)大多選擇直接在內(nèi)耳給藥，而給藥的方式根據(jù)給藥部位的不同也劃分為許多種類，常用的是圓窗給藥法，半規(guī)管給藥法和蛛網(wǎng)膜下腔給藥法[19]。而直接給藥對(duì)于動(dòng)物模型的限制主要體現(xiàn)在動(dòng)物體型的大小，如果動(dòng)物體型過小，給藥量會(huì)相對(duì)受限，而使用大動(dòng)物模型會(huì)改善這類問題。

在追蹤研究中，有人使用順磁性氧化鐵標(biāo)記的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)耳聾豬的治療進(jìn)行了嘗試，使用的是感音神經(jīng)性聽力損失的小型豬動(dòng)物模型[20]。在成功篩選出標(biāo)記成功的干細(xì)胞之后，在給噪聲后的第一周和第二周將干細(xì)胞注射進(jìn)感音神經(jīng)性聾的小型豬體內(nèi)。最終發(fā)現(xiàn)噪聲后一周給予干細(xì)胞治療有較好的治療效果[21]。但同時(shí)干細(xì)胞治療的模型也存在許多問題，首先注射的干細(xì)胞無法特異性的對(duì)受損的毛細(xì)胞進(jìn)行修復(fù)，其次是無法明確干細(xì)胞的具體作用靶點(diǎn)及其相關(guān)信號(hào)通路。

3.4 基因治療和病毒轉(zhuǎn)染模型

基因治療中，病毒轉(zhuǎn)染的效率和效果是實(shí)驗(yàn)成功與否的關(guān)鍵。有研究者將豬的病毒轉(zhuǎn)染效果同嚙齒目動(dòng)物豚鼠的病毒轉(zhuǎn)染效果進(jìn)行對(duì)比，豬與豚鼠的區(qū)別在于表達(dá)量峰值出現(xiàn)的時(shí)間及轉(zhuǎn)染效率不同。小型豬轉(zhuǎn)染峰值出現(xiàn)時(shí)間較晚，并且轉(zhuǎn)染效率略低于豚鼠[21]。與此同時(shí)，嚙齒目動(dòng)物雖然擁有較高的轉(zhuǎn)染效率，但這種高轉(zhuǎn)染率在實(shí)際應(yīng)用中的成功在推廣到臨床實(shí)驗(yàn)時(shí)往往存在很多問題。一些嚙齒目動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中非常成功的基因治療藥物或抗癌藥物在進(jìn)行臨床實(shí)驗(yàn)時(shí)往往出現(xiàn)與動(dòng)物模型不甚相同的療效，這可能與轉(zhuǎn)染效率的不同有很大的關(guān)系。在豬模型中，轉(zhuǎn)染效率相對(duì)于嚙齒目動(dòng)物更低，而豬的解剖結(jié)構(gòu)和生理特性，尤其是在耳科方面與人也更為相似。這或許提示了在藥物的研發(fā)階段，大動(dòng)物模型是不可或缺的過渡階段，對(duì)于大動(dòng)物模型中藥物安全性和有效性的評(píng)價(jià)顯得尤為重要。

3.5 人工耳蝸植入

既往對(duì)各物種耳蝸鼓階長度測量研究顯示，小鼠和大鼠與人類的28.46mm相差較多[3]。前期研究顯示豬耳蝸與人更為接近，長度為39.47mm，轉(zhuǎn)數(shù)為3圈半，較人類耳蝸多出一圈[22]。研究顯示豬耳蝸完全可以容納臨床實(shí)際應(yīng)用的電子耳蝸電極，無需額外改造電極，可以完全再現(xiàn)耳蝸電極在體內(nèi)工作時(shí)的各種參數(shù)，得到寶貴的數(shù)據(jù)。大動(dòng)物模型可以說為電子耳蝸的數(shù)據(jù)收集，改良和臨床實(shí)驗(yàn)帶來了新的思路。豬電子耳蝸植入術(shù)后，耳蝸無明顯充血、感染，耳蝸外形良好。骨壁完整，圓窗處可見外露的電極，卵圓窗結(jié)構(gòu)完好。電極由耳蝸圓窗完全插入鼓階，24個(gè)電極觸點(diǎn)完全進(jìn)入到耳蝸內(nèi)，沿鼓階盤繞1.5轉(zhuǎn)，到達(dá)耳蝸中回。較為成功的達(dá)到了實(shí)驗(yàn)要求，方便了后續(xù)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行[23]。

4 小結(jié)

綜上所述，動(dòng)物模型是耳科疾病研究的基礎(chǔ)，沒有模型的支撐，就無法得到理想中的實(shí)驗(yàn)結(jié)論。而不同的研究需求下動(dòng)物模型的需求也不同，每種研究都應(yīng)該考慮每個(gè)模型和物種的優(yōu)缺點(diǎn)，取長補(bǔ)短。

本文對(duì)目前存在的耳科大動(dòng)物模型進(jìn)行了一個(gè)較為系統(tǒng)的描述，但實(shí)際上大動(dòng)物模型的研究也仍舊存在諸多問題，豬作為較為優(yōu)秀的耳科動(dòng)物模型也有其缺點(diǎn)和局限性，首先豬作為動(dòng)物模型的實(shí)驗(yàn)經(jīng)濟(jì)性較差，飼養(yǎng)條件苛刻，飼養(yǎng)費(fèi)用相對(duì)較高，同時(shí)豬的實(shí)驗(yàn)周期較長，實(shí)驗(yàn)周轉(zhuǎn)慢，同時(shí)類似人工耳蝸植入一類的手術(shù)實(shí)驗(yàn)條件要求較高，這些因素限制了豬作為大動(dòng)物模型的深入應(yīng)用，而同樣作為大動(dòng)物模型的狗同樣存在這些問題。

在今后的研究中大動(dòng)物的發(fā)展方向也很多。首先，豬的解剖結(jié)構(gòu)和生理特性更接近人類，未來或許能夠在藥物的臨床測試及電子耳蝸的臨床效果檢驗(yàn)中起到更大的作用，包括基因治療和干細(xì)胞治療的研究。其次，對(duì)于一些遺傳性染色體疾病，大動(dòng)物模型存在較大優(yōu)勢，部分疾病在嚙齒動(dòng)物中無法表現(xiàn)出與人類較為接近的病理特征，而豬等大動(dòng)物由于其胚胎發(fā)育特性，或許在這方面能有更加出色的表現(xiàn)。

建立完整的耳科動(dòng)物模型系統(tǒng)，選擇最優(yōu)的動(dòng)物模型解決問題，有助于推進(jìn)耳科疾病的研究更加科學(xué)和完善。