果樹脫毒技術(shù)研究進(jìn)展

李亞囡1，李學(xué)華1，范婧芳2，王文瑾1，董 輝1*

（1 河北省農(nóng)林科學(xué)院石家莊果樹研究所 石家莊 050061；2 河北省植保植檢總站）

果樹病毒脫毒就是利用一定的技術(shù)手段從現(xiàn)有的栽培種質(zhì)資源中篩選出不帶病毒的單株，或利用一定的方法和技術(shù)去除植株體內(nèi)的病毒，從而獲得無(wú)病毒的果樹苗木[1]。目前已報(bào)道的脫毒效率較高的技術(shù)有：熱處理脫毒法、莖尖培養(yǎng)脫毒法、微體嫁接脫毒法、熱處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)脫病毒法及應(yīng)用病毒抑制劑的化學(xué)處理脫毒技術(shù)等[2，3]。

1 熱處理脫毒技術(shù)

熱處理脫毒技術(shù)是最早研究并應(yīng)用在果樹脫毒處理中的方法之一，并且被普遍使用在果樹脫毒中[4]?；驹硎歉鶕?jù)病毒和寄主細(xì)胞對(duì)高溫的耐受性存在差異，利用高溫處理殺滅或延緩病毒繁殖，抑制病毒在果樹組織內(nèi)的侵染，進(jìn)而脫除病毒培育出無(wú)毒果樹[5]，同時(shí)對(duì)寄主細(xì)胞影響較小。該方法工藝簡(jiǎn)單，對(duì)設(shè)備要求低，能在較短時(shí)間內(nèi)清除病毒獲得無(wú)毒植株。在熱處理時(shí)，需綜合考慮不同果樹品種的熱耐受性以及抑制不同類型病毒復(fù)制侵染所需的溫度[6，7]，避免在熱處理過(guò)程中對(duì)果樹苗木生長(zhǎng)造成傷害。以梨樹脫毒技術(shù)為例，梨樹苗在37 ℃環(huán)境中處理28 d，可有效脫除矮化病毒、環(huán)斑花葉病毒和梨脈黃病毒，但梨樹苗木在此過(guò)程中也會(huì)有高達(dá)66%以上的死亡率[8]。此外，該技術(shù)對(duì)某些種類病毒（如桿狀病毒）無(wú)效，并且存在脫毒率低、脫毒不徹底等問題，因此該技術(shù)在實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用方面有待進(jìn)一步優(yōu)化和針對(duì)性研究[9]。

2 莖尖培養(yǎng)脫毒技術(shù)

病毒在被侵染植物體中的分布不均勻，通常在植株生長(zhǎng)點(diǎn)附近的組織中無(wú)病毒存在或病毒的含量較低[10]。因此可借助植物組織培養(yǎng)技術(shù)，利用果樹植株幼嫩組織部分或分生組織為材料進(jìn)行培養(yǎng)從而得到無(wú)毒材料，獲得完整的脫毒植株。

由于不同品種果樹生長(zhǎng)周期及其莖尖分生組織的形態(tài)大小各不相同，因此不同果樹的莖尖分生組織的獲取難度也不同[4，11]。此外，莖尖組織的大小與脫毒率、組織培養(yǎng)成活率直接相關(guān)。一般切取的莖尖越小，脫毒的效率越高。例如，利用莖尖培養(yǎng)脫毒技術(shù)獲得草莓脫毒苗的培養(yǎng)過(guò)程中，切取0.1～0.2 mm的莖尖分生組織時(shí)，脫毒率為100%；切取0.3～0.4 mm 的莖尖分生組織時(shí)，脫毒率為84.5%[1]。但切取0.1～0.2 mm的莖尖分生組織對(duì)技術(shù)要求極高，即使成功切取分生組織，其分化率和成活率均不高。因此，在進(jìn)行莖尖培養(yǎng)脫毒時(shí)需綜合考慮果樹品種、脫毒率以及成活率等多方面問題。進(jìn)一步研究表明，在兼顧成活率和脫毒率的條件下，切取長(zhǎng)度為0.2～0.5 mm、帶有1～2 個(gè)葉原基的莖尖進(jìn)行莖尖培養(yǎng)脫毒效果比較好[2，6]。

3 熱處理與莖尖培養(yǎng)結(jié)合脫毒技術(shù)

在實(shí)際操作中，使用一種脫毒方式往往無(wú)法完全脫除病毒，且操作難度大、處理?xiàng)l件要求較高。研究證明，熱處理脫毒技術(shù)和莖尖培養(yǎng)技術(shù)相結(jié)合可有效提高脫毒效率[6]，并且還能在一定程度上降低操作難度。以蘋果苗木為例，在使用這種復(fù)合脫毒技術(shù)后，能高效脫除蘋果莖溝病毒，其脫毒率高達(dá)90%以上[12]。

熱處理與莖尖培養(yǎng)結(jié)合脫毒的方法主要分為兩種[1]：一種是將果樹材料先熱處理操作，再?gòu)奶幚砗蟮闹仓晟汐@得莖尖分生組織培養(yǎng)為脫毒植株；另一種是先取相對(duì)較大的莖尖分生組織培養(yǎng)，然后對(duì)獲得的植株進(jìn)行熱處理操作，再取莖尖進(jìn)行再次分生培養(yǎng)。

4 微體嫁接脫毒技術(shù)

微體嫁接脫毒技術(shù)是結(jié)合組織培養(yǎng)與嫁接技術(shù)獲得無(wú)毒植株的一種新技術(shù)[13，14]，切取0.1～0.2 mm 的莖尖材料為接穗，嫁接到試管培養(yǎng)的無(wú)毒砧木上，從而培養(yǎng)成為完整的植株。該技術(shù)還可有效解決莖尖培養(yǎng)中培養(yǎng)材料誘導(dǎo)生根難的問題。Navarro 等[2]在柑橘植株脫除病毒的研究中應(yīng)用此技術(shù)，植株脫毒率可達(dá)80%以上，目前該技術(shù)已推廣到其它果樹品種。

5 化學(xué)處理脫毒技術(shù)

近年來(lái)隨著果樹脫毒技術(shù)研究的不斷深入，一些對(duì)植物病毒復(fù)制、侵染、擴(kuò)散有一定抑制作用的化學(xué)物質(zhì)被不斷發(fā)現(xiàn)[15，16]，如抗病毒醚（Ribavirin）、DHT（2，4-dioxohexa-hydro-1，3，5-triazine）等化合物均對(duì)植物DNA 或RNA 病毒具有抑制作用[17]。雖然這類物質(zhì)不能脫除所有病毒，但在莖尖組織培養(yǎng)和原生質(zhì)體培養(yǎng)過(guò)程中加入此類化學(xué)物質(zhì)，能抑制病毒復(fù)制[18]，具有一定實(shí)用價(jià)值。目前，此類化合物對(duì)病毒抑制的作用機(jī)制和實(shí)際應(yīng)用技術(shù)的研究還較為局限，未來(lái)需研發(fā)出能夠應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)的抗病毒制劑。

6 培育抗病毒植物

Beachy 等[20]借助基因工程技術(shù)成功將煙草花葉病毒（TMV）外殼蛋白基因轉(zhuǎn)入煙草中，獲得了抗TMV 的煙草，自此以后，通過(guò)轉(zhuǎn)入病毒基因而培育出不同程度抗病毒侵染植物的技術(shù)多有報(bào)道[2]。通過(guò)進(jìn)一步研究整理發(fā)現(xiàn)，目前針對(duì)果樹病毒應(yīng)用的轉(zhuǎn)基因技術(shù)主要有3 種：1）外殼蛋白基因策略。外殼蛋白介導(dǎo)的抗病毒機(jī)制目前還不明確，已提出的假說(shuō)認(rèn)為外殼蛋白的合成和積累會(huì)影響侵染病毒的脫外殼作用和復(fù)制[19]，從而達(dá)到抵抗病毒的作用。在果樹上用此方法抵御的病毒有李痘病毒（PPV）、葡萄鉻黃花葉病毒（GCMV）、葡萄扇葉病毒（GFLV）、葡萄病毒A（GVA）等[6]。2）病毒衛(wèi)星RNA 基因策略。Ponz 等[1]研究表明，煙草環(huán)斑病毒（CLRV）的衛(wèi)星RNA可抑制CLRV 的復(fù)制并減輕CLRV 侵染產(chǎn)生的癥狀。3）病毒運(yùn)動(dòng)蛋白基因策略。病毒在宿主體內(nèi)長(zhǎng)距離移動(dòng)需要運(yùn)動(dòng)蛋白的作用，此策略通過(guò)影響運(yùn)動(dòng)蛋白合成，限制病毒的系統(tǒng)性移動(dòng)，從而抑制病毒的擴(kuò)散。

7 展望

果樹病毒穩(wěn)定性差極易產(chǎn)生變異，隨著果樹種植面積的不斷擴(kuò)大、果樹新品種的不斷引進(jìn)、果樹病毒的傳播速度呈加快態(tài)勢(shì)，給果樹病毒檢測(cè)和脫毒工作帶來(lái)了更大的挑戰(zhàn)。因而，對(duì)于果樹脫毒技術(shù)和病毒防治的研究也逐漸受到重視。目前，我國(guó)己建立了針對(duì)危害性較大的主要果樹病毒的檢測(cè)與脫毒技術(shù)，但部分脫毒作用的機(jī)理還有待進(jìn)一步研究，現(xiàn)有脫毒技術(shù)還有待進(jìn)一步的改進(jìn)和完善。此外，我國(guó)果樹脫毒種苗規(guī)模化生產(chǎn)的發(fā)展還受到脫毒效率低、種質(zhì)資源匱乏等因素的制約，因此仍需進(jìn)一步通過(guò)現(xiàn)代生物技術(shù)手段提高果樹脫毒效率，縮短脫毒周期。