姜水兵,努爾麥麥提·麥麥提敏
(塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,新疆 阿拉爾 843300)
圓環(huán)病毒在近些年備受獸醫(yī)界的關(guān)注,圓環(huán)病毒科成員在顆粒形態(tài)及基因組方面均類似,但是在生態(tài)學(xué)、生物學(xué)、抗原性等方面差異比較大。關(guān)于鴨圓環(huán)病毒(DuCV)報(bào)道最早于2003年由德國學(xué)者Hattermann等[1]報(bào)道,隨后2004年德國[2]、2005年匈牙利[3]也相繼報(bào)道,自2007年起,在山東、江蘇、四川、福建、廣東、浙江、遼寧、重慶等省份陸續(xù)有鴨群感染DuCV報(bào)道[4],DuCV感染后不僅可使鴨發(fā)生原發(fā)性感染,還會(huì)使鴨免疫系統(tǒng)受到損害,易遭受其他細(xì)菌和病毒的并發(fā)或繼發(fā)感染,給全球養(yǎng)鴨業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[5]。因?yàn)镈uCV在動(dòng)物細(xì)胞和禽胚上的增殖培養(yǎng)方法尚未建立,故無法采用傳統(tǒng)的病毒分離鑒定方法進(jìn)行準(zhǔn)確診斷,而根據(jù)流行病學(xué)、臨床癥狀、病理變化等也只能做出初步診斷,確診需借助實(shí)驗(yàn)室診斷方法。
楊曉偉等[6]研究發(fā)現(xiàn)鴨圓環(huán)病毒病在川渝地區(qū)存在低水平感染。廣西同時(shí)存在基因1.1亞型、基因1.2亞型和基因2.1亞型3種不同的DuCV毒株流行,其中基因1.1亞型和1.2亞型為優(yōu)勢流行毒株[7]。江西部分地區(qū)鴨圓環(huán)病毒病的流行較為嚴(yán)重,且優(yōu)勢基因型為1型[8]。由于DuCV常以隱性感染形式存在,易被忽視,從而為DuCV的傳播、適應(yīng)與變異提供了更多機(jī)會(huì)。為明確DuCV在和田地區(qū)的感染與流行情況,本研究對和田地區(qū)疑似發(fā)病鴨群進(jìn)行了DuCV的檢測與全基因組測序分析,旨在了解DuCV流行毒株在和田地區(qū)的遺傳變異情況和流行優(yōu)勢基因型,為和田地區(qū)防控DuCV提供理論依據(jù)。
1.1.1 樣品的采集 采自和田地區(qū)5個(gè)規(guī)模化養(yǎng)殖場15~30日齡的櫻桃谷肉鴨,出現(xiàn)被羽脫落,生長遲緩等癥狀共100例病、死鴨樣品,無菌收集包括肝、脾、法氏囊等組織臟器,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>
1.1.2 試劑 主要試劑:DNA zol、ExTaq酶、DNA Marker DL 2000,北京全式金生物技術(shù)有限公司;Gold View,北京博奧拓達(dá)科技有限公司;pMD18-T Vector,寶生物工程(大連)有限公司;E.coliDH5α株感受態(tài)細(xì)胞,天根生化科技(北京)有限公司。
1.2.1 病毒DNA提取 將采集的肝、脾、法氏囊等器官組織樣品使用消毒過的手術(shù)剪各剪取黃豆大小的組織塊,將剪取的組織塊倒入加有5倍體積生理鹽水的研磨器中進(jìn)行研磨,研磨后的組織液反復(fù)凍融3次,4℃8 000 r/min離心5 min,取上清并做好標(biāo)記保存?zhèn)溆?。處理好的樣品按照DNA zol試劑盒操作說明書提取病毒DNA。
1.2.2 引物合成 楊育鵬[9]發(fā)表的DuCV-1、DuCV-2特異性引物,DuCV-F:5'-CGACTTATGTTATCT TTGGGCGT-3',DuCV-1R:5'-AATTCTGCGGTACA GAGA(C)TGA-3',DuCV-2R:5'-AGCCTCAGAAA ACCAGATAATGCG-3',其中DuCV-F為DuCV基因型的共用上游引物,與DuCV-1R特異性擴(kuò)增長度為398 bp,與DuCV-2R特異性擴(kuò)增長度為811 bp,引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
1.2.3 DuCV雙重PCR擴(kuò)增、克隆及測序 PCR體系為25μL,其中模板DNA 2μL,上游引物0.5μL,下游引物各0.25μL,EasyTaqMix12μL,ddH2O10μL。PCR反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性5 min;95℃變性30 s、52℃退火30 s、72℃延伸30 s,35個(gè)循環(huán),最后72℃延伸補(bǔ)齊5 min,以陽性樣本和ddH2O分別作陽性對照和空白對照。PCR產(chǎn)物取5μL經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳,觀察結(jié)果,陽性產(chǎn)物經(jīng)膠回收,連接到pMD18-T載體,轉(zhuǎn)化宿主菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,經(jīng)培養(yǎng)篩選,挑取單個(gè)轉(zhuǎn)化菌落于LB培養(yǎng)液(Amp+)過夜培養(yǎng),PCR鑒定陽性克隆菌送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序。測序結(jié)果用DNAStar進(jìn)行拼接分析。
1.2.4 DuCV基因組序列分析 運(yùn)用DNAStar7和Mega5對所獲得的和田毒株與GenBank中10個(gè)國內(nèi)外DuCV毒株進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析和同源性比較。
從鴨組織中提取總病毒DNA后用合成的特異性引物進(jìn)行雙重PCR擴(kuò)增,經(jīng)過瓊脂凝膠電泳,通過全自動(dòng)凝膠成像分析儀中觀察到了398 bp目的片段(圖1),未出現(xiàn)811 bp片段。
圖1 鴨圓環(huán)病毒PCR檢測結(jié)果
測序結(jié)果通過應(yīng)用DNAStar軟件中的SeqMan對序列拼接,獲得4株DuCV部分基因序列,選取一株DuCV基因部分序列以MN068360.1為目標(biāo)序列,選取11株國內(nèi)外參考基因,其中與源自山東MN068358.1、臺灣KP229369.1、韓國KC851821.1同源性為100%,與韓國JQ740360.1、中國KC460533.1、廣西MK814581.1同源性為99.3%(表1、圖2)。
表1 參考DuCV毒株信息
圖2 參考DuCV毒株部分序列構(gòu)建的同源性對比
采用MEGA軟件將目標(biāo)基因與11株參考序列繪制系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹,由進(jìn)化樹可知,本試驗(yàn)獲得的毒株與源自山東的MN068358關(guān)系較近,屬于同一分支,與源自福建的GQ423740關(guān)系較遠(yuǎn)(圖3)。
圖3 參考DuCV毒株部分序列系統(tǒng)進(jìn)化分析
經(jīng)過對所有樣本進(jìn)行PCR或RT-PCR檢測,在20份DuCV陽性樣本中,鴨肝炎病毒、鴨出血病毒、呼腸孤病毒的陽性率分別為10.00%(2/20)、30.00%(12/20)、5.00%(1/20)。剩余80份DuCV陰性樣本中,鴨肝炎病毒、鴨出血病毒、呼腸孤病毒的陽性率分別為8.75%(7/80)、25.00%(20/80)、3.75%(3/80)。結(jié)果顯示,DuCV陽性樣品中鴨肝炎病毒、鴨出血病毒、呼腸孤病毒感染率均略高于DuCV陰性樣本(表2)。
表2 DuCV陽性或者陰性樣品中鴨肝炎病毒、鴨出血病毒及呼腸孤病毒混合感染情況
自2003年德國學(xué)者Hattermann等[1]首次報(bào)道鴨圓環(huán)病毒以來,世界各地相繼報(bào)道其流行病學(xué)。本試驗(yàn)采集和田地區(qū)5個(gè)規(guī)模化養(yǎng)殖場共100例病、死鴨樣品進(jìn)行鴨圓環(huán)病毒檢測,結(jié)果表明,2021年采集的和田部分地區(qū)病、死鴨樣品DuCV陽性檢出率為20%,且優(yōu)勢流行毒株為DuCV-1,低于高攀攀等[10]2020年采集的山東省部分地區(qū)DuCV陽性檢出率,同時(shí)與中國臺灣、匈牙利等地的DuCV感染率也有一定差異,說明DuCV感染呈現(xiàn)地域差異性。
DuCV陽性樣本與陰性樣本中鴨肝炎病毒、鴨出血病毒及呼腸孤病毒混合感染的情況顯示,DuCV陽性樣本中鴨肝炎病毒、鴨出血病毒、呼腸孤病毒感染率均略高于DuCV陰性樣本,表明DuCV病毒在侵入機(jī)體造成免疫損害后,易與其他病原微生物共染。
從DuCV毒株部分基因序列進(jìn)化樹分析,和田流行優(yōu)勢毒株與源自山東毒株關(guān)系最近,可能由于市場交易造成病原傳播。和田養(yǎng)鴨產(chǎn)業(yè)屬于國家扶持產(chǎn)業(yè),種鴨、種蛋均由浙江大型養(yǎng)鴨場提供,建議養(yǎng)殖場在選擇引進(jìn)適合本地養(yǎng)殖種鴨品種與種蛋的同時(shí),做好種鴨疫病檢測、種蛋病原凈化;加強(qiáng)飼養(yǎng)管理,改善飼養(yǎng)環(huán)境,使用中草藥混合飼料,提高鴨群對疾病的抵抗力;做好DuCV-1型疫苗接種,定期檢測抗體水平。