利用HPLC-ICP-MS方法測定中華絨螯蟹不同形態(tài)砷的殘留量

殷玉婷，汪 倩，陳 曦,2，桂 源，宋 超,

（1南京農(nóng)業(yè)大學(xué)無錫漁業(yè)學(xué)院，江蘇無錫 214081；2中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心，江蘇無錫 214081；3農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品質(zhì)量安全環(huán)境因子風(fēng)險評估實驗室（無錫），江蘇無錫 214081；4農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品質(zhì)量安全控制重點(diǎn)實驗室，北京 100141）

0 引言

砷(Arsenic,As)通常以無機(jī)和有機(jī)的形態(tài)存在于自然界中，無機(jī)砷毒性很強(qiáng)，被確定為一級致癌物[1]。無機(jī)砷主要指砷酸鹽[Arsenate,As(Ⅴ)]和亞砷酸鹽[Arsenite,As(Ⅲ)]；有機(jī)砷毒性相對較弱，主要指一甲基砷酸(Monomethyl arsenic acid,MMA)、二甲基砷酸(Dimethyl arsenic acid, DMA)、砷 甜 菜 堿(Arsenobetaine,AsB)、砷膽堿(Arsenocholine,AsC)、砷糖和砷脂等；而砷膽堿(AsC)、砷甜菜堿(AsB)、砷糖、砷脂則基本上認(rèn)為無毒[2]。若按照砷化合物以半致死量(LD50)來計算，那么這6種砷形態(tài)的毒性大小可分為亞砷酸鹽[As(Ⅲ)]>砷酸鹽[As(Ⅴ)]>一甲基砷酸(MMA)>二甲基砷酸(DMA)>砷膽堿(AsC)>砷甜菜堿(AsB)[3]。砷廣泛存在于土壤、河水、海水以及大氣中，砷不會以單質(zhì)狀態(tài)存在，在多種物質(zhì)中都含有砷的存在。砷在海水中含量較少而在淡水中含量較高，分別是2 μg/kg和0.4～80 μg/kg[4]，因海水中含有藻類可以聚集砷而淡水中沒有，所以砷會被甲殼類生物聚集在體內(nèi)，當(dāng)人們在食用這些甲殼類動物時其體內(nèi)所含有重金屬也會被人體所吸收，導(dǎo)致人體會出現(xiàn)慢性中毒[5]，表現(xiàn)為末梢神經(jīng)炎，神經(jīng)衰弱，長期食用可致癌[6]，危害人體健康。近幾年來，由于人為噴灑農(nóng)藥、工業(yè)活動和礦石燃燒等[7]活動引起水體中重金屬砷含量不斷增加，對養(yǎng)殖水體產(chǎn)生污染，水產(chǎn)動物體內(nèi)砷含量超標(biāo)，水產(chǎn)品質(zhì)量安全受到嚴(yán)重威脅。

中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)又稱大閘蟹，是中國一種重要的經(jīng)濟(jì)水生動物，具有較高的經(jīng)濟(jì)價值。因蟹肉鮮嫩多汁且營養(yǎng)特別豐富，富含人體必需氨基酸和不飽和脂肪酸[8]，廣泛受到消費(fèi)者喜愛。大閘蟹主要分布在亞洲北部和中國的東部沿海省份。目前，大部分養(yǎng)殖中華絨螯蟹地區(qū)都以投喂野雜魚、螺螄、玉米以及配合飼料為主[9]，在投喂的過程中，這些野雜魚體內(nèi)也可能存在重金屬砷。蟹類喜歡棲居于江河湖泊和一些泥沙洞穴中，而重金屬砷通過巖土和礦石的不斷風(fēng)化和冶煉后通過降雨流入水體，重金屬砷除會被藻類富集外，還會沉入水底被蟹類富集，因此蟹類體內(nèi)重金屬殘留量會明顯高于魚類[10]。根據(jù)食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB 2067—2017[11]中規(guī)定，水產(chǎn)動物和水產(chǎn)品中砷制劑的含量必須在0.5 mg/kg范圍之內(nèi)。張明月等[12]對天津地區(qū)水產(chǎn)品中重金屬污染狀況及風(fēng)險評估的研究中表明，無機(jī)砷的污染狀況必須引起重視；梅光明等[13]對浙江沿海海產(chǎn)品無機(jī)砷污染調(diào)查及食用風(fēng)險分析中表明，各類海產(chǎn)品中總砷的平均含量為0.36～35.91 mg/kg，有66.4%的樣品有無機(jī)砷的檢出，長期食用這些海產(chǎn)品則會對人的身體健康造成一定危害；范忠吉等[14]對云南滇東地區(qū)8個州市魚類中砷的形態(tài)測定分析中表明，在昆明、紅河及玉溪的樣品中有砷形態(tài)含量超標(biāo)，超標(biāo)率分別為26.09%、22.22%、11.11%，數(shù)據(jù)表明應(yīng)該加強(qiáng)對水產(chǎn)品中砷的含量的檢測，以確保水產(chǎn)品質(zhì)量安全和人體健康。

通過利用高效液相色譜串聯(lián)電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(HPLC-ICP-MS)建立一種高效檢測中華絨螯蟹體內(nèi)重金屬砷形態(tài)殘留量的方法。利用此種檢測方法具有分離性強(qiáng)、選擇性高和靈敏度高[15]的特點(diǎn)來進(jìn)行定量檢測，這項技術(shù)解決了單一檢測技術(shù)的精密度和準(zhǔn)確度低的問題。高效液相色譜(HPLC)具有分離性好，前處理時間短，電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(ICP-MS)具有干擾少、檢測限低、分析速度快、雜質(zhì)少、峰型尖銳等優(yōu)點(diǎn)[16]。二者相結(jié)合旨在為建立測定中華絨螯蟹體內(nèi)重金屬砷含量的方法，此方法更可靠，更高效，更適合這6種砷形態(tài)的定量分析，通過對色譜柱的優(yōu)化、流動相的優(yōu)化、流動相pH的優(yōu)化和流速的優(yōu)化，得到一種更高效檢測中華絨螯蟹體內(nèi)砷形態(tài)含量的方法，為今后的水產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測方法提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

測定砷形態(tài)：砷酸[As(V)]根標(biāo)準(zhǔn)溶液(AsO43-)、亞砷酸[As(Ⅲ)]根標(biāo)準(zhǔn)溶液(AsO33-)、一甲基砷酸(MMA)根標(biāo)準(zhǔn)溶液(CH3AsO32-)、二甲基砷酸(DMA)根標(biāo)準(zhǔn)溶液(C2H7AsO2)、砷甜菜堿(AsB)標(biāo)準(zhǔn)溶液(C5H11AsO2)和砷膽堿(AsC)標(biāo)準(zhǔn)溶液(C5H14AsO)，均購自中國計量科學(xué)研究院標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心，按比例配制6種混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液，使用超純水逐級稀釋配制不同濃度混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線；正己烷；氨水；25 mM/LNH4H2PO4溶液；超純水；流動相上機(jī)之前需超聲40 min。

Agilent 8900 HPLC-ICP-MS（美國安捷倫科技有限公司）；Master-Q UT水純化系統(tǒng)（上海和泰儀器有限公司）；GL-22MS高速冷凍離心機(jī)（上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；電子分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；KQ3200E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

試驗過程中所使用的燒杯、玻璃棒、容量瓶、移液管等玻璃儀器均用5%硝酸溶液浸泡24 h以上，使用前用超純水潤洗干凈，避免因容器壁表面存有其它雜質(zhì)離子影響試驗結(jié)果。實驗室用水均為超純水，所用試劑均為優(yōu)級純。

1.2 樣品前處理

將采集的新鮮中華絨螯蟹洗凈，用鑷子、勺子、剪刀等工具去殼、去腮后，用勺子刮出中華絨螯蟹的可食用部位，用絞肉機(jī)打成勻漿，放入冰箱-20℃保存，待測。

樣品前處理：用電子天平稱取處理好的螃蟹樣本1.0 g左右（精確至0.01 g）于50 mL離心管中，加入20 mL的0.25 mM/L NH4H2PO4溶液提取樣本中的砷形態(tài)，將離心管放置渦旋儀，以2500 rpm轉(zhuǎn)速渦旋5 min，超聲波儀超聲30 min，超聲結(jié)束后放置高速冷凍離心機(jī)內(nèi)，以10000 rpm轉(zhuǎn)速離心15 min，完成后取出用移液槍吸取上清液10 mL至另一個50 mL離心管，加入10 mL正己烷脫脂，并繼續(xù)上述渦旋、離心步驟，第二次離心結(jié)束后取出，用一次性針管吸取1 mL下清液經(jīng)0.22 μm有機(jī)相濾膜過濾至自動進(jìn)樣螺旋瓶中，等待上機(jī)檢測。

1.3 儀器程序參數(shù)分析

表1 HPLC-ICP-MS程序參數(shù)

1.4 數(shù)據(jù)分析

本試驗所測數(shù)據(jù)均由Excel 2019進(jìn)行處理和分析，用Origin2018軟件作圖，提高試驗數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和可靠性。

2 結(jié)果與分析

2.1 中華絨螯蟹中測定砷形態(tài)條件的優(yōu)選

2.1.1 色譜柱的優(yōu)選 本試驗采用Dionex IonPacTMAS19(4×250 mm)陰離子交換柱和Hamilton PRP-X100陰離子交換柱(250 mm×4.1 mm,10 μm)對20 μg/L的6種砷形態(tài)的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行分離。選用流動相A：25 mM/LNH4H2PO4(pH 8.9)溶液；流動相B：超純水，且A相比B相=99:1（體積比），流速為1 mL/min進(jìn)行洗脫。在本試驗過程中發(fā)現(xiàn)，采用Dionex IonPacTMAS19(4×250 mm)陰離子交換柱作為色譜柱時，等待出峰時間較長，會出現(xiàn)連峰，部分峰型緊湊，AsC和AsB不能很好地分離，出峰不完全（圖1a）；當(dāng)選擇Hamilton PRP-X100色譜柱時（圖1b），會發(fā)現(xiàn)這種色譜柱出峰效果會優(yōu)于第一種色譜柱，雖然也會出現(xiàn)AsC和AsB分離不完全現(xiàn)象，但是等待出峰時間較短，在10 min時6種砷形態(tài)全部出峰，Hamilton PRPX100色譜柱顯著優(yōu)勢為價格低，出峰時間相對較短，峰型尖銳，響應(yīng)值較高，因此在二者對比之下，選擇Hamilton PRP-X100色譜柱作為測定6種砷形態(tài)的分析柱，為試驗的下一步優(yōu)選做好準(zhǔn)備。

圖1 兩種不同類型色譜柱分離6種砷形態(tài)色譜圖

2.1.2 流動相的優(yōu)選 在上述優(yōu)選后，最終選擇Hamilton PRP X-100(250 mm×4.1 mm,10 μm)陰離子交換柱。本試驗采用4種流動相對6種砷形態(tài)進(jìn)行分離洗脫，分別采用流動相10 mM/L無水乙酸鈉、3 mM/L硝酸鉀、10 mM/L磷酸二氫鈉、0.2 mM/L乙二胺四乙酸二鈉的復(fù)合鹽；25 mM/L磷酸二氫銨；10 mM/L磷酸氫銨和50 mM/L碳酸銨來檢驗這4種流動相對6種砷形態(tài)的分離效果（見表2）。試驗表明：在序號4中50 mM/L(NH4)2CO3(pH 10)時，DMA不能被有效洗脫且AsC和AsB不能完全分離；序號為1、2、3的洗脫條件下，6種砷形態(tài)都能夠被洗脫分離，但是在序號2的洗脫條件下，當(dāng)pH 8.0時分離效果最好（圖2），并且為梯度洗脫，分離速度較快，在10 min之內(nèi)6種砷形態(tài)能夠完全分離洗脫，通過單標(biāo)定性，6種砷形態(tài)的分離洗脫順序為AsC、AsB、As(Ⅲ)、DMA、MMA和As(V)。

圖2 4種流動相分離6種砷形態(tài)色譜圖

表2 洗脫條件選擇

2.1.3 流動相pH的優(yōu)選 上述4種流動相在采用離子交換色譜時，由于各個砷形態(tài)在不同pH下表面電荷也不同，流動相的pH對保留時間以及分離度的影響也比較大。試驗結(jié)果表明第一種流動相，A相：10 mM/L無水乙酸鈉、3 mM/L硝酸鉀、10 mM/L磷酸二氫鈉、0.2 mM/L乙二胺四乙酸二鈉的緩沖液，氨水調(diào)節(jié)pH 8.4，B相：無水乙醇(C2H6O)，兩者體積比為99:1。采用兩種pH值做對比，當(dāng)pH 7.5時，As(V)并未檢出，但當(dāng)pH 8.0時，6種砷形態(tài)均被檢出，基線分離較好，且AsB能夠與基線分離，10 min之內(nèi)能夠完全出峰（圖3）。第二種流動相是碳酸銨，試驗結(jié)果顯示：當(dāng)pH 8.3時，可看出峰型緊湊，有連峰現(xiàn)象，As(V)并未出峰，且在5 min之內(nèi)分離5種砷形態(tài)；當(dāng)pH 10時，峰型尖銳，響應(yīng)值較高，但DMA并未分離，說明這種流動相以及pH并不適用于本方法（圖4）。第三種流動相為磷酸氫銨，pH 7時，明顯看出連峰且砷形態(tài)分離不完整；當(dāng)pH 8.0時，雖峰型分離完整但是基線不穩(wěn)，噪音較大（圖5）。第四種流動相為磷酸二氫銨，不同pH值所呈現(xiàn)的分離效果就不同，當(dāng)pH 7.0時，只分離出三種砷形態(tài)；當(dāng)pH 8.0時，發(fā)現(xiàn)分離效果和基線穩(wěn)定性都較好，因此經(jīng)過不斷試驗和研究后發(fā)現(xiàn)選用磷酸二氫銨作為流動相pH 8.0時，6種砷形態(tài)的分離效果均達(dá)到理想狀態(tài)，峰型尖銳，響應(yīng)值較高，最后選擇磷酸二氫銨(pH 8.0)作為流動相（圖6）。

圖3 不同pH的峰型圖

圖4 碳酸銨作為流動相時不同pH的峰型圖

圖5 磷酸氫銨作為流動相時不同pH的峰型圖

圖6 磷酸二氫銨作為流動相時不同pH的峰型圖

2.1.4 流速的優(yōu)選 為了有效觀察不同流速對6種砷形態(tài)化合物分離得影響，本試驗采用1.0和1.4 mL/min流速進(jìn)行洗脫。試驗表明，隨著流速增加，6種砷形態(tài)化合物保留時間均有不同程度縮短，但是隨著流速增加的同時，基線噪音也會越來越大，而流速較慢的時候峰形均有不同程度拖尾，所以綜合考慮后選用1 mL/min進(jìn)行洗脫，而且這種情況下6種砷形態(tài)完全分離，并且響應(yīng)值高，基線穩(wěn)，無噪音。

表3 梯度洗脫條件

表4 等度洗脫條件

2.2 砷形態(tài)的方法學(xué)驗證

2.2.1 方法檢測限及線性范圍 分別配制0、0.5、1、2、5、10、20、50 μg/L系列砷形態(tài)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，在上述優(yōu)化后的一系列試驗條件下進(jìn)行分析。結(jié)果表明在0～50 μg/L范圍內(nèi)，6種砷化合物的響應(yīng)色譜峰面積值與濃度呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均大于0.999。如表5所示，6種砷形態(tài)中，其檢測限范圍為0.0060～0.0912 μg/kg，定量限為0.020～0.304 μg/kg。

表5 測定曲線線性關(guān)系及方法檢測限與定量限

2.2.2 方法的準(zhǔn)確度和精密度的驗證 采用加標(biāo)回收率試驗進(jìn)一步驗證本方法的準(zhǔn)確度和精密度。準(zhǔn)確稱取中華絨螯蟹樣品，分別添加3種不同質(zhì)量濃度水平的AsC、AsB、As(Ⅲ)、DMA、MMA、As(Ⅴ)6種砷形態(tài)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，加標(biāo)濃度分別為0.5、5、50 μg/L，每個梯度下設(shè)置3個平行試驗，進(jìn)行加標(biāo)回收試驗，計算添加回收率和RSD值，同時做樣品本底值測定。添加回收率測定結(jié)果見表6所示，結(jié)果表明在高、中、低3個加標(biāo)濃度下，6種不同砷形態(tài)物加標(biāo)回收率在70%～120%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD值均小于5%，滿足分析檢測要求，進(jìn)一步證實了本方法測定結(jié)果準(zhǔn)確性好、精密度高。

表6 中華絨螯蟹樣品中6種砷形態(tài)加標(biāo)回收率測定(n=3)

3 討論

3.1 砷形態(tài)的檢測

砷是自然環(huán)境中的一種有劇毒的元素，目前砷污染已經(jīng)成為全球關(guān)注的問題[17]。砷的主要來源是由于自然形成和人為活動產(chǎn)生，在采礦和煤炭燃燒過程中都是砷的重要來源，這些砷會釋放到大氣中，通過大氣沉降最后流入水體和土壤中，地表水會被作為飲用水和植物灌溉，因此不僅會對人類健康造成威脅也會對植物產(chǎn)生危害。在水環(huán)境中，砷對海產(chǎn)品影響小于淡水產(chǎn)品，原因在于淡水中缺乏可以聚集砷的藻類。水體中還會存在水動力，砷會積累在沉積物中且也能從沉積物中釋放到生物體內(nèi)，不同形態(tài)的砷其毒性不同且在生物體內(nèi)可以相互轉(zhuǎn)化[18]。水產(chǎn)品中的砷是人們攝入體內(nèi)的重要來源之一[19]，增加人體的膳食風(fēng)險。砷的毒性強(qiáng)弱與它的形態(tài)有關(guān)，無機(jī)砷的毒性遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于有機(jī)砷[20]，目前，除了AsB和AsC被認(rèn)為無毒之外，MMA和DMA也被列為潛在的致癌物[21]。因此，對淡水和海水產(chǎn)品中不同形態(tài)砷的檢測至關(guān)重要，朱有濤等[22]采用HPLC串聯(lián)ICP-MS的方法測定水產(chǎn)品中的6種砷形態(tài)，得出此方法具有簡單、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，對水產(chǎn)品中不同形態(tài)砷的檢測有重大意義；楊艷等[23]采用同樣方法檢測海產(chǎn)品中不同形態(tài)砷，結(jié)果表明，海產(chǎn)品中的砷主要以有機(jī)砷的形態(tài)存在，該分析方法簡便可靠，符合對海產(chǎn)品砷化合物的檢測。

3.2 前處理方法的選擇

在水產(chǎn)品中重金屬含量檢測的過程中，水產(chǎn)品前處理方法的選擇是關(guān)鍵步驟之一。對中華絨螯蟹可食部位前處理過程是否完全，都會影響色譜圖的峰型分離情況，同時高效液相色譜的性能也會影響分離效果和組成成分的信號強(qiáng)弱[24]。呂超等[25]考察了采用10% HNO3作為提取液，發(fā)現(xiàn)硝酸會使As(Ⅲ)氧化成As(V)，在形態(tài)上也會互相轉(zhuǎn)變，同時HNO3還會腐蝕進(jìn)樣系統(tǒng)，對試驗儀器造成一定損害；崔艷梅等[26]發(fā)現(xiàn)用超純水作為提取劑會使提取率低于其他提取劑；本試驗的前處理方法主要是采取與流動相相同基質(zhì)的0.25 mM/L NH4H2PO4作為提取液，經(jīng)過兩次渦旋和離心后，采用正己烷脫脂，最后取下清液上機(jī)待測。此方法通過超聲輔助提取能夠很好的分離中華絨螯蟹體內(nèi)6種不同砷形態(tài)，同時此方法簡單快速，且回收率較高。

3.3 分析方法的選擇

本試驗的分析方法采用HPLC-ICP-MS來檢測中華絨螯蟹可食用部分的重金屬砷含量。此儀器具有靈敏度高、檢測快、效率高等優(yōu)點(diǎn)。在前幾年對水產(chǎn)品中重金屬的檢測方法是采用銀鹽法和高濃度鹽酸提取后用原子熒光光度計測定[27]，該方法的缺點(diǎn)在于提取時間過長，靈敏度較低而且提取效果差，同時對試驗儀器污染較為嚴(yán)重，已經(jīng)不能滿足對水產(chǎn)品重金屬含量快速而又高效的檢測。而今聯(lián)用技術(shù)用于水產(chǎn)品檢測越來越多，主要是因為HPLC具有高效分離的作用，ICPMS具有檢測限低、檢測元素多樣、線性范圍廣等優(yōu)點(diǎn)[28]。韋麗麗[29]等采用熱浸提-高效液相色譜等度分離-原子熒光光譜法測定水產(chǎn)品中4種砷形態(tài)，其加標(biāo)回收率為84%～98%，該方法準(zhǔn)確度高，適用于水產(chǎn)品砷形態(tài)的檢測；劉淑晗等[30]采用高效液相色譜-（紫外）氫化物發(fā)生原子熒光光譜[HPLC-(UV)HG-AFS]分析方法檢測南極磷蝦及其制品中的6種砷形態(tài)，該分析方法的加標(biāo)回收率達(dá)到89%～108%，得出結(jié)論為該方法回收率好，結(jié)果穩(wěn)定可靠，適用于本試驗的檢測和分析。陸奕娜等[31]采用HPLC-ICP-MS的方法對海產(chǎn)品中9種不同形態(tài)砷進(jìn)行檢測，回收率達(dá)到74%～109%；譚秀慧等[32]也采用這方法檢測水產(chǎn)品中5種不同形態(tài)的砷，回收率達(dá)到90%～102%，說明采用此分析方法具有分離速度快、檢測靈敏高、線性范圍寬、檢測范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，才會被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)品中不同形態(tài)砷的檢測[33]。

4 結(jié)論

本研究通過對色譜柱的優(yōu)選、流動相組成的優(yōu)選、流動相pH的優(yōu)選、流動相梯度的優(yōu)選等色譜條件的優(yōu)化，建立了HPLC-ICP-MS同時測定AsC、AsB、As(Ⅲ)、DMA、MMA和As(Ⅴ)6種砷形態(tài)方法。經(jīng)過本次試驗發(fā)現(xiàn)建立中華絨螯蟹體內(nèi)砷形態(tài)方法是選用Hamilton PRP X-100(250 mm×4.1 mm,10 um)陰離子交換柱作為分析柱，流動相A：25 mM/L NH4H2PO4(pH 8.0)溶液；流動相B：超純水；流速1.0 mL/min，梯度洗脫這6種砷形態(tài)時出峰效果更好，對基線噪音影響更小，峰型尖銳，是一種高效測定中華絨螯蟹體內(nèi)重金屬砷形態(tài)含量的方法。此方法對6種形態(tài)砷形態(tài)化合物分離度較好，在同種分析方法對比中，本試驗的加標(biāo)回收率高，達(dá)到70%～120%。經(jīng)方法學(xué)驗證，并通過對實際樣品的檢測分析，確定了此方法也可用于海產(chǎn)品中砷形態(tài)的含量測定，為檢測水產(chǎn)品中砷化合物的相關(guān)研究提供了可靠的技術(shù)依據(jù)。