朱章順,王強鋒,李芹,馬嬌,夏中梅,侯勇,王海濤,胡鳳科,徐遠超
(1.成都市植物園,四川 成都 610083;2.四川省農業(yè)科學院 生物技術核技術研究所,四川 成都 610066;3.四川省蘭月科技有限公司,四川 成都 610207)
木芙蓉(HibiscusmutabilisLinn)為錦葵科(Malvaceae)木槿屬(Hibiscus)落葉灌木或小喬木植物,為我國長久栽培的城市綠化及觀賞植物,廣泛分布于四川、云南、湖南、廣西、廣東等地。四川成都有著最悠久的木芙蓉花栽培歷史,“蓉城”由此而來。芙蓉花是成都的象征,1983年5月26日成都市人大把芙蓉花定為市花,銀杏為市樹,每年農歷九月初九為市花市樹節(jié)[1]。木芙蓉花期較長,花期不一致導致不同花朵先后開放不整齊,對木芙蓉觀賞性和整體美化效果造成不利影響。內源激素是一類重要的植物生長調節(jié)物質,與花的生長發(fā)育密切相關,多種內源激素的相互作用共同調控植物的花期。
植物內源激素是微量的、自然產生的物質,目前,已分離鑒定了生長素(IAA)、赤霉素(GA)、細胞分裂素(CTK)、乙烯(ETH)、脫落酸(ABA)、油菜素內酯(BR)、水楊酸(SA)和茉莉酸(JA)等不同的植物激素[2-3]。內源激素通過復雜的信號轉導途徑參與調節(jié)植物各個生理過程,植物激素信號之間存在相互作用,具有復雜的網絡關系,其含量的多少及比例對植物正常生命活動有重要影響[3-6]。蜜柑(CitrusunshiuMarc.)葉片中較高濃度的GA3抑制花芽分化,高IAA和ABA含量促進了花芽形成[7]。忍冬(LonicerajaponicaThunb.)花高水平IAA、低水平ABA、高IAA/ABA、ZR(玉米素核苷)/ABA、IAA/GA3及低ABA/GA3、ZR/IAA是影響忍冬‘特蕾1號’大白期時長的主要因素[8]。在白魔芋(Amorphophallusblume)花芽形態(tài)分化時期,較高濃度的IAA、GA3和ZT(玉米素)在雌蕊成熟過程中起促進作用,在同一過程中,高濃度的ABA/IAA,ABA/ZT和ABA/GA3均不利于雄蕊的成熟,高濃度ABA是抑制雄蕊成熟的關鍵因子[9]。在蘋果(Malussieversii)中,ZR、ZR/GA3分別與短枝比例呈正相關,GA3與花序數量呈負相關,蘋果幼樹開花相關指標分別與細根中的IAA、ZR、GA3、IAA/ZR呈正相關,內源激素在地上部成花與地下部根系生長過程中具有重要調節(jié)作用[10]。目前,國內外未見木芙蓉內源激素相關報道。由于內源激素在植物體內含量極低,結構復雜,存在很多相互共存的干擾成分,并且容易受光照、溫度和酸堿度的影響導致變性[11]。因此,對內源激素的高效提取、內源激素檢測的精度和準確度要求較高。目前,高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜法(GC)和質譜法(MS)以其分離效率高、檢出限低、耗時少、樣品量少等優(yōu)點,已成為植物激素的重要分析方法[11-12]。
內源激素是影響植物開花的重要因子,木芙蓉的花具有二次盛開的特性,即木芙蓉頂端的花蕾經過一段時間的發(fā)育后再次集中開放,內源激素對其開花過程可能具有獨特的調節(jié)作用。現階段,木芙蓉開花特性受內源激素調控機理的研究還不完善,花期調控技術有待提升。本文研究了木芙蓉花期不同階段,即花芽分化期、花芽分化后期、花蕾期、初花期、盛花期、盛花末期、二次盛花期和末花期的葉、花中內源激素水平、動態(tài)變化規(guī)律、比例關系等,可為后期通過非自然的方式調控木芙蓉花期,提高木芙蓉觀賞性提供理論支撐。
研究區(qū)位于成都市植物園苗圃基地,該地區(qū)屬中亞熱帶濕潤季風氣候區(qū),無霜期較長,四季分明,冬春少雨,夏秋多雨,雨量充沛,年平均降水量為900~1 300 mm,年平均氣溫在16 ℃左右,木芙蓉栽植土壤為黃壤。
以木芙蓉品種‘錦繡紫’為試驗材料,根據不同花期采集木芙蓉葉片、花蕾、盛開花和衰敗花樣品保存為鮮樣,測定IAA、ABA、GA3、CTK和ETH的含量。分別于木芙蓉花芽分化期(2019-05-13)、花芽分化后期(2019-05-30)、花蕾期(2019-06-11)、初花期(2019-07-05)、盛花期(2019-07-26)、盛花末期(2019-09-09)、二次盛花期(2019-09-30)、末花期(2019-11-13)隨機采集9株木芙蓉葉片、花蕾、盛開花和衰敗花,各器官樣品采集后立即放入液氮冷凍,放入冰盒,帶回實驗室進行內源激素提取與收集,多余樣品置于-80 ℃冰箱中留存?zhèn)溆谩?/p>
采樣時期作如下定義:花芽分化期指木芙蓉植株枝梢頂端有5~6片真葉,能見明顯葉芽,花芽肉眼不可辯認的時期;花芽分化后期指木芙蓉植株枝梢頂端花芽肉眼可辨認的時期;花蕾期指木芙蓉花蕾最大橫徑約1 cm、花柄長度約3 cm以上的時期;初花期指木芙蓉整株有三分之一左右花蕾開放的時期;盛花期指木芙蓉整株有二分之一左右的花蕾開放的時期;盛花末期指木芙蓉植株整株有三分之二以上的花蕾已開放的時期;二次盛花期指木芙蓉植株頂端花蕾經過發(fā)育后開放二分之一的時期;末花期指花蕾全部開放的時期。
其中:采集的花蕾是指花蕾橫徑1~2 cm、花柄長度3 cm以上,花蕾未破的形態(tài);盛開花指開放當天,花瓣呈向外展開形態(tài)的花朵;衰敗花指花朵開放24~48 h,花瓣呈萎蔫狀態(tài)的花朵。由于木芙蓉花盛開后次日就萎蔫衰敗,因此在初花期也有衰敗花樣品;在末花期花蕾已全部開放,無花蕾的樣品。
1.3.1 高效液相色譜法測定IAA、GA3、ABA、CTK含量
以甲醇+磷酸緩沖液或水為流動相,使用C18的不銹鋼反向柱和紫外檢測器,對樣品中的IAA、GA3、ABA、CTK進行高效液相色譜分離和測定,外標法定量。
(1)標準樣品溶液制備及定量工作曲線建立
少量甲醇溶解IAA、GA3、ABA、CTK,用酸性流動相配制濃度為3 mg/L的IAA、GA3和ABA溶液,用中性流動相配制3 mg/L的CTK溶液。上述溶液進一步稀釋成系列標準溶液用于檢測,最終標準曲線相關系數R2>0.99方可使用。
(2)樣品溶液的制備
參考文獻方法[13-15]并作適當改進。取適量的葉片或花,快速機械破碎,準確稱取樣品約20 g于已加入0.5 g三水合二乙基二硫代氨基甲酸鈉(抗氧劑)燒杯中,再加50 mL預冷甲醇(上述過程10 s內完成),攪拌均勻,超聲破碎2 min,蓋上表面皿在4 ℃下冰箱中避光浸提過夜;傾倒上清液,再加50 mL預冷80%甲醇繼續(xù)浸提2 h;連續(xù)收集3次浸提液,先過濾浸提液再過濾殘渣,少量80%甲醇多次清洗,過濾于燒瓶中(約200 mL);40 ℃條件下減壓濃縮至20 mL左右(盡量去除甲醇);將濃縮樣品無損轉移到分液漏斗中,加入與樣品體積1︰1的石油醚和0.05 g的聚乙烯吡咯烷酮萃??;重復一次,水相加入與水相體積1︰1的石油醚萃??;水相經C18小柱(型號:LC-C18 SPE Cartridge,500 mg,3 mL)固液分離,收集濾液。用1 mol/L檸檬酸將濾液pH調至2~3,用20 mL乙酸乙酯萃取兩次,分別收集兩次萃取后的乙酸乙酯(40 mL) 和最后一次的水相(20 mL);水相用pH=9氨-氯化銨調至pH=6左右,定容至25 mL,過0.45 μm濾膜用于測定CTK;乙酸乙酯相再用20 mL且 pH=10氨-氯化銨緩沖液萃取2次,收集2次水相40 mL,水相重復上面操作調酸,乙酸乙酯萃取兩次,收集乙酸乙酯相,用氮吹儀吹干,甲醇溶解,棕色容量瓶定容至5 mL,過0.45 μm有機濾膜用于測定IAA、ABA和GA3。
(3)高效液相色譜操作條件
IAA含量測定條件:流動相為甲醇︰磷酸水溶液(35︰65),波長280 nm;GA3含量測定條件:流動相為甲醇︰磷酸水溶液(35︰65),波長210 nm;ABA含量測定條件:流動相為甲醇︰磷酸水溶液(50︰50),波長254 nm;CTK含量測定條件:流動相為甲醇︰水(30︰70),檢測波長280 nm。
(4)回收率測定
在設定的色譜條件下,配制3種不同濃度的植物激素標準液,通過液相保留時間和峰面積,分析植物激素的重現性和再現性。
采樣添加標樣法測定回收率[12],在最佳純化及色譜分析條件下,向測試樣品中加入4種植物內源激素各1 mg,測定加標后樣品激素含量,5次重復,計算加標回收率和相對標準偏差。
(5)IAA、GA3、ABA、CTK含量計算
式中:A1為標樣溶液中,目標物峰面積的平均值;A2為試樣溶液中,目標物峰面積的平均值;m1為標樣的質量(g);m2為試樣的質量(g);P為標樣中目標物的質量分數(%);D為稀釋倍數關系。
1.3.2 氣譜法測定ETH含量
(1)樣品處理及乙烯收集
稱取適量樣品(15 ~20 g),放入玻璃瓶中,塞好橡皮塞,用封口膜將縫隙密封,在25 ℃室內,存放20 h。輕搖玻璃容器,將注射器內空氣徹底排除,用排水法收集玻璃容器內體積30 mL,轉移至鋁箔采樣袋中。
(2)氣相色譜條件
北分瑞利,3420A氣相色譜儀;氫離子火焰檢測器(FID),檢測器150 ℃;30 m毛細管柱,柱溫60 ℃;進樣口60 ℃;燃氣氫氣流速40 mL/min,空氣流速400 mL/min,載氣氮氣流速50 mL/min。頂空進樣針進5 μL樣品,重復測定3次。
(3)乙烯標準曲線繪制
配制濃度為0.002、0.004、0.008、0.012、0.016 mL/L的5個標準氣體樣品,繪制乙烯標準曲線。
(4)乙烯含量計算
乙烯濃度(mL/L)=(樣品平均峰高/標準乙烯平均峰高)×標準濃度
乙烯含量以單位時間內單位質量的木芙蓉樣品乙烯釋放量計,單位為:mL/(h·g)。
采用Excel 2013進行數據統(tǒng)計,Origin 9.0進行圖表制作。
2.1.1 IAA、GA3、ABA、CTK測定譜圖及回收率
根據上述條件,IAA、GA3、ABA、CTK提取效果較好,樣品色譜圖和標樣色譜圖一致,木芙蓉樣品譜圖見圖1。
圖1 木芙蓉內源激素IAA(A)、GA3(B)、ABA(C)、CTK(D)高效液相色譜圖
4種激素的平均回收率為82.72%~105.58%(表1)。說明精確性良好,本方法的可靠性較高。
表1 內源激素IAA、GA3、ABA、CTK的峰保留時間和平均回收率
2.1.2 木芙蓉內源激素乙烯測定
上述方法操作簡便、靈敏度高,乙烯標準曲線y=384.3x-76.43,R2=0.999;本操作條件能快速準確地測定木芙蓉內源乙烯釋放量,其峰保留時間0.84 min。
花期不同階段木芙蓉葉、花中內源激素含量測定結果見圖2。
圖2 花期不同階段木芙蓉葉、花中內源激素含量變化
葉、花中IAA含量在花期不同階段差異較大(圖2A)。由花芽分化期到初花期,葉中IAA含量呈逐漸升高的趨勢;由初花期到末花期,葉片中IAA含量呈“W”型變化趨勢,在盛花期和二次盛花期相對較低;花蕾中則表現為相反的趨勢,在盛花期和二次盛花期含量相對較高;盛開花和衰敗花中IAA含量在初花期含量最高,其后大幅減少,盛開花中IAA含量降低76%~91%,衰敗花中降低85%~93%??梢姡趸ㄆ谌~、花中IAA較豐富,主要分布在已開放的花朵中,后期主要分布在葉片和花蕾中。
葉、花中ABA含量整體表現為逐漸增加的趨勢,葉、花中增幅不同(圖2B)。葉片和衰敗花中ABA含量在末花期達到峰值,ABA含量分別是初花期的7.34、13.79倍;花蕾和盛開花中ABA含量先增加后降低,在盛花末期時含量較高。可見,在木芙蓉花朵由開放到衰敗的過程中,ABA在葉、花中逐漸累積,在盛花期和盛花末期主要累積在盛開花中,第二次盛花至末花期主要累積在衰敗花中。
葉、花中GA3含量的變化呈現明顯的差異(圖2C)。從花芽分化期到初花期,葉中GA3含量降低,花芽分化期最高;從初花期到末花期,葉中GA3含量呈“~”型變化趨勢,在盛花末期和末花期含量相對較高;花蕾中GA3含量在盛花期和二次盛花期相對較高;盛開花和衰敗花中GA3含量初花期極低,其后大量增加,與葉中GA3相似,在盛花末期和末花期含量相對較高。
葉、花中CTK含量的變化特征不同(圖2D)。葉中CTK含量花芽分化期最高,隨后大幅降低;花蕾中CTK含量盛花期最高,盛花末期幾乎未檢測到CTK,二次盛花期CTK含量升高;盛開花中CTK含量隨花朵衰敗有明顯的降低,盛花末期和末花期CTK含量遠低于盛花期,其中二次盛花期含量最高;衰敗花中CTK含量整體表現為逐漸降低的趨勢,在初花期最高??梢?,在開花早期階段(初花期和盛花期),葉、花中CTK含量豐富,隨花朵衰敗CTK含量明顯降低。
葉、花中ETH含量變化趨勢較一致,ETH含量緩慢升高,從初花期到末花期變幅較小(圖2E)。
不同階段木芙蓉葉、花中內源激素間比例關系見圖3。
圖3 花期不同階段木芙蓉葉、花中內源激素間比例關系
由圖3可知,初花期以后,葉片中GA3/CTK比值呈快速上升趨勢,盛開花中GA3/CTK比值逐漸升高,在盛花末期到達峰值,隨后呈下降趨勢;盛花期,盛開花和衰敗花中ABA/IAA比值較高;與其他時期相比,盛花末期花蕾中GA3/CTK、ABA/GA3和ABA/IAA值較高。
內源激素是調節(jié)花芽分化的關鍵,植物的不同內源激素平衡狀態(tài)影響花芽分化。本試驗發(fā)現,木芙蓉花芽分化期葉片中的GA3、CTK、ABA含量較高。其他植物,如香舌蘭(VanillaplanifoliaAmes)在花芽分化過程中,生長素(IAA)具有促進花芽分化的作用,玉米素核苷(ZR)和赤霉素(GA)具有抑制花芽分化的作用,脫落酸(ABA)具有先促后抑的作用,低水平的GA/ZR對花芽形成具有促進作用[16]。因此,木芙蓉花芽分化期葉片中較高含量的GA3、CTK,葉片中較低水平的GA3/CTK,有利于促進木芙蓉花芽分化;相對較高水平的ABA抑制了莖尖的營養(yǎng)生長,從而與IAA、GA3和CTK相互作用,使莖尖由營養(yǎng)生長轉入生殖生長,促進花芽分化。
木芙蓉‘錦繡紫’品種相對于其他品種而言,衰敗花在盛花期不易掉落,而在末花期衰敗花較易掉落。從內源激素來看,在木芙蓉‘錦繡紫’的盛花期,葉片和衰敗花中ABA含量處于相對較低水平,在二次盛花期和末花期,葉片和衰敗花中ABA含量均處于高水平。已有研究表明,植物的衰老過程受多種內源激素的共同參與,通過外源茉莉酸甲酯誘導銀杏(GinkgobilobaL.)葉片衰老過程中,內源性ABA水平顯著增加,而CTK、GA和IAA的含量和未經處理的自然衰老葉片相比變化不大,各種激素信號,特別是ABA在調控葉的衰老過程中發(fā)生作用[17-18]。因此,在木芙蓉‘錦繡紫’的整個開花周期中,二次盛花期和末花期階段,植株葉片才進入衰老過程,此時衰敗花中較高的ABA含量會加快其掉落。
在木芙蓉整個開花時期,盛開花中ETH含量高于衰敗花。已有研究表明,在許多植物物種中,花的衰老是由氣體激素乙烯(ETH)促進和細胞分裂素(CTK)類激素抑制[19],ABA含量升高不影響開花時間和開花表型[20]。因此,盛開花中ETH快速產生,可能是盛開花維持時間較短的主要原因。但本研究中乙烯含量為各器官在離體條件下收集測定,不一定反映活體狀態(tài)下真實的乙烯釋放水平,其乙烯的變化特征還需進一步探討。
部分木芙蓉品種有二次盛花的現象[21],結合本研究發(fā)現,兩次開花過程的內源激素水平差異較大,主要表現在ABA含量上。葉片中GA3含量從盛花期到盛花末期表現為升高,二次盛花期時GA3含量降低,在末花期時其含量升高,IAA與GA3趨勢基本一致,但ABA含量從盛花期快速升高持續(xù)到末花期?;ɡ僭诔趸ㄆ谝院?,其ABA含量逐漸升高,到盛花末期達到峰值后降低,兩次盛花期的花蕾中ABA水平差異不大。而盛開花中,其ABA含量在盛花期和盛花末期高于二次盛花期和末花期。從開花到衰敗的過程中,葉中IAA、GA3、ABA、ETH含量升高,僅CTK降低;花蕾中IAA、GA3、CTK含量降低,ABA和ETH升高;盛開花和衰敗花中IAA和CTK含量降低,GA3、ABA、ETH升高。因本研究是對木芙蓉花期內源激素的首次探究,對木芙蓉花期的界定亦無可參考依據,實際采樣過程中按照其開花表現分成盛花期和二次盛花期,從內源激素水平分析,葉片在盛花末期以后才進入衰老過程,二次盛花期過程中內源激素的影響較為復雜。
綜上所述,在花芽分化期,木芙蓉葉片中較高含量的GA3、CTK、ABA可促進花芽分化。在木芙蓉二次盛花期,葉、花中內源激素水平隨花期波動變化,ABA含量變幅最大,ETH含量較為穩(wěn)定。GA3、ABA、ETH含量增加可促進木芙蓉開花,加速花朵的衰敗。今后,可在花芽分化前期外源補充GA3、CTK和ABA等激素,研究其是否提前花芽分化,在花蕾期補充IAA和GA3,研究其是否提前開花,在盛花期補充ABA,觀察其殘花是否容易掉落;同時結合轉錄組等技術研究植物激素對花期的調控機理,以期為木芙蓉花期調控技術提供更充分、更深入的理論依據。