朱章順,王強(qiáng)鋒,李芹,馬嬌,夏中梅,侯勇,王海濤,胡鳳科,徐遠(yuǎn)超
(1.成都市植物園,四川 成都 610083;2.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 生物技術(shù)核技術(shù)研究所,四川 成都 610066;3.四川省蘭月科技有限公司,四川 成都 610207)
木芙蓉(HibiscusmutabilisLinn)為錦葵科(Malvaceae)木槿屬(Hibiscus)落葉灌木或小喬木植物,為我國(guó)長(zhǎng)久栽培的城市綠化及觀賞植物,廣泛分布于四川、云南、湖南、廣西、廣東等地。四川成都有著最悠久的木芙蓉花栽培歷史,“蓉城”由此而來(lái)。芙蓉花是成都的象征,1983年5月26日成都市人大把芙蓉花定為市花,銀杏為市樹(shù),每年農(nóng)歷九月初九為市花市樹(shù)節(jié)[1]。木芙蓉花期較長(zhǎng),花期不一致導(dǎo)致不同花朵先后開(kāi)放不整齊,對(duì)木芙蓉觀賞性和整體美化效果造成不利影響。內(nèi)源激素是一類重要的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì),與花的生長(zhǎng)發(fā)育密切相關(guān),多種內(nèi)源激素的相互作用共同調(diào)控植物的花期。
植物內(nèi)源激素是微量的、自然產(chǎn)生的物質(zhì),目前,已分離鑒定了生長(zhǎng)素(IAA)、赤霉素(GA)、細(xì)胞分裂素(CTK)、乙烯(ETH)、脫落酸(ABA)、油菜素內(nèi)酯(BR)、水楊酸(SA)和茉莉酸(JA)等不同的植物激素[2-3]。內(nèi)源激素通過(guò)復(fù)雜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與調(diào)節(jié)植物各個(gè)生理過(guò)程,植物激素信號(hào)之間存在相互作用,具有復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系,其含量的多少及比例對(duì)植物正常生命活動(dòng)有重要影響[3-6]。蜜柑(CitrusunshiuMarc.)葉片中較高濃度的GA3抑制花芽分化,高IAA和ABA含量促進(jìn)了花芽形成[7]。忍冬(LonicerajaponicaThunb.)花高水平IAA、低水平ABA、高IAA/ABA、ZR(玉米素核苷)/ABA、IAA/GA3及低ABA/GA3、ZR/IAA是影響忍冬‘特蕾1號(hào)’大白期時(shí)長(zhǎng)的主要因素[8]。在白魔芋(Amorphophallusblume)花芽形態(tài)分化時(shí)期,較高濃度的IAA、GA3和ZT(玉米素)在雌蕊成熟過(guò)程中起促進(jìn)作用,在同一過(guò)程中,高濃度的ABA/IAA,ABA/ZT和ABA/GA3均不利于雄蕊的成熟,高濃度ABA是抑制雄蕊成熟的關(guān)鍵因子[9]。在蘋(píng)果(Malussieversii)中,ZR、ZR/GA3分別與短枝比例呈正相關(guān),GA3與花序數(shù)量呈負(fù)相關(guān),蘋(píng)果幼樹(shù)開(kāi)花相關(guān)指標(biāo)分別與細(xì)根中的IAA、ZR、GA3、IAA/ZR呈正相關(guān),內(nèi)源激素在地上部成花與地下部根系生長(zhǎng)過(guò)程中具有重要調(diào)節(jié)作用[10]。目前,國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)木芙蓉內(nèi)源激素相關(guān)報(bào)道。由于內(nèi)源激素在植物體內(nèi)含量極低,結(jié)構(gòu)復(fù)雜,存在很多相互共存的干擾成分,并且容易受光照、溫度和酸堿度的影響導(dǎo)致變性[11]。因此,對(duì)內(nèi)源激素的高效提取、內(nèi)源激素檢測(cè)的精度和準(zhǔn)確度要求較高。目前,高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜法(GC)和質(zhì)譜法(MS)以其分離效率高、檢出限低、耗時(shí)少、樣品量少等優(yōu)點(diǎn),已成為植物激素的重要分析方法[11-12]。
內(nèi)源激素是影響植物開(kāi)花的重要因子,木芙蓉的花具有二次盛開(kāi)的特性,即木芙蓉頂端的花蕾經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的發(fā)育后再次集中開(kāi)放,內(nèi)源激素對(duì)其開(kāi)花過(guò)程可能具有獨(dú)特的調(diào)節(jié)作用。現(xiàn)階段,木芙蓉開(kāi)花特性受內(nèi)源激素調(diào)控機(jī)理的研究還不完善,花期調(diào)控技術(shù)有待提升。本文研究了木芙蓉花期不同階段,即花芽分化期、花芽分化后期、花蕾期、初花期、盛花期、盛花末期、二次盛花期和末花期的葉、花中內(nèi)源激素水平、動(dòng)態(tài)變化規(guī)律、比例關(guān)系等,可為后期通過(guò)非自然的方式調(diào)控木芙蓉花期,提高木芙蓉觀賞性提供理論支撐。
研究區(qū)位于成都市植物園苗圃基地,該地區(qū)屬中亞熱帶濕潤(rùn)季風(fēng)氣候區(qū),無(wú)霜期較長(zhǎng),四季分明,冬春少雨,夏秋多雨,雨量充沛,年平均降水量為900~1 300 mm,年平均氣溫在16 ℃左右,木芙蓉栽植土壤為黃壤。
以木芙蓉品種‘錦繡紫’為試驗(yàn)材料,根據(jù)不同花期采集木芙蓉葉片、花蕾、盛開(kāi)花和衰敗花樣品保存為鮮樣,測(cè)定IAA、ABA、GA3、CTK和ETH的含量。分別于木芙蓉花芽分化期(2019-05-13)、花芽分化后期(2019-05-30)、花蕾期(2019-06-11)、初花期(2019-07-05)、盛花期(2019-07-26)、盛花末期(2019-09-09)、二次盛花期(2019-09-30)、末花期(2019-11-13)隨機(jī)采集9株木芙蓉葉片、花蕾、盛開(kāi)花和衰敗花,各器官樣品采集后立即放入液氮冷凍,放入冰盒,帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行內(nèi)源激素提取與收集,多余樣品置于-80 ℃冰箱中留存?zhèn)溆谩?/p>
采樣時(shí)期作如下定義:花芽分化期指木芙蓉植株枝梢頂端有5~6片真葉,能見(jiàn)明顯葉芽,花芽肉眼不可辯認(rèn)的時(shí)期;花芽分化后期指木芙蓉植株枝梢頂端花芽肉眼可辨認(rèn)的時(shí)期;花蕾期指木芙蓉花蕾最大橫徑約1 cm、花柄長(zhǎng)度約3 cm以上的時(shí)期;初花期指木芙蓉整株有三分之一左右花蕾開(kāi)放的時(shí)期;盛花期指木芙蓉整株有二分之一左右的花蕾開(kāi)放的時(shí)期;盛花末期指木芙蓉植株整株有三分之二以上的花蕾已開(kāi)放的時(shí)期;二次盛花期指木芙蓉植株頂端花蕾經(jīng)過(guò)發(fā)育后開(kāi)放二分之一的時(shí)期;末花期指花蕾全部開(kāi)放的時(shí)期。
其中:采集的花蕾是指花蕾橫徑1~2 cm、花柄長(zhǎng)度3 cm以上,花蕾未破的形態(tài);盛開(kāi)花指開(kāi)放當(dāng)天,花瓣呈向外展開(kāi)形態(tài)的花朵;衰敗花指花朵開(kāi)放24~48 h,花瓣呈萎蔫狀態(tài)的花朵。由于木芙蓉花盛開(kāi)后次日就萎蔫衰敗,因此在初花期也有衰敗花樣品;在末花期花蕾已全部開(kāi)放,無(wú)花蕾的樣品。
1.3.1 高效液相色譜法測(cè)定IAA、GA3、ABA、CTK含量
以甲醇+磷酸緩沖液或水為流動(dòng)相,使用C18的不銹鋼反向柱和紫外檢測(cè)器,對(duì)樣品中的IAA、GA3、ABA、CTK進(jìn)行高效液相色譜分離和測(cè)定,外標(biāo)法定量。
(1)標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液制備及定量工作曲線建立
少量甲醇溶解IAA、GA3、ABA、CTK,用酸性流動(dòng)相配制濃度為3 mg/L的IAA、GA3和ABA溶液,用中性流動(dòng)相配制3 mg/L的CTK溶液。上述溶液進(jìn)一步稀釋成系列標(biāo)準(zhǔn)溶液用于檢測(cè),最終標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)R2>0.99方可使用。
(2)樣品溶液的制備
參考文獻(xiàn)方法[13-15]并作適當(dāng)改進(jìn)。取適量的葉片或花,快速機(jī)械破碎,準(zhǔn)確稱取樣品約20 g于已加入0.5 g三水合二乙基二硫代氨基甲酸鈉(抗氧劑)燒杯中,再加50 mL預(yù)冷甲醇(上述過(guò)程10 s內(nèi)完成),攪拌均勻,超聲破碎2 min,蓋上表面皿在4 ℃下冰箱中避光浸提過(guò)夜;傾倒上清液,再加50 mL預(yù)冷80%甲醇繼續(xù)浸提2 h;連續(xù)收集3次浸提液,先過(guò)濾浸提液再過(guò)濾殘?jiān)?,少?0%甲醇多次清洗,過(guò)濾于燒瓶中(約200 mL);40 ℃條件下減壓濃縮至20 mL左右(盡量去除甲醇);將濃縮樣品無(wú)損轉(zhuǎn)移到分液漏斗中,加入與樣品體積1︰1的石油醚和0.05 g的聚乙烯吡咯烷酮萃取;重復(fù)一次,水相加入與水相體積1︰1的石油醚萃?。凰嘟?jīng)C18小柱(型號(hào):LC-C18 SPE Cartridge,500 mg,3 mL)固液分離,收集濾液。用1 mol/L檸檬酸將濾液pH調(diào)至2~3,用20 mL乙酸乙酯萃取兩次,分別收集兩次萃取后的乙酸乙酯(40 mL) 和最后一次的水相(20 mL);水相用pH=9氨-氯化銨調(diào)至pH=6左右,定容至25 mL,過(guò)0.45 μm濾膜用于測(cè)定CTK;乙酸乙酯相再用20 mL且 pH=10氨-氯化銨緩沖液萃取2次,收集2次水相40 mL,水相重復(fù)上面操作調(diào)酸,乙酸乙酯萃取兩次,收集乙酸乙酯相,用氮吹儀吹干,甲醇溶解,棕色容量瓶定容至5 mL,過(guò)0.45 μm有機(jī)濾膜用于測(cè)定IAA、ABA和GA3。
(3)高效液相色譜操作條件
IAA含量測(cè)定條件:流動(dòng)相為甲醇︰磷酸水溶液(35︰65),波長(zhǎng)280 nm;GA3含量測(cè)定條件:流動(dòng)相為甲醇︰磷酸水溶液(35︰65),波長(zhǎng)210 nm;ABA含量測(cè)定條件:流動(dòng)相為甲醇︰磷酸水溶液(50︰50),波長(zhǎng)254 nm;CTK含量測(cè)定條件:流動(dòng)相為甲醇︰水(30︰70),檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm。
(4)回收率測(cè)定
在設(shè)定的色譜條件下,配制3種不同濃度的植物激素標(biāo)準(zhǔn)液,通過(guò)液相保留時(shí)間和峰面積,分析植物激素的重現(xiàn)性和再現(xiàn)性。
采樣添加標(biāo)樣法測(cè)定回收率[12],在最佳純化及色譜分析條件下,向測(cè)試樣品中加入4種植物內(nèi)源激素各1 mg,測(cè)定加標(biāo)后樣品激素含量,5次重復(fù),計(jì)算加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。
(5)IAA、GA3、ABA、CTK含量計(jì)算
式中:A1為標(biāo)樣溶液中,目標(biāo)物峰面積的平均值;A2為試樣溶液中,目標(biāo)物峰面積的平均值;m1為標(biāo)樣的質(zhì)量(g);m2為試樣的質(zhì)量(g);P為標(biāo)樣中目標(biāo)物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(%);D為稀釋倍數(shù)關(guān)系。
1.3.2 氣譜法測(cè)定ETH含量
(1)樣品處理及乙烯收集
稱取適量樣品(15 ~20 g),放入玻璃瓶中,塞好橡皮塞,用封口膜將縫隙密封,在25 ℃室內(nèi),存放20 h。輕搖玻璃容器,將注射器內(nèi)空氣徹底排除,用排水法收集玻璃容器內(nèi)體積30 mL,轉(zhuǎn)移至鋁箔采樣袋中。
(2)氣相色譜條件
北分瑞利,3420A氣相色譜儀;氫離子火焰檢測(cè)器(FID),檢測(cè)器150 ℃;30 m毛細(xì)管柱,柱溫60 ℃;進(jìn)樣口60 ℃;燃?xì)鈿錃饬魉?0 mL/min,空氣流速400 mL/min,載氣氮?dú)饬魉?0 mL/min。頂空進(jìn)樣針進(jìn)5 μL樣品,重復(fù)測(cè)定3次。
(3)乙烯標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制
配制濃度為0.002、0.004、0.008、0.012、0.016 mL/L的5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)氣體樣品,繪制乙烯標(biāo)準(zhǔn)曲線。
(4)乙烯含量計(jì)算
乙烯濃度(mL/L)=(樣品平均峰高/標(biāo)準(zhǔn)乙烯平均峰高)×標(biāo)準(zhǔn)濃度
乙烯含量以單位時(shí)間內(nèi)單位質(zhì)量的木芙蓉樣品乙烯釋放量計(jì),單位為:mL/(h·g)。
采用Excel 2013進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì),Origin 9.0進(jìn)行圖表制作。
2.1.1 IAA、GA3、ABA、CTK測(cè)定譜圖及回收率
根據(jù)上述條件,IAA、GA3、ABA、CTK提取效果較好,樣品色譜圖和標(biāo)樣色譜圖一致,木芙蓉樣品譜圖見(jiàn)圖1。
圖1 木芙蓉內(nèi)源激素IAA(A)、GA3(B)、ABA(C)、CTK(D)高效液相色譜圖
4種激素的平均回收率為82.72%~105.58%(表1)。說(shuō)明精確性良好,本方法的可靠性較高。
表1 內(nèi)源激素IAA、GA3、ABA、CTK的峰保留時(shí)間和平均回收率
2.1.2 木芙蓉內(nèi)源激素乙烯測(cè)定
上述方法操作簡(jiǎn)便、靈敏度高,乙烯標(biāo)準(zhǔn)曲線y=384.3x-76.43,R2=0.999;本操作條件能快速準(zhǔn)確地測(cè)定木芙蓉內(nèi)源乙烯釋放量,其峰保留時(shí)間0.84 min。
花期不同階段木芙蓉葉、花中內(nèi)源激素含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖2。
圖2 花期不同階段木芙蓉葉、花中內(nèi)源激素含量變化
葉、花中IAA含量在花期不同階段差異較大(圖2A)。由花芽分化期到初花期,葉中IAA含量呈逐漸升高的趨勢(shì);由初花期到末花期,葉片中IAA含量呈“W”型變化趨勢(shì),在盛花期和二次盛花期相對(duì)較低;花蕾中則表現(xiàn)為相反的趨勢(shì),在盛花期和二次盛花期含量相對(duì)較高;盛開(kāi)花和衰敗花中IAA含量在初花期含量最高,其后大幅減少,盛開(kāi)花中IAA含量降低76%~91%,衰敗花中降低85%~93%??梢?jiàn),初花期葉、花中IAA較豐富,主要分布在已開(kāi)放的花朵中,后期主要分布在葉片和花蕾中。
葉、花中ABA含量整體表現(xiàn)為逐漸增加的趨勢(shì),葉、花中增幅不同(圖2B)。葉片和衰敗花中ABA含量在末花期達(dá)到峰值,ABA含量分別是初花期的7.34、13.79倍;花蕾和盛開(kāi)花中ABA含量先增加后降低,在盛花末期時(shí)含量較高??梢?jiàn),在木芙蓉花朵由開(kāi)放到衰敗的過(guò)程中,ABA在葉、花中逐漸累積,在盛花期和盛花末期主要累積在盛開(kāi)花中,第二次盛花至末花期主要累積在衰敗花中。
葉、花中GA3含量的變化呈現(xiàn)明顯的差異(圖2C)。從花芽分化期到初花期,葉中GA3含量降低,花芽分化期最高;從初花期到末花期,葉中GA3含量呈“~”型變化趨勢(shì),在盛花末期和末花期含量相對(duì)較高;花蕾中GA3含量在盛花期和二次盛花期相對(duì)較高;盛開(kāi)花和衰敗花中GA3含量初花期極低,其后大量增加,與葉中GA3相似,在盛花末期和末花期含量相對(duì)較高。
葉、花中CTK含量的變化特征不同(圖2D)。葉中CTK含量花芽分化期最高,隨后大幅降低;花蕾中CTK含量盛花期最高,盛花末期幾乎未檢測(cè)到CTK,二次盛花期CTK含量升高;盛開(kāi)花中CTK含量隨花朵衰敗有明顯的降低,盛花末期和末花期CTK含量遠(yuǎn)低于盛花期,其中二次盛花期含量最高;衰敗花中CTK含量整體表現(xiàn)為逐漸降低的趨勢(shì),在初花期最高??梢?jiàn),在開(kāi)花早期階段(初花期和盛花期),葉、花中CTK含量豐富,隨花朵衰敗CTK含量明顯降低。
葉、花中ETH含量變化趨勢(shì)較一致,ETH含量緩慢升高,從初花期到末花期變幅較小(圖2E)。
不同階段木芙蓉葉、花中內(nèi)源激素間比例關(guān)系見(jiàn)圖3。
圖3 花期不同階段木芙蓉葉、花中內(nèi)源激素間比例關(guān)系
由圖3可知,初花期以后,葉片中GA3/CTK比值呈快速上升趨勢(shì),盛開(kāi)花中GA3/CTK比值逐漸升高,在盛花末期到達(dá)峰值,隨后呈下降趨勢(shì);盛花期,盛開(kāi)花和衰敗花中ABA/IAA比值較高;與其他時(shí)期相比,盛花末期花蕾中GA3/CTK、ABA/GA3和ABA/IAA值較高。
內(nèi)源激素是調(diào)節(jié)花芽分化的關(guān)鍵,植物的不同內(nèi)源激素平衡狀態(tài)影響花芽分化。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),木芙蓉花芽分化期葉片中的GA3、CTK、ABA含量較高。其他植物,如香舌蘭(VanillaplanifoliaAmes)在花芽分化過(guò)程中,生長(zhǎng)素(IAA)具有促進(jìn)花芽分化的作用,玉米素核苷(ZR)和赤霉素(GA)具有抑制花芽分化的作用,脫落酸(ABA)具有先促后抑的作用,低水平的GA/ZR對(duì)花芽形成具有促進(jìn)作用[16]。因此,木芙蓉花芽分化期葉片中較高含量的GA3、CTK,葉片中較低水平的GA3/CTK,有利于促進(jìn)木芙蓉花芽分化;相對(duì)較高水平的ABA抑制了莖尖的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng),從而與IAA、GA3和CTK相互作用,使莖尖由營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)轉(zhuǎn)入生殖生長(zhǎng),促進(jìn)花芽分化。
木芙蓉‘錦繡紫’品種相對(duì)于其他品種而言,衰敗花在盛花期不易掉落,而在末花期衰敗花較易掉落。從內(nèi)源激素來(lái)看,在木芙蓉‘錦繡紫’的盛花期,葉片和衰敗花中ABA含量處于相對(duì)較低水平,在二次盛花期和末花期,葉片和衰敗花中ABA含量均處于高水平。已有研究表明,植物的衰老過(guò)程受多種內(nèi)源激素的共同參與,通過(guò)外源茉莉酸甲酯誘導(dǎo)銀杏(GinkgobilobaL.)葉片衰老過(guò)程中,內(nèi)源性ABA水平顯著增加,而CTK、GA和IAA的含量和未經(jīng)處理的自然衰老葉片相比變化不大,各種激素信號(hào),特別是ABA在調(diào)控葉的衰老過(guò)程中發(fā)生作用[17-18]。因此,在木芙蓉‘錦繡紫’的整個(gè)開(kāi)花周期中,二次盛花期和末花期階段,植株葉片才進(jìn)入衰老過(guò)程,此時(shí)衰敗花中較高的ABA含量會(huì)加快其掉落。
在木芙蓉整個(gè)開(kāi)花時(shí)期,盛開(kāi)花中ETH含量高于衰敗花。已有研究表明,在許多植物物種中,花的衰老是由氣體激素乙烯(ETH)促進(jìn)和細(xì)胞分裂素(CTK)類激素抑制[19],ABA含量升高不影響開(kāi)花時(shí)間和開(kāi)花表型[20]。因此,盛開(kāi)花中ETH快速產(chǎn)生,可能是盛開(kāi)花維持時(shí)間較短的主要原因。但本研究中乙烯含量為各器官在離體條件下收集測(cè)定,不一定反映活體狀態(tài)下真實(shí)的乙烯釋放水平,其乙烯的變化特征還需進(jìn)一步探討。
部分木芙蓉品種有二次盛花的現(xiàn)象[21],結(jié)合本研究發(fā)現(xiàn),兩次開(kāi)花過(guò)程的內(nèi)源激素水平差異較大,主要表現(xiàn)在ABA含量上。葉片中GA3含量從盛花期到盛花末期表現(xiàn)為升高,二次盛花期時(shí)GA3含量降低,在末花期時(shí)其含量升高,IAA與GA3趨勢(shì)基本一致,但ABA含量從盛花期快速升高持續(xù)到末花期?;ɡ僭诔趸ㄆ谝院?,其ABA含量逐漸升高,到盛花末期達(dá)到峰值后降低,兩次盛花期的花蕾中ABA水平差異不大。而盛開(kāi)花中,其ABA含量在盛花期和盛花末期高于二次盛花期和末花期。從開(kāi)花到衰敗的過(guò)程中,葉中IAA、GA3、ABA、ETH含量升高,僅CTK降低;花蕾中IAA、GA3、CTK含量降低,ABA和ETH升高;盛開(kāi)花和衰敗花中IAA和CTK含量降低,GA3、ABA、ETH升高。因本研究是對(duì)木芙蓉花期內(nèi)源激素的首次探究,對(duì)木芙蓉花期的界定亦無(wú)可參考依據(jù),實(shí)際采樣過(guò)程中按照其開(kāi)花表現(xiàn)分成盛花期和二次盛花期,從內(nèi)源激素水平分析,葉片在盛花末期以后才進(jìn)入衰老過(guò)程,二次盛花期過(guò)程中內(nèi)源激素的影響較為復(fù)雜。
綜上所述,在花芽分化期,木芙蓉葉片中較高含量的GA3、CTK、ABA可促進(jìn)花芽分化。在木芙蓉二次盛花期,葉、花中內(nèi)源激素水平隨花期波動(dòng)變化,ABA含量變幅最大,ETH含量較為穩(wěn)定。GA3、ABA、ETH含量增加可促進(jìn)木芙蓉開(kāi)花,加速花朵的衰敗。今后,可在花芽分化前期外源補(bǔ)充GA3、CTK和ABA等激素,研究其是否提前花芽分化,在花蕾期補(bǔ)充IAA和GA3,研究其是否提前開(kāi)花,在盛花期補(bǔ)充ABA,觀察其殘花是否容易掉落;同時(shí)結(jié)合轉(zhuǎn)錄組等技術(shù)研究植物激素對(duì)花期的調(diào)控機(jī)理,以期為木芙蓉花期調(diào)控技術(shù)提供更充分、更深入的理論依據(jù)。