木芙蓉花期不同階段主要器官內源激素含量的變化*

朱章順，王強鋒，李芹，馬嬌，夏中梅，侯勇，王海濤，胡鳳科，徐遠超

(1.成都市植物園,四川 成都 610083;2.四川省農業(yè)科學院 生物技術核技術研究所,四川 成都 610066;3.四川省蘭月科技有限公司,四川 成都 610207)

木芙蓉(HibiscusmutabilisLinn)為錦葵科(Malvaceae)木槿屬(Hibiscus)落葉灌木或小喬木植物，為我國長久栽培的城市綠化及觀賞植物，廣泛分布于四川、云南、湖南、廣西、廣東等地。四川成都有著最悠久的木芙蓉花栽培歷史，“蓉城”由此而來。芙蓉花是成都的象征，1983年5月26日成都市人大把芙蓉花定為市花，銀杏為市樹，每年農歷九月初九為市花市樹節(jié)[1]。木芙蓉花期較長，花期不一致導致不同花朵先后開放不整齊，對木芙蓉觀賞性和整體美化效果造成不利影響。內源激素是一類重要的植物生長調節(jié)物質，與花的生長發(fā)育密切相關，多種內源激素的相互作用共同調控植物的花期。

植物內源激素是微量的、自然產生的物質，目前，已分離鑒定了生長素(IAA)、赤霉素(GA)、細胞分裂素(CTK)、乙烯(ETH)、脫落酸(ABA)、油菜素內酯(BR)、水楊酸(SA)和茉莉酸(JA)等不同的植物激素[2-3]。內源激素通過復雜的信號轉導途徑參與調節(jié)植物各個生理過程，植物激素信號之間存在相互作用，具有復雜的網絡關系，其含量的多少及比例對植物正常生命活動有重要影響[3-6]。蜜柑(CitrusunshiuMarc.)葉片中較高濃度的GA3抑制花芽分化，高IAA和ABA含量促進了花芽形成[7]。忍冬(LonicerajaponicaThunb.)花高水平IAA、低水平ABA、高IAA/ABA、ZR(玉米素核苷)/ABA、IAA/GA3及低ABA/GA3、ZR/IAA是影響忍冬‘特蕾1號’大白期時長的主要因素[8]。在白魔芋(Amorphophallusblume)花芽形態(tài)分化時期，較高濃度的IAA、GA3和ZT(玉米素)在雌蕊成熟過程中起促進作用，在同一過程中，高濃度的ABA/IAA，ABA/ZT和ABA/GA3均不利于雄蕊的成熟，高濃度ABA是抑制雄蕊成熟的關鍵因子[9]。在蘋果(Malussieversii)中，ZR、ZR/GA3分別與短枝比例呈正相關，GA3與花序數量呈負相關，蘋果幼樹開花相關指標分別與細根中的IAA、ZR、GA3、IAA/ZR呈正相關，內源激素在地上部成花與地下部根系生長過程中具有重要調節(jié)作用[10]。目前，國內外未見木芙蓉內源激素相關報道。由于內源激素在植物體內含量極低，結構復雜，存在很多相互共存的干擾成分，并且容易受光照、溫度和酸堿度的影響導致變性[11]。因此，對內源激素的高效提取、內源激素檢測的精度和準確度要求較高。目前，高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜法(GC)和質譜法(MS)以其分離效率高、檢出限低、耗時少、樣品量少等優(yōu)點，已成為植物激素的重要分析方法[11-12]。

內源激素是影響植物開花的重要因子，木芙蓉的花具有二次盛開的特性，即木芙蓉頂端的花蕾經過一段時間的發(fā)育后再次集中開放，內源激素對其開花過程可能具有獨特的調節(jié)作用。現階段，木芙蓉開花特性受內源激素調控機理的研究還不完善，花期調控技術有待提升。本文研究了木芙蓉花期不同階段，即花芽分化期、花芽分化后期、花蕾期、初花期、盛花期、盛花末期、二次盛花期和末花期的葉、花中內源激素水平、動態(tài)變化規(guī)律、比例關系等，可為后期通過非自然的方式調控木芙蓉花期，提高木芙蓉觀賞性提供理論支撐。

1 材料和方法

1.1 研究區(qū)概況

研究區(qū)位于成都市植物園苗圃基地，該地區(qū)屬中亞熱帶濕潤季風氣候區(qū)，無霜期較長，四季分明，冬春少雨，夏秋多雨，雨量充沛，年平均降水量為900～1 300 mm，年平均氣溫在16 ℃左右，木芙蓉栽植土壤為黃壤。

1.2 試驗材料與試驗設計

以木芙蓉品種‘錦繡紫’為試驗材料，根據不同花期采集木芙蓉葉片、花蕾、盛開花和衰敗花樣品保存為鮮樣，測定IAA、ABA、GA3、CTK和ETH的含量。分別于木芙蓉花芽分化期(2019-05-13)、花芽分化后期(2019-05-30)、花蕾期(2019-06-11)、初花期(2019-07-05)、盛花期(2019-07-26)、盛花末期(2019-09-09)、二次盛花期(2019-09-30)、末花期(2019-11-13)隨機采集9株木芙蓉葉片、花蕾、盛開花和衰敗花，各器官樣品采集后立即放入液氮冷凍，放入冰盒，帶回實驗室進行內源激素提取與收集，多余樣品置于-80 ℃冰箱中留存?zhèn)溆谩?/p>

采樣時期作如下定義：花芽分化期指木芙蓉植株枝梢頂端有5～6片真葉，能見明顯葉芽，花芽肉眼不可辯認的時期；花芽分化后期指木芙蓉植株枝梢頂端花芽肉眼可辨認的時期；花蕾期指木芙蓉花蕾最大橫徑約1 cm、花柄長度約3 cm以上的時期；初花期指木芙蓉整株有三分之一左右花蕾開放的時期；盛花期指木芙蓉整株有二分之一左右的花蕾開放的時期；盛花末期指木芙蓉植株整株有三分之二以上的花蕾已開放的時期；二次盛花期指木芙蓉植株頂端花蕾經過發(fā)育后開放二分之一的時期；末花期指花蕾全部開放的時期。

其中：采集的花蕾是指花蕾橫徑1～2 cm、花柄長度3 cm以上，花蕾未破的形態(tài)；盛開花指開放當天，花瓣呈向外展開形態(tài)的花朵；衰敗花指花朵開放24～48 h，花瓣呈萎蔫狀態(tài)的花朵。由于木芙蓉花盛開后次日就萎蔫衰敗，因此在初花期也有衰敗花樣品；在末花期花蕾已全部開放，無花蕾的樣品。

1.3 試驗方法與處理

1.3.1 高效液相色譜法測定IAA、GA3、ABA、CTK含量

以甲醇+磷酸緩沖液或水為流動相，使用C18的不銹鋼反向柱和紫外檢測器，對樣品中的IAA、GA3、ABA、CTK進行高效液相色譜分離和測定，外標法定量。

(1)標準樣品溶液制備及定量工作曲線建立

少量甲醇溶解IAA、GA3、ABA、CTK，用酸性流動相配制濃度為3 mg/L的IAA、GA3和ABA溶液，用中性流動相配制3 mg/L的CTK溶液。上述溶液進一步稀釋成系列標準溶液用于檢測，最終標準曲線相關系數R2>0.99方可使用。

(2)樣品溶液的制備

參考文獻方法[13-15]并作適當改進。取適量的葉片或花，快速機械破碎，準確稱取樣品約20 g于已加入0.5 g三水合二乙基二硫代氨基甲酸鈉(抗氧劑)燒杯中，再加50 mL預冷甲醇(上述過程10 s內完成)，攪拌均勻，超聲破碎2 min，蓋上表面皿在4 ℃下冰箱中避光浸提過夜；傾倒上清液，再加50 mL預冷80%甲醇繼續(xù)浸提2 h；連續(xù)收集3次浸提液，先過濾浸提液再過濾殘渣，少量80%甲醇多次清洗，過濾于燒瓶中(約200 mL)；40 ℃條件下減壓濃縮至20 mL左右(盡量去除甲醇)；將濃縮樣品無損轉移到分液漏斗中，加入與樣品體積1︰1的石油醚和0.05 g的聚乙烯吡咯烷酮萃??；重復一次，水相加入與水相體積1︰1的石油醚萃??；水相經C18小柱(型號：LC-C18 SPE Cartridge，500 mg，3 mL)固液分離，收集濾液。用1 mol/L檸檬酸將濾液pH調至2～3，用20 mL乙酸乙酯萃取兩次，分別收集兩次萃取后的乙酸乙酯(40 mL) 和最后一次的水相(20 mL)；水相用pH=9氨-氯化銨調至pH=6左右，定容至25 mL，過0.45 μm濾膜用于測定CTK；乙酸乙酯相再用20 mL且 pH=10氨-氯化銨緩沖液萃取2次，收集2次水相40 mL，水相重復上面操作調酸，乙酸乙酯萃取兩次，收集乙酸乙酯相，用氮吹儀吹干，甲醇溶解，棕色容量瓶定容至5 mL，過0.45 μm有機濾膜用于測定IAA、ABA和GA3。

(3)高效液相色譜操作條件

IAA含量測定條件：流動相為甲醇︰磷酸水溶液(35︰65)，波長280 nm；GA3含量測定條件：流動相為甲醇︰磷酸水溶液(35︰65)，波長210 nm；ABA含量測定條件：流動相為甲醇︰磷酸水溶液(50︰50)，波長254 nm；CTK含量測定條件：流動相為甲醇︰水(30︰70)，檢測波長280 nm。

(4)回收率測定

在設定的色譜條件下，配制3種不同濃度的植物激素標準液，通過液相保留時間和峰面積，分析植物激素的重現性和再現性。

采樣添加標樣法測定回收率[12]，在最佳純化及色譜分析條件下，向測試樣品中加入4種植物內源激素各1 mg，測定加標后樣品激素含量，5次重復，計算加標回收率和相對標準偏差。

(5)IAA、GA3、ABA、CTK含量計算

式中：A1為標樣溶液中，目標物峰面積的平均值；A2為試樣溶液中，目標物峰面積的平均值；m1為標樣的質量(g)；m2為試樣的質量(g)；P為標樣中目標物的質量分數(%)；D為稀釋倍數關系。

1.3.2 氣譜法測定ETH含量

(1)樣品處理及乙烯收集

稱取適量樣品(15 ～20 g)，放入玻璃瓶中，塞好橡皮塞，用封口膜將縫隙密封，在25 ℃室內，存放20 h。輕搖玻璃容器，將注射器內空氣徹底排除，用排水法收集玻璃容器內體積30 mL，轉移至鋁箔采樣袋中。

(2)氣相色譜條件

北分瑞利，3420A氣相色譜儀；氫離子火焰檢測器(FID)，檢測器150 ℃；30 m毛細管柱，柱溫60 ℃；進樣口60 ℃；燃氣氫氣流速40 mL/min，空氣流速400 mL/min，載氣氮氣流速50 mL/min。頂空進樣針進5 μL樣品，重復測定3次。

(3)乙烯標準曲線繪制

配制濃度為0.002、0.004、0.008、0.012、0.016 mL/L的5個標準氣體樣品，繪制乙烯標準曲線。

(4)乙烯含量計算

乙烯濃度(mL/L)=(樣品平均峰高/標準乙烯平均峰高)×標準濃度

乙烯含量以單位時間內單位質量的木芙蓉樣品乙烯釋放量計，單位為：mL/(h·g)。

1.4 數據處理與分析

采用Excel 2013進行數據統(tǒng)計，Origin 9.0進行圖表制作。

2 結果與分析

2.1 木芙蓉內源激素測定方法可行性

2.1.1 IAA、GA3、ABA、CTK測定譜圖及回收率

根據上述條件，IAA、GA3、ABA、CTK提取效果較好，樣品色譜圖和標樣色譜圖一致，木芙蓉樣品譜圖見圖1。

圖1 木芙蓉內源激素IAA(A)、GA3(B)、ABA(C)、CTK(D)高效液相色譜圖

4種激素的平均回收率為82.72%～105.58%(表1)。說明精確性良好，本方法的可靠性較高。

表1 內源激素IAA、GA3、ABA、CTK的峰保留時間和平均回收率

2.1.2 木芙蓉內源激素乙烯測定

上述方法操作簡便、靈敏度高，乙烯標準曲線y=384.3x-76.43，R2=0.999；本操作條件能快速準確地測定木芙蓉內源乙烯釋放量，其峰保留時間0.84 min。

2.2 花期不同階段木芙蓉葉、花中內源激素含量

花期不同階段木芙蓉葉、花中內源激素含量測定結果見圖2。

圖2 花期不同階段木芙蓉葉、花中內源激素含量變化

葉、花中IAA含量在花期不同階段差異較大(圖2A)。由花芽分化期到初花期，葉中IAA含量呈逐漸升高的趨勢；由初花期到末花期，葉片中IAA含量呈“W”型變化趨勢，在盛花期和二次盛花期相對較低；花蕾中則表現為相反的趨勢，在盛花期和二次盛花期含量相對較高；盛開花和衰敗花中IAA含量在初花期含量最高，其后大幅減少，盛開花中IAA含量降低76%～91%，衰敗花中降低85%～93%?？梢姡趸ㄆ谌~、花中IAA較豐富，主要分布在已開放的花朵中，后期主要分布在葉片和花蕾中。

葉、花中ABA含量整體表現為逐漸增加的趨勢，葉、花中增幅不同(圖2B)。葉片和衰敗花中ABA含量在末花期達到峰值，ABA含量分別是初花期的7.34、13.79倍；花蕾和盛開花中ABA含量先增加后降低，在盛花末期時含量較高。可見，在木芙蓉花朵由開放到衰敗的過程中，ABA在葉、花中逐漸累積，在盛花期和盛花末期主要累積在盛開花中，第二次盛花至末花期主要累積在衰敗花中。

葉、花中GA3含量的變化呈現明顯的差異(圖2C)。從花芽分化期到初花期，葉中GA3含量降低，花芽分化期最高；從初花期到末花期，葉中GA3含量呈“～”型變化趨勢，在盛花末期和末花期含量相對較高；花蕾中GA3含量在盛花期和二次盛花期相對較高；盛開花和衰敗花中GA3含量初花期極低，其后大量增加，與葉中GA3相似，在盛花末期和末花期含量相對較高。

葉、花中CTK含量的變化特征不同(圖2D)。葉中CTK含量花芽分化期最高，隨后大幅降低；花蕾中CTK含量盛花期最高，盛花末期幾乎未檢測到CTK，二次盛花期CTK含量升高；盛開花中CTK含量隨花朵衰敗有明顯的降低，盛花末期和末花期CTK含量遠低于盛花期，其中二次盛花期含量最高；衰敗花中CTK含量整體表現為逐漸降低的趨勢，在初花期最高?？梢?，在開花早期階段(初花期和盛花期)，葉、花中CTK含量豐富，隨花朵衰敗CTK含量明顯降低。

葉、花中ETH含量變化趨勢較一致，ETH含量緩慢升高，從初花期到末花期變幅較小(圖2E)。

2.3 花期不同階段木芙蓉葉、花中內源激素間比例關系

不同階段木芙蓉葉、花中內源激素間比例關系見圖3。

圖3 花期不同階段木芙蓉葉、花中內源激素間比例關系

由圖3可知，初花期以后，葉片中GA3/CTK比值呈快速上升趨勢，盛開花中GA3/CTK比值逐漸升高，在盛花末期到達峰值，隨后呈下降趨勢；盛花期，盛開花和衰敗花中ABA/IAA比值較高；與其他時期相比，盛花末期花蕾中GA3/CTK、ABA/GA3和ABA/IAA值較高。

3 討論與結論

內源激素是調節(jié)花芽分化的關鍵，植物的不同內源激素平衡狀態(tài)影響花芽分化。本試驗發(fā)現，木芙蓉花芽分化期葉片中的GA3、CTK、ABA含量較高。其他植物，如香舌蘭(VanillaplanifoliaAmes)在花芽分化過程中，生長素(IAA)具有促進花芽分化的作用，玉米素核苷(ZR)和赤霉素(GA)具有抑制花芽分化的作用，脫落酸(ABA)具有先促后抑的作用，低水平的GA/ZR對花芽形成具有促進作用[16]。因此，木芙蓉花芽分化期葉片中較高含量的GA3、CTK，葉片中較低水平的GA3/CTK，有利于促進木芙蓉花芽分化；相對較高水平的ABA抑制了莖尖的營養(yǎng)生長，從而與IAA、GA3和CTK相互作用，使莖尖由營養(yǎng)生長轉入生殖生長，促進花芽分化。

木芙蓉‘錦繡紫’品種相對于其他品種而言，衰敗花在盛花期不易掉落，而在末花期衰敗花較易掉落。從內源激素來看，在木芙蓉‘錦繡紫’的盛花期，葉片和衰敗花中ABA含量處于相對較低水平，在二次盛花期和末花期，葉片和衰敗花中ABA含量均處于高水平。已有研究表明，植物的衰老過程受多種內源激素的共同參與，通過外源茉莉酸甲酯誘導銀杏(GinkgobilobaL.)葉片衰老過程中，內源性ABA水平顯著增加，而CTK、GA和IAA的含量和未經處理的自然衰老葉片相比變化不大，各種激素信號，特別是ABA在調控葉的衰老過程中發(fā)生作用[17-18]。因此，在木芙蓉‘錦繡紫’的整個開花周期中，二次盛花期和末花期階段，植株葉片才進入衰老過程，此時衰敗花中較高的ABA含量會加快其掉落。

在木芙蓉整個開花時期，盛開花中ETH含量高于衰敗花。已有研究表明，在許多植物物種中，花的衰老是由氣體激素乙烯(ETH)促進和細胞分裂素(CTK)類激素抑制[19]，ABA含量升高不影響開花時間和開花表型[20]。因此，盛開花中ETH快速產生，可能是盛開花維持時間較短的主要原因。但本研究中乙烯含量為各器官在離體條件下收集測定，不一定反映活體狀態(tài)下真實的乙烯釋放水平，其乙烯的變化特征還需進一步探討。

部分木芙蓉品種有二次盛花的現象[21]，結合本研究發(fā)現，兩次開花過程的內源激素水平差異較大，主要表現在ABA含量上。葉片中GA3含量從盛花期到盛花末期表現為升高，二次盛花期時GA3含量降低，在末花期時其含量升高，IAA與GA3趨勢基本一致，但ABA含量從盛花期快速升高持續(xù)到末花期?；ɡ僭诔趸ㄆ谝院?，其ABA含量逐漸升高，到盛花末期達到峰值后降低，兩次盛花期的花蕾中ABA水平差異不大。而盛開花中，其ABA含量在盛花期和盛花末期高于二次盛花期和末花期。從開花到衰敗的過程中，葉中IAA、GA3、ABA、ETH含量升高，僅CTK降低；花蕾中IAA、GA3、CTK含量降低，ABA和ETH升高；盛開花和衰敗花中IAA和CTK含量降低，GA3、ABA、ETH升高。因本研究是對木芙蓉花期內源激素的首次探究，對木芙蓉花期的界定亦無可參考依據，實際采樣過程中按照其開花表現分成盛花期和二次盛花期，從內源激素水平分析，葉片在盛花末期以后才進入衰老過程，二次盛花期過程中內源激素的影響較為復雜。

綜上所述，在花芽分化期，木芙蓉葉片中較高含量的GA3、CTK、ABA可促進花芽分化。在木芙蓉二次盛花期，葉、花中內源激素水平隨花期波動變化，ABA含量變幅最大，ETH含量較為穩(wěn)定。GA3、ABA、ETH含量增加可促進木芙蓉開花，加速花朵的衰敗。今后，可在花芽分化前期外源補充GA3、CTK和ABA等激素，研究其是否提前花芽分化，在花蕾期補充IAA和GA3，研究其是否提前開花，在盛花期補充ABA，觀察其殘花是否容易掉落；同時結合轉錄組等技術研究植物激素對花期的調控機理，以期為木芙蓉花期調控技術提供更充分、更深入的理論依據。