發(fā)根農(nóng)桿菌介導的白花草木樨毛狀根轉(zhuǎn)化體系的建立

王升升， 段 珍， 張吉宇

(蘭州大學草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點實驗室， 蘭州大學草地農(nóng)業(yè)科技學院， 甘肅 蘭州 730020)

草木樨(Melilotusspp.) 是一年生或兩年生的豆科(Leguminosae)草本植物[1-2]，全世界共有 19 種，主要分布于歐亞大陸地中海區(qū)域、東歐和亞洲，白花草木樨是該屬最廣泛的栽培種之一[3-4]。草木樨適應(yīng)環(huán)境能力強，可在許多牧草難以生長的鹽堿等地區(qū)種植，且具有較強的抗逆性，其中抗鹽和耐寒的能力在主要豆科牧草中尤其突出[5-6]。草木樨作為栽培面積僅次于紫花苜蓿的優(yōu)良豆科牧草，營養(yǎng)價值十分豐富，其中粗蛋白質(zhì)和粗脂肪的含量較高，并含有大量的胡蘿卜素和礦物質(zhì)等，是家畜的優(yōu)良飼草[7-8]。草木樨根系發(fā)達，既能夠固定空氣中的氮氣(N2)，改善土壤肥力，又可以保持土壤，防治水土流失[9]。目前對于草木樨的研究主要集中在栽培技術(shù)研制[10]、化學成分鑒定[11]、分子標記開發(fā)[12]及草木樨屬植物遺傳多樣性評價[13]等方面。駱凱等[14]從國內(nèi)外引進了100份兩年生的草木樨種質(zhì)進行了農(nóng)藝性狀初步評價并分析了19份種質(zhì)的品質(zhì)性狀；Di等[15]對草木樨屬植物的形態(tài)學以及系統(tǒng)進化進行了研究；剡轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)等[16]在白花草木樨中大規(guī)模開發(fā)設(shè)計了EST-SSR分子標記，進一步篩選了多態(tài)性高的標記；狄紅艷等[17]分析了18個地理種群的黃花和白花草木樨的ITS序列和葉綠體trnL-trnF序列，研究了這兩種草木樨之間的系統(tǒng)進化關(guān)系。但是，關(guān)于草木樨的突變體[18]和分子機制方面研究較少，Luo[19]和Wu[1]對草木樨的轉(zhuǎn)錄組和miRNAs進行了相關(guān)分析，但因為草木樨缺乏遺傳轉(zhuǎn)化方法，限制了對其基因功能的深入研究。

發(fā)根農(nóng)桿菌(Agrobacteriumrhizogenes)是一種根瘤菌科的革蘭氏陰性土壤桿菌，其攜帶的Ri質(zhì)粒能夠侵染幾乎所有的雙子葉植物和少數(shù)單子葉植物，誘導植物受傷部位長出毛狀根，并產(chǎn)生大量有效的次生代謝產(chǎn)物[20]。目前，發(fā)根農(nóng)桿菌介導的毛狀根轉(zhuǎn)化體系已成功應(yīng)用到蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)[21]和大豆(Glycinemax)[22]等豆科植物中，用于驗證結(jié)瘤等相關(guān)基因的功能。ROP6是小GTPases亞家族ROP基因家族的成員，已證實該基因在百脈根(Lotusjaponicus)[23]和蒺藜苜蓿[24]中正向參與共生固氮信號轉(zhuǎn)導途徑，但在草木樨中尚未研究。本研究以白花草木樨結(jié)瘤基因MaROP6為例，開發(fā)了一套高效的白花草木樨毛狀根轉(zhuǎn)化體系，為深入研究草木樨的基因功能奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1植物材料 白花草木樨野生型Ma389(種子由加州大學洛杉磯分校的Hirsch教授友情提供)。

1.1.2菌株與質(zhì)粒 發(fā)根農(nóng)桿菌K599菌株(由中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所謝旗研究員課題組友情提供)；DH5α大腸桿菌感受態(tài)(購自北京全式金生物公司)；表達載體質(zhì)粒pBI121-DsRed2，該載體帶有DsRed2紅色熒光蛋白標記基因(購自武漢淼靈生物公司)。

1.1.3培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基(1 L)：蛋白胨10.0 g，酵母提取物5.0 g，NaCL10.0 g，PH=7.4(固體培養(yǎng)基加15.0 g瓊脂)；

0.85%瓊脂的培養(yǎng)基(1 L)：瓊脂8.5 g；

1/2MS培養(yǎng)基(1 L)：MS(Murashige & Skoog Basal Medium With Vitamins)2.22 g，蔗糖8.0 g，PH=5.8(固體培養(yǎng)基加7.0 g瓊脂)；

營養(yǎng)液(1 L)參考陳安樂[25]：25 mg FeSO4·7H20，33.5 mg EDTA-Na2，98.6 mg MgS04·7H20，69.7 mg K2SO4，117.6 mg CaCl2·2H2O,34.8 mg K2HPO4，0.711 mg H3BO3，0.445 mg MnCl2·4H2O，0.037 mg CuSO4·5H20，0.102 mg ZnCl2，0.012 mg Na2MoO4·2H20；

滅菌條件：121℃，30 min。

1.1.4實驗引物 使用SnapGene軟件和DNAMAN軟件設(shè)計本實驗所需的引物。MaROP6-1為MaROP6和pBI121-DsRed2的融合引物，上下游分別帶有XbaI和BamH I酶(TaKaRa)切位點，用于克隆MaROP6全長片段。MaROP6-2為嵌合引物，上游取于表達載體pBI121-DsRed2，下游取于基因MaROP6，用于轉(zhuǎn)基因毛狀根的檢測。MaROP6-3和Maβ-tubulin[1](內(nèi)參基因)用于qR7-PCR檢測。引物合成由北京擎科生物公司完成。

表1 PCR和qRT-PCR引物名稱、序列和用途Table 1 PCR and qRT-PCR Primer name,sequence and use

1.2 試驗方法

1.2.1RNA的提取與cDNA的合成 按照UNIQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒(生工生物公司)的說明書，提取白花草木樨野生型Ma389的根以及轉(zhuǎn)MaROP6的毛狀根總RNA，使用TIANScript II RT Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒(天根生化公司)進行cDNA的合成，分別用于MaROP6全長片段的克隆以及MaROP6表達量的測定。

1.2.2MaROP6全長片段的克隆與載體構(gòu)建 根據(jù)本課題組前期完成的草木樨基因組數(shù)據(jù)(BioProject ID:PRJNA674670)獲得MaROP6的CDS序列。使用融合引物MaROP6-1和Prime STAR HS高保真酶(TaKaRa)對MaROP6全長片段進行PCR擴增，使用限制性內(nèi)切酶XbaI和BamHI對表達載體pBI121-DsRed2進行雙酶切，將擴增產(chǎn)物和酶切產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后，使用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒(生工生物公司)進行切膠回收。

用ClonExpress MultiS無縫克隆試劑盒(諾唯贊生物公司)將載體和MaROP6的回收產(chǎn)物連接在一起，使用大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物后，用50 mg L-1卡那霉素(Kan)的LB固體培養(yǎng)基涂板，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)至過夜，挑選陽性單克隆后測序，測序正確后用SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒(生工生物公司)進行質(zhì)粒pBI121-DsRed2-MaROP6的提取。

1.2.3MaROP6基因序列的生物信息學分析 將MaROP6序列提交到Expasy(http://www.expasy.org/tools/)，分析其氨基酸數(shù)目、分子量和等電點等理化性質(zhì)。MaROP6基因的外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)在Gene structure display server(GSDS,http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)上進行鑒定。利用DNAMAN軟件對MaROP6基因的CDS和氨基酸序列進行比對。

1.2.4pBI121-DsRed2-MaROP6載體轉(zhuǎn)化發(fā)根農(nóng)桿菌K599 制備發(fā)根農(nóng)桿菌K599感受態(tài)，使用電激轉(zhuǎn)化法將構(gòu)建的載體pBI121-DsRed2-MaROP6轉(zhuǎn)入發(fā)根農(nóng)桿菌K599感受態(tài)，在28℃搖床200 rpm復(fù)蘇3 h后，使用50 mg·L-1Kan和50 mg·L-1鏈霉素(Stre)的LB固體培養(yǎng)基篩選陽性單克隆，使用50 mg·L-1Kan和50 mg·L-1Stre的LB液體培養(yǎng)基在28℃，200 rpm培養(yǎng)2 d后，OD=1.8左右，用50%的甘油保菌于—80℃?zhèn)溆?，用于白花草木樨毛狀根轉(zhuǎn)化。

1.2.5切根侵染法誘導白花草木樨毛狀根 農(nóng)桿菌活化及培養(yǎng)。取保存于—80℃分別含有pBI121-DsRed2載體和pBI121-DsRed2-MaROP6載體的K599菌液200 uL，均勻涂板于含50 mg·L-1Kan，50 mg L-1Stre的LB固體培養(yǎng)基中，28℃倒置培養(yǎng)2 d(圖1A)備用。

種子處理。將白花草木樨Ma389種子，用濃硫酸處理3 min后，使用滅菌水清洗五次，用75%的乙醇處理30 s，5%的次氯酸鈉溶液處理5 min后，使用滅菌水清洗五次，在超凈工作臺中均勻的點在0.85%瓊脂培養(yǎng)基上。每次實驗可使用100粒種子。

種子萌發(fā)。將其置于4℃的冰箱春化2 d，再放置于25℃培養(yǎng)箱(16 h光照/8 h黑暗)培養(yǎng)3 d，待幼苗長出兩片子葉，下胚軸為5 mm左右時，進行侵染(圖1 B)。

外植體準備。在超凈工作臺中，準備兩個無菌培養(yǎng)皿，其中一個中加入少量無菌水，鑷子和手術(shù)刀用酒精燈消毒后，等恢復(fù)至正常溫度時，用鑷子輕輕夾取幼苗至空的培養(yǎng)皿中，用手術(shù)刀在根尖往上5 mm處快速切斷，然后放于含有少量無菌水的培養(yǎng)皿中，防止萎蔫。

切根侵染。用鑷子夾取已切根的幼苗，在滅菌濾紙上吸去多余的水分，輕輕劃過菌膜，蘸取少量的農(nóng)桿菌后，將其放置于不含抗生素的1/2 MS培養(yǎng)基上(圖1 C)，每個培養(yǎng)基中放12株，用封口膜封住培養(yǎng)基，并用錫箔紙外包進行暗處理，立放在22℃組培室(16 h光照/8 h黑暗)3 d。

幼苗除菌。在超凈工作臺，將幼苗從暗處理條件下拿出，將其放置于含有250 mg·L-1頭孢噻肟鈉(Caf)和250 mg·L-1羧芐青霉素(Car)的滅菌水中，在28℃搖床120 rpm除菌30 min，在超凈工作臺中，用滅菌水清洗三遍后，將其放在含有250 mg·L-1Caf和250 mg·L-1Car的1/2 MS培養(yǎng)基上，并采用濾紙-幼苗-濾紙的結(jié)構(gòu)進行放置(圖1 D)，每個培養(yǎng)基放7株，用封口膜封住培養(yǎng)基，立放在22℃組培室(16 h光照/8 h黑暗)5 d。

幼苗液體培養(yǎng)。將幼苗從固體培養(yǎng)基中移入營養(yǎng)液中(圖1 F)，放置在22℃組培室(16 h光照/8 h黑暗)，等待幼苗長出發(fā)根，在這期間，營養(yǎng)液每2～3 d補充一次，每5 d更換一次，以免因為農(nóng)桿菌的繁殖而影響植物生長。

圖1 草木樨毛狀根轉(zhuǎn)化Fig.1 Hairy roots transformation in Melilotus albus注：A：帶有pBI121-DsRed2-MaROP6的發(fā)根農(nóng)桿菌；B：5 d幼苗及幼苗切根位置；C：幼苗切根處蘸取農(nóng)桿菌后放在1/2 MS培養(yǎng)基上；D：幼苗轉(zhuǎn)移至含有250 mg·L-1Caf和250 mg·L-1Car的1/2 MS培養(yǎng)基；E：幼苗切根處膨大；F：幼苗轉(zhuǎn)移至液體培養(yǎng)基；G：幼苗長出毛狀根；H：幼苗長出側(cè)根；I：毛狀根在共聚焦激光掃描顯微鏡下出現(xiàn)紅色熒光。紅色箭頭指示切面；藍色箭頭指示側(cè)根；標尺為1 cm和100 μm(I)Note:A:Agrobacterium rhizogenes with pBI121-DsRed2-MaROP6;B:5-day seedling and seedling root cutting position;C:Dipping Agrobacterium at the root cutting part of the seedling and putting the seedling on a 1/2 MS culture medium;D:Transferring the seedlings to a 1/2 MS medium containing 250 mg·L-1 cephalosporin and 250 mg·L-1 carbenicillin;E:expanding at the cut root locus of the seedlings;F:Transferring seedlings to a liquid culture medium;G:Hairy roots grow from seedlings;H:Lateral roots grow from seedlings;I:Red fluorescence appeared in hairy roots under confocal scanning laser microscope. The sectioned surfaces are indicated by red arrows;the lateral roots are indicated by blue arrows. Scale bars=1 cm and 100 μm (I)

1.2.6毛狀根的繼代培養(yǎng) 選擇生長迅速、粗壯的3～5 cm的新生毛狀根，用無菌手術(shù)刀切取1～2 cm的根尖，轉(zhuǎn)移至含有250 mg·L-1Caf和250 mg·L-1Car的1/2 MS培養(yǎng)基上，使根尖緊貼在培養(yǎng)基的表面,每個培養(yǎng)基放7條毛狀根。將其置于25℃黑暗培養(yǎng)，每4～5 d將根系轉(zhuǎn)移至新的繼代培養(yǎng)基中，以自然生長的根作為對照，連續(xù)培養(yǎng)30 d。

1.2.7PCR檢測MaROP6轉(zhuǎn)基因毛狀根的轉(zhuǎn)化率 使用M5超光速Mix試劑盒(北京聚合美生物公司)和嵌合引物MaROP6-2進行PCR檢測，用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳進行驗證。草木樨毛狀根轉(zhuǎn)化率=(陽性毛狀根數(shù)量/毛狀根數(shù)量)×100%。

1.2.8qRT-PCR測定轉(zhuǎn)基因毛狀根中MaROP6的表達量 按照Hieff qPCR試劑盒(元升生物公司)的說明書，使用引物MaROP6-3和Maβ-tubulin進行qRT-PCR測定轉(zhuǎn)基因毛狀根中MaROP6的表達量。每組實驗設(shè)置三個生物學重復(fù)，使用2-ΔΔCT[26]方法計算相對表達量。

2 結(jié)果與分析

2.1 MaROP6基因的克隆與載體構(gòu)建

基因CDS序列為594 bp，編碼198個氨基酸，蛋白質(zhì)分子量為21.604 kDa，等電點為9.32。MaROP6基因結(jié)構(gòu)顯示，MaROP6是由七個外顯子和六個內(nèi)含子組成(圖2)。

MaROP6屬于小G蛋白ROP基因家族，它的蛋白包含Zheng等[27]提出的七個功能域(圖3)，GTPase域(I和III)，GDP/GTP結(jié)合域(IV和VI)和效應(yīng)域(II)都是高度保守的，但插入?yún)^(qū)(V)和C端區(qū)(VII)是可變的。

圖2 MaROP6基因結(jié)構(gòu)Fig.2 MaROP6 gene structure

圖3 MaROP6的CDS和氨基酸序列Fig.3 CDS and amino acid sequence of MaROP6注：*為終止密碼子，Ⅰ-Ⅶ為MaROP6蛋白的七個功能域Note:* represents the Stop Codon,Ⅰ-Ⅶ are the seven functional domains of MaROP6 protein

以白花草木樨cDNA為模板，用MaROP6-1融合引物進行PCR擴增，在500 bp到750 bp之間發(fā)現(xiàn)有清晰的條帶出現(xiàn)，測序結(jié)果顯示與白花草木樨基因組數(shù)據(jù)完全符合，同時將載體pBI121-DsRed2雙酶切后備用(圖4)。

因為MaROP6-1的引物兩端帶有載體的同源

圖4 pBI121-DsRed2和MaROP6全長片段及 pBI121-DsRed2-MaROP6Fig.4 pBI121-DsRed2 and full length of the MaROP6 and pBI121-DsRed2-MaROP6注：條帶1為pBI121-DsRed2質(zhì)粒，條帶2為酶切后的pBI121-DsRed2質(zhì)粒，條帶3為克隆的MaROP6全長全段，條帶4為pBI121-DsRed2-MaROP6質(zhì)粒Note:Band 1 is pBI121-DsRed2 plasmid,band 2 is the vector after restriction digestion,band 3 is the full length of the cloned MaROP6,band 4 is pBI121-DsRed2-MaROP6 plasmid

片段，所以無縫連接酶可以將基因與載體上的同源片段融合，使二者連接在一起(圖5)。

圖5 pBI121-DsRed2-MaROP6表達載體構(gòu)建示意圖Fig.5 Schematic diagram of pBI121-DsRed2-MaROP6 expression vector construction

2.2 毛狀根的獲得與繼代培養(yǎng)

幼苗暗處理后，可以清晰的看到幼苗的切根處開始膨大，并且在不含抗生素的1/2 MS固體培養(yǎng)基上，可以觀察到幼苗切根處繁殖的發(fā)根農(nóng)桿菌(圖1C)。幼苗進行除菌，在含有250 mg·L-1Caf和250 mg·L-1Car的1/2 MS固體培養(yǎng)基上生長5天后，可以看到幼苗的切根處比之前更加膨大(圖1E)。

將幼苗轉(zhuǎn)移到液體培養(yǎng)基中繼續(xù)生長，在營養(yǎng)液中培養(yǎng)4～5 d時，可以觀察到部分幼苗出現(xiàn)了毛狀根(圖1F)，7 d左右時，幼苗的毛狀根則可以生長到4～5 cm，并且可以看到在幼苗的切口處有側(cè)根的出現(xiàn)(圖1 H)。并且在共聚焦激光掃描顯微鏡下，可以看到轉(zhuǎn)基因毛狀根中載體pBI121-DsRed2所特有的紅色熒光(圖1 I)。

將轉(zhuǎn)化的毛狀根的1～2 cm的根尖置于繼代培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每1～2 d觀察一次毛狀根的生長狀況。自然生長的根在繼代培養(yǎng)基中生長緩慢，5 d左右時根系逐漸變成褐色最終死亡(圖6A)，轉(zhuǎn)化的毛狀根在繼代培養(yǎng)基中生長迅速，2 d左右時可觀察到根尖伸長(圖6B)，7 d左右時可觀察到根系有大量側(cè)根長出(圖6C)，繼代培養(yǎng)30 d后，根系大量繁殖，長滿培養(yǎng)皿(圖6D)。

圖6 毛狀根在繼代培養(yǎng)基上的培養(yǎng)Fig.6 Cultivation of hairy roots on subculture medium注：A：自然生長的根尖繼代培養(yǎng)；B：毛狀根的根尖繼代培養(yǎng)；C：毛狀根繼代培養(yǎng)7 d時的生長狀況；D：毛狀根繼代培養(yǎng)30 d時的生長狀況。標尺為1 cmNote:A:Subculture of natural root tips;B:Subculture of hairy root tips;C:Growth of hairy roots in subculture for 7 days;D:Growth of hairy roots in subculture for 30 days. Scale bars=1 cm

2.3 毛狀根的發(fā)生率

通過統(tǒng)計100株轉(zhuǎn)化后白花草木樨幼苗長出毛狀根的數(shù)量，來計算毛狀根的發(fā)生率，實驗重復(fù)三次，發(fā)現(xiàn)平均有78株白花草木樨的幼苗在切口處能長出毛狀根，計算出白花草木樨毛狀根的發(fā)生率為78.00±2.00%。隨機挑選24株出現(xiàn)毛狀根的白花草木樨幼苗，統(tǒng)計出1株上平均有4.04±1.55條毛狀根。

2.4 毛狀根的轉(zhuǎn)化率

隨機挑選24株長出毛狀根的幼苗，從幼苗的切口處取毛狀根，用PCR來鑒定毛狀根的轉(zhuǎn)化率，實驗重復(fù)3次，如圖7所示，24株白花草木樨毛狀根中能檢測出17株有條帶，計算出白花草木樨毛狀根的轉(zhuǎn)化率為70.80±4.20%。

圖7 轉(zhuǎn)基因毛狀根的檢測Fig.7 Detection of transgenic hairy roots注：24株毛狀根中轉(zhuǎn)基因毛狀根鑒定的PCR擴增結(jié)果，陽性對照為pBI121-DsRed2-MaROP6重組質(zhì)粒，陰性對照為dd水和空載體轉(zhuǎn)化株Note:PCR amplification results for identification of transgenic hairy roots among 24 hairy roots,The positive control is pBI121-DsRed2-MaROP6 recombinant plasmid,and the negative control is dd water and empty vector transformant

2.5 轉(zhuǎn)基因毛狀根中MaROP6的相對表達量

使用引物MaROP6-3和內(nèi)參Maβ-tubulin，以空載體轉(zhuǎn)化的草木樨為對照，進行qRT-PCR實驗，來計算白花草木樨轉(zhuǎn)基因毛狀根中MaROP6的表達量。如圖8所示，17株的陽性根中，MaROP6最低和最高相對表達量分別為對照的6.70倍和134.83倍，平均表達量為對照的36.87倍。

圖8 轉(zhuǎn)基因毛狀根中MaROP6的表達水平Fig.8 The expression level of MaROP6 in transgenic hairy roots

3 討論

3.1 發(fā)根農(nóng)桿菌的應(yīng)用及切根侵染法誘導毛狀根的形成

自Smith和Townsend在1907年發(fā)現(xiàn)發(fā)根農(nóng)桿菌能誘導植物形成毛狀根以來[28]，通過研究其侵染植物的原理及優(yōu)化不同植物的轉(zhuǎn)化方法，目前已經(jīng)在160多種植物中成功利用發(fā)根農(nóng)桿菌侵染獲得了轉(zhuǎn)基因毛狀根[29]。陳安樂[25]使用K599菌株在大豆中建立了高效的毛狀根轉(zhuǎn)化體系，使得大豆幼苗在侵染一周后就產(chǎn)生了毛狀根，通過該方法介導GmFRD3基因在大豆中過表達，使得轉(zhuǎn)基因毛狀根的耐鋁性得到極大的提高；陳燕等[30]在百脈根中建立了毛狀根轉(zhuǎn)化體系，在百脈根子葉侵染后的10 d左右，即可獲得轉(zhuǎn)基因毛狀根；王天佐等[31]在花苜蓿中建立了高效的毛狀根轉(zhuǎn)化體系，在一周左右即可獲得轉(zhuǎn)基因毛狀根，毛狀根的轉(zhuǎn)化率可達到66.7%；劉佳[32]以苦參的不同部位作為外植體，和四種發(fā)根農(nóng)桿菌作為轉(zhuǎn)化菌株，最終建立了以子葉節(jié)為外植體的高效苦參毛狀根轉(zhuǎn)化體系，在四周后即可獲得長勢良好的毛狀根。發(fā)根農(nóng)桿菌誘導植物產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因毛狀根，因為具有生長速度快、分化程度高、遺傳穩(wěn)定性強和操作簡便等特點[33]，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用在改良植物品種和植物基因工程等領(lǐng)域[34]。

切根侵染法是建立毛狀根轉(zhuǎn)化體系常用的方法之一，是在無菌環(huán)境下將原植物的根切除后，利用發(fā)根農(nóng)桿菌介導在植物的切口處長出轉(zhuǎn)基因毛狀根，使用該方法產(chǎn)生的植物為嵌合植物，即地上部分是非轉(zhuǎn)基因的，而根是轉(zhuǎn)基因的[35]。使用切根侵染法獲得轉(zhuǎn)基因毛狀根比使用根癌農(nóng)桿菌獲得轉(zhuǎn)基因株系更加快速、簡便，且切根侵染法作為分子生物學的研究手段，在無雜菌環(huán)境中培養(yǎng)的毛狀根可以作為轉(zhuǎn)基因的無菌苗進行后續(xù)實驗研究，Si等[36]利用切根法將發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化蒺藜苜蓿，研究了MtDGD1在蒺藜苜蓿根瘤發(fā)育和共生固氮過程中的重要作用。

3.2 白花草木樨毛狀根轉(zhuǎn)化關(guān)鍵點分析

3.2.1侵染幼苗苗齡的選擇 白花草木樨種子萌發(fā)所用的培養(yǎng)基為0.85%水瓊脂培養(yǎng)基，能為種子萌發(fā)提供足夠的濕度和營養(yǎng)物質(zhì)，白花草木樨種子的萌發(fā)率高，從萌發(fā)到進行切根侵染大約需要5 d，幼苗過小進行侵染，則容易被農(nóng)桿菌侵染致死，出現(xiàn)幼苗顏色變?yōu)楹稚默F(xiàn)象；幼苗過大進行侵染，則會降低毛狀根的發(fā)生率和轉(zhuǎn)化率；以剛長出兩片子葉苗齡大約為5 d的幼苗進行切根侵染效果最佳。

3.2.2暗處理時長 幼苗進行切根侵染后需要進行暗處理，暗處理時間少于3 d時，幼苗沒有明顯的切根處開始膨大的特征，處理時間多于5 d時，幼苗會出現(xiàn)幼苗的切根處變細、變軟和變白的現(xiàn)象，這都會阻礙毛狀根的形成，所以幼苗暗處理的時間為3～4 d最佳，培養(yǎng)基上有明顯的農(nóng)桿菌繁殖的現(xiàn)象，但不足以影響幼苗正常生長，且幼苗的切根處有明顯膨大的特征。

3.2.3除菌條件的優(yōu)化 幼苗暗處理后需要進行除菌處理，參考宗曉秋[37]大豆的除菌條件，設(shè)置單一抗生素Caf(250 mg·L-1或500 mg·L-1)或Car(250 mg·L-1或500 mg·L-1)時，培養(yǎng)基上出現(xiàn)農(nóng)桿菌的單菌落，幼苗表面也有過度生長的農(nóng)桿菌；設(shè)置250 mg·L-1Caf和250 mg·L-1Car時，培養(yǎng)基中沒有出現(xiàn)農(nóng)桿菌的單菌落，且毛狀根生長旺盛；幼苗設(shè)置250 mg·L-1Caf和500 mg·L-1Car或500 mg·L-1Caf和250 mg·L-1Car時，培養(yǎng)基中雖然沒有農(nóng)桿菌的單菌落，但幼苗生長緩慢，毛狀根生長減緩，顏色逐漸變?yōu)楹稚Ｋ?，幼苗除菌時選擇250 mg·L-1Caf和250 mg·L-1Car的滅菌水，在28℃搖床120 rpm除菌30 min，最后放置于含250 mg·L-1Caf和250 mg·L-1Car 1/2 MS培養(yǎng)基上的效果最佳。幼苗采用濾紙-幼苗-濾紙的結(jié)構(gòu)放置在除菌培養(yǎng)基上，可以使幼苗更加充分的接觸培養(yǎng)基，且豎直放置時不會使幼苗跌落而影響生長。

綜合來看，采用切根侵染法誘導白花草木樨毛狀根的產(chǎn)生，可以在兩周左右獲得轉(zhuǎn)基因毛狀根，這比用根癌農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化體系得到轉(zhuǎn)基因植株要更加快速和簡便。

3.3 白花草木樨毛狀根轉(zhuǎn)化效率分析

對轉(zhuǎn)MaROP6基因毛狀根的發(fā)生率和轉(zhuǎn)化率進行統(tǒng)計，實驗設(shè)置三個重復(fù)，計算出毛狀根的發(fā)生率和轉(zhuǎn)化率分別為78.00±2.00%和70.80±4.20%。相對于豆科植物中百脈根52.60±6.30%和紫花苜蓿52.20±6.40%的轉(zhuǎn)化率[36]，白花草木樨的轉(zhuǎn)化率明顯更高，與毛苕子75.00±4.80%[35]和花苜蓿66.70%[31]的轉(zhuǎn)化率相比相差不大，表明白花草木樨是易于轉(zhuǎn)化的豆科植物。qRT-PCR結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因毛狀根中MaROP6的平均表達量為對照的36.87倍，而花苜蓿轉(zhuǎn)基因根中MrbZIP66的平均表達量為對照的34.13倍[31]，低于白花草木樨。這就表明本實驗建立的毛狀根轉(zhuǎn)化體系是一種高效的轉(zhuǎn)化體系，可以用于白花草木樨基因功能的驗證。

白花草木樨毛狀根的發(fā)生率和轉(zhuǎn)化率都在70%以上，且超表達MaROP6的相對平均表達量為對照的36.87倍。這就表明利用發(fā)根農(nóng)桿菌介導的白花草木樨毛狀根轉(zhuǎn)化可以作為一種快速簡便的白花草木樨生物技術(shù)手段。

3.4 白花草木樨毛狀根誘導再生植株前景分析

目前草木樨尚未建立穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化體系，如何將草木樨的毛狀根誘導出愈傷組織進而再生成完整轉(zhuǎn)化植株需要進一步的探索。參考玉米[38]和北玄參[39]的毛狀根體系誘導愈傷組織和再生植株的成功條件，首先需要優(yōu)化毛狀根的誘導和培養(yǎng)方法，增加毛狀根的生物量，其次參考玉米、北玄參和其他豆科植物由毛狀根誘導愈傷組織和再生植株的培養(yǎng)基配方，對于6-BA和NAA等的用量需要進一步探索，最后要進一步驗證草木樨合適的品種作為轉(zhuǎn)基因植物的前體材料。通過毛狀根誘導建立穩(wěn)定的草木樨遺傳轉(zhuǎn)化體系，為草木樨基因功能的深入研究提供強有力的手段，是目前迫切需要解決的問題。

4 結(jié)論

本研究以白花草木樨為材料，以結(jié)瘤基因MaROP6為例，采用切根侵染法建立了一種高效的白花草木樨毛狀根轉(zhuǎn)化體系，并成功獲得了轉(zhuǎn)MaROP6基因的毛狀根，毛狀根的發(fā)生率和轉(zhuǎn)化率分別可以達到78.00±2.00%和70.80±4.20%，且轉(zhuǎn)基因毛狀根中MaROP6的相對平均表達量可以達到對照的36.87倍，表明毛狀根轉(zhuǎn)化體系已經(jīng)成功應(yīng)用到白花草木樨結(jié)瘤基因的功能研究中。白花草木樨毛狀根轉(zhuǎn)化體系的建立為白花草木樨結(jié)瘤基因功能的研究提供了強有力的手段，并可能將其應(yīng)用到抗逆基因功能的研究等其他領(lǐng)域，為草木樨基因功能的驗證和遺傳選育奠定基礎(chǔ)。