紅豆草種子形態(tài)和營(yíng)養(yǎng)成分遺傳變異分析

魏少萍， 李景峰， 梁鵬飛， 陳 潔， 劉 鑫， 南麗麗

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院/草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 甘肅 蘭州 730070)

紅豆草(Onobrychisviciaefolia)為豆科(Leguminosae)驢食草屬(OnobrychisMill)深根型草本植物，播種當(dāng)年根系生長(zhǎng)迅速，適應(yīng)環(huán)境的可塑性大，含有豐富的植物蛋白，廣泛用于城市綠地工程建設(shè)、水土保持工程建設(shè)、草田輪作、綠肥、混播和再生體系建立等[1-2]。植物表型是基因和環(huán)境共同作用的結(jié)果，反映了基因型在長(zhǎng)期的環(huán)境變化壓力適應(yīng)下的新選擇[3]。而種子生長(zhǎng)環(huán)境與其他營(yíng)養(yǎng)器官相比較為封閉，受到的外界環(huán)境因子的影響較小，因此，種子形態(tài)特征相對(duì)穩(wěn)定[4]。植物種子形態(tài)主要受遺傳因素控制，但在不同的分布區(qū)域也會(huì)由于適應(yīng)不同的生境而產(chǎn)生新表型，因此表型變異往往在適應(yīng)和進(jìn)化上有重要意義[5]。對(duì)種子形態(tài)特征和營(yíng)養(yǎng)成分的研究對(duì)植物優(yōu)良品種選育和品種鑒定具有較大的潛力。種子形態(tài)特征經(jīng)常作為研究對(duì)象用以區(qū)分種類。

以往對(duì)紅豆草的研究主要集中在改土效益[6]、誘變選育[7]、基因克隆[8]、抗病性[9]、光合特征[10]、提純復(fù)壯[11]、抗逆性[12-13]及ISSR體系優(yōu)化[14]等方面，而有關(guān)紅豆草種子形態(tài)及營(yíng)養(yǎng)成分變異方面的研究少見報(bào)道。種子表型特征變異是植物遺傳變異的重要特征之一，在遺傳分類學(xué)上具有重要研究?jī)r(jià)值[15]。種子的形態(tài)特征是識(shí)別種子的重要依據(jù)，其與種子的擴(kuò)散傳播能力、種子的萌發(fā)、幼苗定植，甚至種群的分布格局密切相關(guān)[16]。牧草種子的外部形態(tài)是各種牧草種子真實(shí)性和純度鑒定以及進(jìn)行種子分級(jí)和檢驗(yàn)的主要依據(jù)[17]。

本研究以國內(nèi)外22份紅豆草種質(zhì)資源為供試材料，研究紅豆草種子的面積、周長(zhǎng)、長(zhǎng)寬比、長(zhǎng)度、寬度和千粒重等形態(tài)指標(biāo)及種子中粗蛋白、粗脂肪、淀粉和水分等主要營(yíng)養(yǎng)成分，通過方差分析、相關(guān)分析、主成分分析和聚類分析等綜合評(píng)價(jià)紅豆草種質(zhì)的特性，深入探討紅豆草種質(zhì)的變異情況，以期為篩選和綜合評(píng)價(jià)紅豆草優(yōu)異新品種、種質(zhì)鑒定及種質(zhì)資源保護(hù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試紅豆草材料共22份，其中編號(hào)1，6，2323-1，1626，1668，1994，2049，2208，2323-2，2559，2668，7456，9155，9602，9699，9860，9977，10295，13523，13709共20份由農(nóng)業(yè)部全國畜牧獸醫(yī)總站牧草種質(zhì)資源搜集保護(hù)項(xiàng)目協(xié)作組(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所)從俄羅斯瓦維洛夫植物基因庫引進(jìn)，‘蒙農(nóng)紅豆草’(Onobrychisviciaefolia‘Mengnong’，MN，育成品種)種子由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)提供，‘甘肅紅豆草’(Onobrychisviciaefolia‘Gansu’，GS，地方品種)種子由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)提供。

1.2 試驗(yàn)地概況

將22份材料于2019年4月3日種植在甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)武威黃羊鎮(zhèn)牧草試驗(yàn)站(37°55′ N，102°40′ E)。該站海拔1 550.88 m，年均溫7.2℃，年降水量150 mm，年蒸發(fā)量2 019.9 mm，無霜期154 d，屬于溫帶干旱荒漠氣候，土壤類型為沙壤土[18]。人工開溝條播，播種深度3～4 cm，播種量60 kg·hm-2，小區(qū)面積20 m2(4.0 m×5.0 m)，小區(qū)間隔0.5 m。播前澆一次底墑水，生長(zhǎng)期間，不施肥，于紅豆草出苗期、分枝期、現(xiàn)蕾期漫灌?，F(xiàn)蕾期后每小區(qū)使用隔離網(wǎng)以防發(fā)生雜交，并在每小區(qū)放養(yǎng)熊蜂授粉，于2020年6月下旬待80%的莢果呈黑褐色時(shí)采集各材料的種子，帶回實(shí)驗(yàn)室自然干燥后在種子袋中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 種子功能性狀測(cè)定

采用多功能種子分析儀(1903817S)對(duì)22份紅豆草種質(zhì)進(jìn)行種子功能性狀分析，每份種質(zhì)300粒，測(cè)量種子的面積、周長(zhǎng)、長(zhǎng)寬比、長(zhǎng)度、寬度。

具體操作如下：先將干凈的種子均勻的平鋪于背光板上，將高拍儀調(diào)整至適合的高度后，采用ScanMaker i600 Plus上下LED雙光源彩色掃描儀掃描種子，進(jìn)行種子圖像采集。然后，根據(jù)工作區(qū)范圍進(jìn)行二值和反色設(shè)置后，即可啟動(dòng)圖像分析系統(tǒng)，將種子大小及形態(tài)性狀數(shù)字化，之后進(jìn)一步分析和處理數(shù)據(jù)。

參照我國GB/T3543.7-1995《農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程其他項(xiàng)目檢驗(yàn)》[19]文件中千粒重的測(cè)定方法，采用千粒法測(cè)定其帶莢千粒重。

1.4 種子發(fā)芽力測(cè)定

參考《草種子檢驗(yàn)規(guī)程發(fā)芽實(shí)驗(yàn)(GB/T 2930.4-2017)》[20]，發(fā)芽試驗(yàn)采用紙上發(fā)芽法。從去掉莢果的充分混合的凈種子中隨機(jī)數(shù)取種子，每重復(fù)100粒，重復(fù)4次，整齊擺放在鋪有2張濾紙的培養(yǎng)盒(12 cm×12 cm)中，預(yù)先4℃冷凍7 d后置于變溫為20℃/30℃、光暗周期為16 h/8 h的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，從第2 d開始記錄，期間保持濾紙濕潤(rùn)，第10 d后連續(xù)沒有種子發(fā)芽，故第14 d為末次計(jì)數(shù)時(shí)間，第4 d計(jì)算發(fā)芽勢(shì)，第10 d測(cè)定根長(zhǎng)，并計(jì)算發(fā)芽指數(shù)、發(fā)芽率。

1.5 種子營(yíng)養(yǎng)成分測(cè)定

取不同紅豆草材料種子于105℃烘箱中烘干至恒定質(zhì)量后在研缽中磨碎，取樣測(cè)定相關(guān)指標(biāo)，各指標(biāo)重復(fù)3次。粗蛋白含量采用凱氏定氮法測(cè)定，淀粉含量采用蒽酮顯色法測(cè)定[21]，使用全自動(dòng)脂肪測(cè)定儀(1804190S)測(cè)定粗脂肪，磷含量采用氫醌-亞硫酸鈉比色法測(cè)定，含水量采用我國農(nóng)業(yè)部頒布的GB3543-83《農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程》中的105℃低恒溫烘干法測(cè)定[22]。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

采用多功能種子分析儀進(jìn)行種子圖像采集和特征獲取，應(yīng)用Microsoft Excel 2010軟件整理數(shù)據(jù)，計(jì)算各表型指標(biāo)的平均值和變異系數(shù)(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤)，SPSS19.0軟件對(duì)表型數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差統(tǒng)計(jì)分析、相關(guān)性分析、主成分分析和聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅豆草種子形態(tài)特征差異分析

由表1和圖1可知，不同來源紅豆草種子的面積、周長(zhǎng)、長(zhǎng)度、寬度、千粒重、根長(zhǎng)、種皮色澤存在顯著差異(P<0.05)。種子面積均值為8.20 mm2，變化幅度為6.83～9.21 mm2，其中10295號(hào)面積最小，2668號(hào)最大，后者是前者的1.35倍；周長(zhǎng)均值為10.91 mm，變化幅度為10.00～11.65 mm，其中10295號(hào)周長(zhǎng)最小，9155號(hào)最大，后者是前者的1.17倍；長(zhǎng)寬比均值為1.35，變化范圍為1.31～1.40，其中2323-1號(hào)長(zhǎng)寬比最小，13709號(hào)最大；長(zhǎng)度均值為3.88 mm，變化范圍為3.60～4.20 mm，其中10295號(hào)長(zhǎng)度最短，9155最長(zhǎng)，后者是前者的1.17倍；寬度均值為2.88 mm，變化幅度為2.60～3.07 mm，其中10295號(hào)種子最窄，2668號(hào)最寬，后者是前者的1.18倍；千粒重均值為21.40 g，其中6號(hào)最輕(16.50 g)，是平均值的0.77倍，GS最重，達(dá)25.30 g，是平均值的1.18倍；第10 d根長(zhǎng)均值為6.32 cm，1668號(hào)可達(dá)10.27 cm。

表1 紅豆草種子主要形態(tài)特征參數(shù)Table 1 Main morphological characteristic parameters in sainfoin seeds

2.2 紅豆草種子營(yíng)養(yǎng)成分和發(fā)芽指標(biāo)差異分析

由表2可知，不同來源紅豆草種子主要營(yíng)養(yǎng)成分含量差異顯著(P<0.05)。其中種子粗脂肪含量變化幅度為5.56%～11.38%，GS粗脂肪含量最低，9699號(hào)最高，后者是前者的2.05倍；種子淀粉含量變化范圍為4.84～24.71 mg·g-1，2049號(hào)淀粉含量最低，1994號(hào)最高，后者是前者的5.11倍；種子粗蛋白變化范圍為15.86%～19.97%，2323-1號(hào)種子粗蛋白含量最低，GS最高；磷含量MN最高；平均含水量為4.63%；9977號(hào)發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率均最高，7456反之。比較紅豆草種子各形態(tài)指標(biāo)和營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)變異系數(shù)發(fā)現(xiàn)，種子形態(tài)指標(biāo)的變異系數(shù)變化幅度為9.1%～18.6%，平均11.56%，而營(yíng)養(yǎng)成分含量變異系數(shù)變幅為6.7%～20.4%，平均為12.18%。

圖1 供試22份紅豆草種子測(cè)量圖Fig.1 The survey sheet of twenty-two tested sainfoin seeds

表2 紅豆草種子主要營(yíng)養(yǎng)成分含量Table 2 Main nutrients contents in sainfoin seeds

2.3 紅豆草種子特征參數(shù)的相關(guān)性分析

由表3可知，紅豆草種子形態(tài)特征參數(shù)間和各營(yíng)養(yǎng)成分含量指標(biāo)間存在一定的相關(guān)性。其種子面積與種子周長(zhǎng)、長(zhǎng)度、寬度呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)；種子周長(zhǎng)與種子長(zhǎng)度、寬度呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)；種子長(zhǎng)度與種子寬度呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)；種子千粒重與種子面積、寬度呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，與種子周長(zhǎng)、長(zhǎng)度呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，與種子長(zhǎng)寬比呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)，與種子中粗脂肪含量呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)。

2.4 紅豆草種子特征參數(shù)主成分分析

以上分析表明，紅豆草種子不同特征參數(shù)間具有豐富的關(guān)聯(lián)性，為深層解釋其變化的主要原因，以種子形態(tài)特征和營(yíng)養(yǎng)成分含量均值為指標(biāo)，對(duì)22份紅豆草種質(zhì)的種子進(jìn)行主成分分析。表4中前3個(gè)主成分累計(jì)方差達(dá)到了83.477%，因此可以選擇這3個(gè)主成分進(jìn)行提取分析。

表3 紅豆草種子主要特征參數(shù)間相關(guān)系數(shù)Table 3 Correlation coefficients among main characteristic parameters of sainfoin seeds

表4 紅豆草種子性狀的特征值與主成分貢獻(xiàn)率Table 4 Characteristic values and contribution rates of principal components of sainfoin seeds

由表5可得出第1主成分得分y1、第2主成分得分y2和第3主成分得分y3。方程為：y1=0.516x1+0.508x2+0.502x3+0.471x4+0.403x5-0.328x6-0.077x7+0.165x8-0.254x9

(1)

y2=0.022x1+0.078x2+0.104x3+0.184x4-0.254x5+0.337x6+0.638x7+0.324x8-0.073x9

(2)

y3=0.143x1+0.221x2+0.261x3+0.357x4-0.249x5+0.412x6-0.085x7-0.677x8+0.570x9

(3)

Z=0.55099×y1+0.15380×y2+0.12998×y3

(4)

在第1主成分上載荷量較大的因子由大至小依次是種子寬度、種子面積、種子周長(zhǎng)、種子長(zhǎng)度和千粒重，集中反映了種子的形態(tài)特征；在第2主成分上載荷量較大的因子由大至小依次為粗蛋白和淀粉含量，基本反映了種子的營(yíng)養(yǎng)成分含量特征；在第3主成分上載荷量較大的因子是粗脂肪和長(zhǎng)寬比。主成分分析結(jié)果顯示，影響紅豆草種子的主要性狀是種子形態(tài)特征中的寬度、面積和周長(zhǎng)，其次為營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)中的粗蛋白和淀粉含量。根據(jù)第1、第2、第3主成分的貢獻(xiàn)值，可分別計(jì)算第1、第2、第3主成分的得分，并根據(jù)得分和權(quán)重(方差貢獻(xiàn)率)的乘積得出綜合得分(2)，具體計(jì)算公式分別為(1)，(2)，(3)和(4)。

表5 各指標(biāo)主成分載荷矩陣Table 5 Principal component load matrix of each index

表6對(duì)22份紅豆草種子材料進(jìn)行主成分綜合得分排名可知，編號(hào)2668，9155，GS，MN，13523，2323-2和1994綜合排名較前。

2.5 聚類分析

以紅豆草種子發(fā)芽力、形態(tài)特征和營(yíng)養(yǎng)成分含量為指標(biāo)，對(duì)22份紅豆草種子進(jìn)行聚類分析，結(jié)果如圖2所示。根據(jù)聚類圖可將供試22份種質(zhì)種子劃分為3組，第1組包括11份材料，編號(hào)分別為1626，1668，GS，13523，2208，2668，MN，1994，2049，9860和9977，其特點(diǎn)是種子發(fā)芽力較強(qiáng)、較大較圓、重量較重、主要營(yíng)養(yǎng)成分含量較高；第2組次之，材料有9699，6，2323-2，9602，1，9155，10295和2323-1；第3組有3份材料，為2559，7456和13709，其特點(diǎn)是種子形態(tài)指標(biāo)偏小，發(fā)芽力較弱。說明這3組材料間具有明顯差異，這與前面的方差比較結(jié)果相符合，為進(jìn)一步研究選育優(yōu)良紅豆草種質(zhì)提供了基礎(chǔ)依據(jù)。

表6 主成分得分和綜合得分Table 6 Principal component score and comprehensive score

圖2 供試的22份紅豆草種子的聚類圖Fig.2 The cluster dendrogram of twenty-two tested sainfoin seeds

3 討論

在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，種子是最基本的生產(chǎn)資料，是植物遺傳和變異的載體[23]，而牧草種質(zhì)資源在長(zhǎng)期的突變、基因交流、隔離和遺傳分化的演化進(jìn)程中，經(jīng)過選擇蘊(yùn)藏著豐富的基因資源，具有物種多樣性和遺傳多樣性，對(duì)于植物的栽培利用具有極為重要的意義[24]。而我國每年需要大量的牧草種子，自主培育品種少且質(zhì)量不高，如果僅靠進(jìn)口或野外收集，則不能滿足我國草地建設(shè)的要求，因此，培育出具有我國特色的優(yōu)良牧草種子在生產(chǎn)實(shí)踐中則顯得非常重要。

方升佐等[25]研究表明，不同種源種子生長(zhǎng)的環(huán)境條件(包括氣候和土壤條件)不同，種子中營(yíng)養(yǎng)成分的積累也有所不同，從而影響種子品質(zhì)的優(yōu)劣。李娟等[26]的研究表明，不同種源閩楠(Phoebebournei)種子部分特征參數(shù)形態(tài)和主要營(yíng)養(yǎng)成分含量變異由各環(huán)境因子綜合作用造成。但關(guān)于造成種子形態(tài)特征和營(yíng)養(yǎng)成分含量差異的主要原因是自身遺傳變異特性還是外界環(huán)境因素尚不清楚，以至于不能完全辨析種子形態(tài)特征和營(yíng)養(yǎng)成分含量的變異模式，科學(xué)準(zhǔn)確的對(duì)各個(gè)種源進(jìn)行劃分。本試驗(yàn)表明，國內(nèi)外22份紅豆草種子的形態(tài)特征和營(yíng)養(yǎng)成分含量差異顯著。因22份材料種植于同一塊試驗(yàn)田(武威黃羊鎮(zhèn)牧草試驗(yàn)站)，其氣候、海拔、土壤等環(huán)境條件一致，可大致排除外界環(huán)境因素對(duì)種子形態(tài)和營(yíng)養(yǎng)含量的影響，推測(cè)造成這種差異的主要因素是由種子的遺傳特性決定，這與張文標(biāo)等[27]對(duì)導(dǎo)致同一區(qū)域夏臘梅(Calycanthuschinensis)果實(shí)和種子形態(tài)變異差異較大的因素可能與其母株個(gè)體的差異、果實(shí)和種子的生長(zhǎng)位置等結(jié)論相似。

本研究相關(guān)分析表明，紅豆草種子形狀越近似圓形，種子內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)越多，則種子越重，這與眾多學(xué)者研究結(jié)果一致[28-30]。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)紅豆草種子發(fā)芽率與種子面積、周長(zhǎng)、長(zhǎng)寬比、水分均呈一定的負(fù)相關(guān)關(guān)系，這可能是因?yàn)榉N子越小越圓，含水量很少，組織之間變得緊密堅(jiān)實(shí)，其相對(duì)表面積越大，保水和吸水能力強(qiáng)，使得其發(fā)芽率較高。這與楊潔晶等[31]、宗文杰等[32]、張蕾等[33]認(rèn)為小粒種子具有較高萌發(fā)率的研究結(jié)論相一致。

一般認(rèn)為，種子內(nèi)含營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)越高，發(fā)芽迅速且整齊[34-35]。但在本研究中，成熟后的紅豆草種子中粗蛋白、粗脂肪和淀粉與其發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)沒有顯著的相關(guān)性。種子的粗脂肪含量與粗蛋白含量、淀粉含量均呈不顯著負(fù)相關(guān)，其原因可能與紅豆草種子的儲(chǔ)存條件或后熟有關(guān)，一些破損種子入庫后導(dǎo)致脂肪的酸敗或種子后熟不完全，只有少量的糖類轉(zhuǎn)化為脂肪。因此，對(duì)紅豆草種質(zhì)優(yōu)良性狀的選擇和親緣關(guān)系的分類還需進(jìn)一步進(jìn)行田間試驗(yàn)并從分子水平上進(jìn)行深入探討。

4 結(jié)論

編號(hào)10295，2668，‘甘肅紅豆草’，9860，9155，‘蒙農(nóng)紅豆草’，13709，1994，9977，7456的種子發(fā)芽力、形態(tài)性狀和主要營(yíng)養(yǎng)成分含量方面與其他材料間存在顯著差異；而材料13523，2049，1994，1626，‘蒙農(nóng)紅豆草’的綜合表現(xiàn)較好，其種子較圓、重量較重、主要營(yíng)養(yǎng)成分含量較高、發(fā)芽力較強(qiáng)。研究結(jié)果為進(jìn)一步研究紅豆草的遺傳多樣性和選育等提供基礎(chǔ)資料。