叢枝菌根真菌對干旱脅迫下鵝絨委陵菜生理指標的影響

齊晨汐， 易觀濤， 付曉璇， 王海龍， 王佳琳， 吳建慧

(東北林業(yè)大學(xué)， 黑龍江 哈爾濱 150040)

干旱是世界性環(huán)境問題，全球有三分之一以上的地區(qū)為干旱或半干旱地區(qū)，其他地區(qū)植物在生長季也會遭受不同程度的干旱脅迫[1]，在諸多非生物脅迫中，干旱脅迫對植物的危害程度占主要地位。陳愛萍等[2]研究發(fā)現(xiàn)，在中度和重度干旱脅迫下伊犁絹蒿幼苗地上部分生長受到嚴重抑制。干旱脅迫會誘導(dǎo)植物活性氧的累積，降低植物水勢，從而引起植物吸收礦質(zhì)營養(yǎng)能力下降，阻礙植物生長，甚至導(dǎo)致植物死亡[3]。為了減緩干旱脅迫對植物的傷害，國內(nèi)外有許多學(xué)者取得了相關(guān)成果，如噴施生長素[4]、噴施赤霉素[5]、用有機物(硝普納)處理[6]、用硅處理[7]、加入AMF[8]處理等。關(guān)于AMF對干旱脅迫下植物生理生化的影響近年已有一些相關(guān)報道。張偉珍等[9]發(fā)現(xiàn)，AMF可以通過提高植物的可溶性糖、可溶性蛋白等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累，從而提高細胞液濃度、降低細胞滲透勢、防止細胞脫水、細胞水勢降低，與外界形成較高的水勢差，提高細胞吸水或保水能力[10]。AMF能與柑橘(Citrusreticulatablanco)形成共生體，其抗旱性高于未接種AMF的柑橘[11]。秦子嫻等[12]研究發(fā)現(xiàn)，接種了AMF的玉米(ZeamaysL.)在土壤有效磷含量較高時可提高玉米的抗旱性，提高了SOD，POD相對活性，降低MDA的含量。綜上所述，AMF與植物體共生可以促進宿主植物對水分的吸收與利用，促進植物光合作用，從而提高植物對干旱脅迫的抵抗能力。

鵝絨委陵菜，又名蕨麻，薔薇科(Rosaceae)委陵菜屬(Potentilla)多年生草本植物，是一種匍匐莖型蓮座狀植物，具有較高觀賞價值。鵝絨委陵菜較耐粗放管理、高度適應(yīng)不良環(huán)境、維護成本較低、分布范圍廣[13]。在國外對鵝絨委陵菜的研究主要是藥理作用和無性繁殖，我國對鵝絨委陵菜的研究多集中在引種馴化[14]、重金屬脅迫[15]、組織培養(yǎng)[16]、藥理作用[17]等方面，鵝絨委陵菜在園林中常用作北方干旱地帶的草坪草，而有關(guān)鵝絨委陵菜-AMF共生體應(yīng)答干旱逆境的機制未見報道。本研究通過自然控水方法，對接種AMF的委陵菜響應(yīng)干旱脅迫的生理特性進行測定分析，旨在揭示鵝絨委陵菜的耐旱機制及其在干旱地區(qū)的園林應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

在東北林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院苗圃培養(yǎng)鵝絨委陵菜幼苗，待株高為4～5 cm時收割取回。從北京市農(nóng)林科學(xué)院購回根內(nèi)根生囊霉接種物，包含有菌根片段、真菌菌絲和孢子等，孢子量約為18 個·g-1。泥炭土、珍珠巖、蛭石、腐殖土等購自黑龍江省哈爾濱市花卉市場。

1.2 試驗方法

1.2.1試驗設(shè)計 選取生長一致、發(fā)育正常的鵝絨委陵菜幼苗，用清水培養(yǎng)3～5 d。

AMF接種處理：將所購基質(zhì)泥炭土、珍珠巖和蛭石按3∶1∶1比例混合拌勻后置于高壓滅菌鍋中，120℃，240 KPa滅菌處理3 h。將經(jīng)過高溫高壓滅菌處理的基質(zhì)土置于口徑為18 cm的花盆中，精確稱取根內(nèi)根生囊霉接種物25 g均勻置于處理組2 cm表層基質(zhì)。

將鵝絨委陵菜幼苗隨機等分為兩組：對照組(CK)和處理組(T)，CK栽植在未接種根內(nèi)根生囊霉的滅菌土壤中，T栽植在接種根內(nèi)根生囊霉的滅菌土壤。每隔3 d澆一次水正常養(yǎng)護，80 d后測定鵝絨委陵菜菌根侵染率，讓侵染后的植株及CK自然失水(CK組與T組連續(xù)12 d不澆水)，讓其自然干旱，在干旱脅迫0 d，3 d，6 d，9 d，12 d時兩組分別取樣并測定其相應(yīng)生理指標。

1.2.2菌根侵染率的測定 從基質(zhì)中挖出鵝絨委陵菜后，用清水輕輕沖洗根部，將根部附帶的雜質(zhì)等沖洗干凈至根部呈黃白色，注意控制水流速度和人為操作手法，以免破壞根系。根系清洗干凈后，取新鮮根樣，準確剪取1 cm不同粗細的根段保存FAA固定液(70%酒精：17.5 mol·L-1冰醋酸：38%甲醛=18∶1∶1)中，標記后可放入4℃冰箱內(nèi)進行密封保存。

剪取接種根內(nèi)根生囊霉的鵝絨委陵菜100個根段，用10%氫氧化鉀溶液在90℃水浴鍋消解60 min至透明狀，用蒸餾水清洗兩遍，再用2%的鹽酸酸化至少30 min后用蒸餾水清洗兩遍，用H2O2和蒸餾水再各清洗兩遍，用堿解離-Trypan blue色法[18]進行染色，乳酸甘油溶液進行脫色處理后制片，用根段觀測法和網(wǎng)格十字交叉法進行觀察，按照《菌根學(xué)》[19]測定菌根侵染率。

1.2.3生理指標的測定 以鵝絨委陵菜葉片為試驗材料，通過利用硫代巴比妥酸測定法測定MDA質(zhì)量摩爾濃度；利用氮藍四唑法測定SOD活性；利用愈創(chuàng)木酚方法測定POD活性；通過考馬斯亮藍G-250染色法測定可溶性蛋白含量[20]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

通過利用MYCOCALC.EXE軟件計算菌根侵染率。利用SPSS軟件對侵染率生理指標進行Duncans單因素方差多重比較分析，差異顯著水平為0.05。利用Microsoft Excel軟件對鵝絨委陵菜在AMF侵染后的生理指標進行數(shù)據(jù)分析與處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 鵝絨委陵菜根與菌根共生的結(jié)構(gòu)特征

經(jīng)查閱文獻[21-22]鑒定鵝絨委陵菜與菌根共生的叢枝結(jié)構(gòu)為重樓型(Paris type，簡寫為P型)叢枝結(jié)構(gòu)。由圖1所示，根內(nèi)根生囊霉的菌絲沿著植物根系表面生長并形成多處分支、多個入侵點(圖1a-1e)。菌絲根據(jù)結(jié)構(gòu)不同可分為有隔菌絲(圖1a)和無隔菌絲(圖1d)；菌絲彎曲纏繞自由生長，可擴展為胞間菌絲(圖1c)和胞內(nèi)菌絲(圖1e)；而根內(nèi)根生囊霉的菌絲體以二叉分支方式生長，得到二叉狀菌絲H(圖1e)，連續(xù)以二叉分支方式生長，可形成樹狀結(jié)構(gòu)。根內(nèi)根生囊霉存在有大量泡囊(圖1d-1i)，且在相對較老的根中有較多的孢囊(圖1i)；泡囊形態(tài)多為橢圓形，也有圓形、異形、不規(guī)則形等(圖1f-1i)；根內(nèi)根生囊霉菌絲體侵染植物根外層細胞后會導(dǎo)致被侵染植物根系表面有明顯的隆起，影響鵝絨委陵菜的根活力水平(即根系代謝水平)，從而影響整個植物的生命活動強度。

圖1 鵝絨委陵菜AMF菌根顯微結(jié)構(gòu)Fig.1 Microstructure of AM mycorrhiza in Potentilla anserina注：(a)有隔菌絲H;(b)菌絲侵入點H;(c)已消解成斑點狀叢枝A及有隔菌絲H;(d)無隔菌絲H及泡囊V;(e)二叉狀菌絲H及頂端膨大成泡囊V;(f)異形泡囊V;(g)不規(guī)則泡囊V;(h)圓形泡囊V;(i)不規(guī)則泡囊VNote:(a)Septate hyphae H;(b)Hyphal invasion point H;(c) Been digested into Arbuscular and septate hyphae H;(d) Hyphae H and vesicles without septum;(e) Bifurcate hyphae H and apical expanded V;(f) Heterocyst V;(g) Irregular vesicle V;(h) Round vesicle V;(i) Irregular vesicle V

2.2 鵝絨委陵菜根圍AMF侵染狀況

由表1可知，菌根類型均為P型。在干旱脅迫天數(shù)為0 d、不接菌的對照處理中，未發(fā)現(xiàn)有菌根真菌的侵染，即侵染率為0；在干旱脅迫天數(shù)為0 d、接種根內(nèi)根生囊霉的鵝絨委陵菜菌根侵染率極高，達到91.07%；對于處理組，隨著干旱脅迫程度逐漸增加，根系的菌根侵染率表現(xiàn)為下降，表明干旱會影響土壤中AMF的正常生長。

表1 干旱脅迫下AMF對鵝絨委陵菜菌根侵染率的影響Table 1 Effects of AM fungi on mycorrhizal infection rate of Potentilla anserina under drought stress

2.3 AM真菌對干旱脅迫下鵝絨委陵菜生理特性的影響

2.3.1AM真菌對干旱脅迫下鵝絨委陵菜丙二醛含量的影響 由圖2可知，CK的鵝絨委陵菜在干旱脅迫第9 d時，MDA的含量最高，高達25.41 μmol·g-1；而T在干旱脅迫9 d時MDA的含量顯著低于CK(P<0.05)，降低了15.89%；在干旱脅迫第12 d時，T的MDA含量也低于CK;由此可見，AMF會減輕細胞受到損傷的程度。

圖2 AMF對干旱脅迫下鵝絨委陵菜MDA的影響Fig.2 Effects of AM fungi on MDA tolerance of Potentilla anserina under drought stress

2.3.2AM真菌對干旱脅迫下鵝絨委陵菜酶活性的影響 由圖3可知，SOD的活性隨著干旱處理時間的延長呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。CK和T的SOD活性在第9 d時達到最大值，分別為14.65 U·g-1和19.36 U·g-1，和其他脅迫時間相比差異顯著(P<0.05)；且T的SOD的活性始終高于CK，說明接菌后顯著提高了植株體內(nèi)的SOD活性水平，比CK更有效地清除體內(nèi)活性氧，進而保護自身細胞免受損害。

圖3 AMF對干旱脅迫下鵝絨委陵菜SOD的影響Fig.3 Effect of AM fungi on SOD of Potentilla anserina under drought stress

由圖4所示，POD的活性隨著干旱脅迫時間的增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。CK和T的POD活性在第9 d時達到最大值，分別達到791 U·g-1和1 029 U·g-1，T的POD的活性比CK高30.00%，和其他脅迫時間相比差異顯著(P<0.05)；且T的POD的活性始終高于CK，說明接菌后減輕了氧化物對鵝絨委陵菜的傷害，從而降低了干旱脅迫對鵝絨委陵菜的傷害程度。

圖4 AMF對干旱脅迫下鵝絨委陵菜POD的影響Fig.4 Effect of AM fungi on POD tolerance of Potentilla anserina under drought stress

2.3.3AM真菌對鵝絨委陵菜耐受干旱脅迫可溶性蛋白的影響 由圖5所示，干旱脅迫初期(前3 d)，可溶性蛋白含量變化不明顯；在干旱脅迫第6 d時，CK和T的可溶性蛋白含量明顯提高并達到最大值，分別達到2.21 mg·g-1和2.47 mg·g-1；而CK在脅迫12 d時可溶性蛋白含量顯著低于T(P<0.05)，降低了34.59%；由此可見，AMF能夠加強鵝絨委陵菜細胞的保水能力，對其起到保護作用。

圖5 AMF對干旱脅迫下鵝絨委陵菜可溶性蛋白含量的影響Fig.5 Effects of AM fungi on soluble proteins of Potentilla anserina under drought stress

3 討論

3.1 干旱脅迫下接種AM真菌的菌根侵染率

根系是植物的重要器官，吸收水分和礦物質(zhì)養(yǎng)分，穩(wěn)固和儲存同化物[23]，植物對養(yǎng)分吸收效率與根系構(gòu)型有關(guān)[24]。本試驗通過對鵝絨委陵菜接種根內(nèi)根生囊霉，發(fā)現(xiàn)接種根內(nèi)根生囊霉的鵝絨委陵菜菌根侵染率達91.07%，侵染率高，易與鵝絨委陵菜形成共生關(guān)系。這與吳強盛等[25]研究認為接種AMF可對白三葉(TrifoliumrepensL.)根系構(gòu)型及參數(shù)起促進效應(yīng)與本文研究結(jié)果基本一致。

3.2 AM真菌對干旱脅迫下鵝絨委陵菜生理特性的影響

MDA是細胞膜脂過氧化產(chǎn)物之一，植物體內(nèi)MDA含量的高低在一定程度上反映了脂膜過氧化作用水平和膜結(jié)構(gòu)的受害程度[26]，以及植物的抗逆性強弱，其中MDA含量越高則植物氧化程度越高，即細胞所受損害程度越大。在本試驗中，隨著干旱脅迫程度的增加，鵝絨委陵菜體內(nèi)的MDA含量呈上升趨勢，這與張玉曼等[27]的研究中發(fā)現(xiàn)所受脅迫程度越深的狗尾草其體內(nèi)MDA含量越高一致。且T的MDA含量始終低于CK，即AMF能夠阻礙干旱脅迫對鵝絨委陵菜植株的傷害，從而增強植株的抗旱性。

SOD和POD是普遍存在于植物體內(nèi)、極為重要的抗氧化酶，防止逆境產(chǎn)生的自由基對細胞膜產(chǎn)生不利影響[28]。研究表明，SOD和POD活性與生物機體的免疫水平密切相關(guān)[29]，體內(nèi)SOD，POD活性較高的植物抗逆性較強[30]。隨著干旱強度的增加，CK和T的SOD，POD的活性均增加；在植株受到干旱脅迫時，體內(nèi)活性氧數(shù)量會增加，說明鵝絨委陵菜會對干旱脅迫做出應(yīng)答反應(yīng)；但當植株所受逆境脅迫超過承受能力時，會損傷細胞。在干旱中期和后期(6～12 d)，T的酶活性始終高于CK，說明接菌后能夠增加SOD，POD活性，即降低了干旱脅迫對鵝絨委陵菜的傷害程度，保護了自身細胞。

可溶性蛋白為重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和營養(yǎng)物質(zhì)，它們的增加和積累能提高細胞的保水能力，對細胞的生命物質(zhì)及生物膜起到保護作用，即可溶性蛋白的含量是判斷植物抗旱性的重要指標之一[31]。隨著干旱脅迫強度的增加，CK和T的可溶性蛋白的含量均降低。在高強度干旱脅迫下，植物生物膜脂氧化加劇，破壞了細胞膜結(jié)構(gòu)的完整性[32]。而在CK和T的干旱脅迫中期和后期(6～12 d)，T的可溶性蛋白含量顯著高于CK，這與羅方舟等[33]的研究發(fā)現(xiàn)可溶性蛋白質(zhì)在一定程度的干旱脅迫下，通過參與植物體內(nèi)的滲透調(diào)節(jié)以抵御干旱脅迫一致。這說明AMF能夠提高鵝絨委陵菜細胞的持水性，從而提高了植物的抗旱性。此與趙匠等[34]發(fā)現(xiàn)AM真菌在鹽脅迫下能通過促進黃檗(PhellodendronamurenseRupr.)可溶性蛋白分泌提高黃檗抗逆性的研究結(jié)果一致。

4 結(jié)論

綜上所述，鵝絨委陵菜接種AMF后，AMF能夠侵染鵝絨委陵菜根系并與鵝絨委陵菜建立良好的共生關(guān)系；在干旱脅迫下，接種AMF的鵝絨委陵菜能夠有效的降低MDA含量、增強SOD和POD活性并增加可溶性蛋白的含量。以上生理指標的變化體現(xiàn)了AMF在一定程度上能夠增強鵝絨委陵菜的抗旱能力，有效減緩了干旱脅迫對鵝絨委陵菜所造成的傷害。鵝絨委陵菜在干旱脅迫下，能夠利用接種AMF提高其抗旱性。